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人DNA聚合酶β基因靶向RNA干扰重组子克隆及序列分析
目的克隆用于人DNA聚合酶β(DNA polymerase beta,Polβ)基因靶向RNA干扰的双链RNA(double strand RNA,dsRNA)寡核苷酸绿色荧光蛋白C1载体重组子"pEGFP-C1-pU6-dsRNA",为进一步研究人Polβ基因在环境化学污染物所致的DNA损伤修复中的作用机制作准备.方法依据Genbank中人polβ基因的cDNA序列,运用dsRNA oligonucleotide designer设计出用于RNA干扰用的dsRNA寡核苷酸序列,并以化学方法合成之.通过重组DNA技术将合成好的dsRNA克隆到含人pU6启动子的pSIREN-RetroQ逆转录病毒载体上,以此重组子转化感受态E.coli DH5α,经氨卞青霉素筛选后进行扩增,并抽提质粒.运用EcoR Ⅰ和BglⅡ消化并回收"pU6-dsRNA"目的片段,再将"pU6-dsRNA"亚克隆到pEGFP-C1上,获"pEGFP-C1-pU6-dsRNA"重组子,并进行酶切鉴定和序列分析.结果经酶切鉴定发现,"pEGFP-C1-pU6-dsRNA"载体重组子处于预期条带位置,序列分析显示与所设计的目的片段序列完全相符.结论作者克隆了用于人Polβ基因靶向RNA干扰的dsRNA绿色荧光蛋白C1载体重组子"pEGFP-C1-pU6-dsRNA",为进一步研究Polβ基因功能作好了准备.
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乙型肝炎表面抗原颗粒在毕赤酵母中的表达
毕赤酵母表达系统是一个高效异源蛋白表达工具,表达载体直接整合到酵母基因组上,可以产生遗传稳定的重组子,有类似于哺乳动物翻译后加工修饰的功能,可在成本低廉的无机盐培养基中进行高密度培养生产重组蛋白[1,2].为提高重组菌株表达的稳定性,本研究选用毕赤酵母表达系统,成功地表达了22 nm HBsAg颗粒,为在毕赤酵母中开发生产乙肝疫苗提供了资料.
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Clostridium difficile细胞毒素B羧基末端功能区的克隆与表达
目的:克隆并表达Clostridium diifficile(C difficile)细胞毒素B羧基末端功能区基因,为探索高效的防治C difficile感染的疫苗和诊断抗原奠定基础.方法:提取C difficile染色体基因,用PCR方法扩增ToxinB3基因,将其克隆至表达载体PET22b(+),用重组质粒转化大肠杆菌[E.coli BL21(DE3)],并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.用 SDS-PAGE方法对表达产物进行分析.结果:从C difficile基因组DNA中成功地克隆了毒素B的羧基末端重复区域的1848 bp基因,经过双酶切、PCR和测序鉴定分析,插入到载体的基因与GenBank中公布的C difficile VPI10463的ToxinB3基因序列的同源性为99%.SDS-PAGE显示,目的基因表达产物的分子质量为71.3 ku,利用表达载体PET22b(+)表达出蛋白质,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34.8%.结论:含C difficile Toxin B3基因的PET22b(+)重组质粒能高效表达目的基因.该重组子的构建为Clostridium diffiicile相关性疾病的诊断及后期制备疫苗,提供了有力的保障.
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双功能融合基因在肝癌细胞中的表达与作用
目的:构建含有融合基因FCUl的自杀基因系统,观察其对体外培养肝癌细胞的杀伤效应.方法:将FCUl基因亚克隆于pEGFP-C1载体,转化大肠杆菌DH5α,阳性重组子转染肝癌细胞HepG2,绿色荧光蛋白检测FCUl的表达,用G418筛选出阳性细胞克隆后,进行体外药物敏感实验,观察旁观者效应.结果:FCUl基因正确插入到pEGFP-C1中,pEGFP-FCUl转染成功的细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光,在5-FC作用下细胞的生长抑制率明显高于未转染细胞,且旁观者效应显著.结论:本基因治疗体系具有很好的体外杀肿瘤效果,为肝癌的基因治疗提供了一个新的选择.
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KAI1正反义基因对MHCC97-H肝癌细胞KAI1蛋白表达的影响
目的:构建KAI1基因正、反义真核表达质粒,了解其对高转移潜能的MHCC97-H肝癌细胞KAI1蛋白表达的影响.方法:利用亚克隆技术构建KAI1基因正、反义真核表达质粒,并用脂质体法将其分别转入高转移潜能的MHCC97-H肝癌细胞系,通过免疫细胞化学SP法检测KAI1蛋白表达情况.结果:限制性内切酶分析证明两个重组子的结构均与KAI1正、反义基因表达质粒的预期结构一致.免疫细胞化学SP法检测显示,转入正义KAI1基因后的肝癌细胞KAI1蛋白染色加深,(细胞积分光密度integra oculus dehter,IOD20.127±5.099 vs12.675±1.921,P<0.01);而转入反义KAI1基因的肝癌细胞则KAI1蛋白染色变浅,(IOD 8.681±2.472 vs 12.675±1.921,P<0.01).结论:成功构建了KAI1基因正、反义真核表达质粒.KAI1正义基因能上调肝癌细胞KAI1蛋白的表达,相反,KAI1反义基因则能下调肝癌细胞KAI1蛋白的表达.
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表达人源SOD的毕赤酵母重组子的构建
目的 研究在毕赤酵母重组子中高表达有活性人源超氧化物歧化酶(SOD)方法.方法 在毕赤酵母构建表达重组人源SOD,对培养时间、培养基中铜离子浓度和甲醇诱导条件进行优化,并初步纯化SOD.结果 获得了5个稳定表达人源SOD的毕赤酵母重组子.色谱层析方法分离纯化重组子培养上清中的SOD.在培养48 h,培养基中铜离子浓度0.5%、甲醇诱导浓度1%时上清中SOD分泌量多,同时活力好.结论 建立毕赤酵母表达可溶性人源SOD的有效方法,实现了在毕赤酵母系统高效表达有活性人源SOD.为发酵生产人源SOD提供了研究基础.
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人转化生长因子-β1基因克隆、测序及真核表达载体的构建
目的 克隆人转化生长因子-β1(TGF-β1)基因编码区cDNA序列,构建并鉴定TGF-β1真核表达载体.方法 设计含有EcoRⅠ和XholⅠ酶切位点的TGF-β1cDNA引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,以人白细胞mRNA为模版,扩增TGF-猹1基因,纯化PCR产物,TA克隆,双酶切与pcDNA3质粒表达载体连接,转化感受态大肠杆菌JM109,酶切鉴定阳性重组子,并进行序列测定.结果 琼脂糖凝胶电泳显示,用双酶切后形成分子量1.2kb的条带,符合物理图谱,表明表达载体构建成功,序列测定结果与预测结果完全一致.结论 成功克隆了TGF-猹1基因,并成功地构建了真核表达载体pcDNA3-TGF-β1.
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质粒DNA的快速提取及其在重组子大量筛选中的应用
[目的]介绍一种质粒DNA的快速提取方法及其在重组子大量筛选中的应用. [方法]利用微量碱变性一步法快速提取质粒DNA. [结果]应用该法能在大量的重组菌株中筛选出所需的重组质粒. [结论]本法便捷、经济,适合于在大量DNA文库中筛选出所需目的基因.
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一种提高PCR产物亚克隆效率的方法
利用PCR扩增目的基因是常用的一种克隆方法,但在实际操作中,试剂盒中Taq DNA聚合酶在经过各种纯化方法(如酚氯仿抽提,乙醇沉淀,电泳和柱纯化)后,仍附着在扩增产物的5'端,有效地阻止随后的内切酶酶切过程,导致重组的失败。作者采用一种可以显著提高PCR产物克隆的效率的方法,即将10 μl蛋白酶K混合物[蛋白酶K混合物的配制:0.1 mol/LTris-HCl (pH8.0)、5%SDS,0.5 mg/ml蛋白酶K)加入100 μl PCR反应后的产物中,37 ℃水浴1 h后,68 ℃ 15 min以灭活蛋白酶K,用酚-氯仿、氯仿各抽提1次,无水乙醇沉淀,70%乙醇清洗后晾干,并用双蒸水溶解。采用这种方法得到了PCR产物与相应酶切载体连接,可以顺利得到大量的重组子,与常规方法比较大大地提高了克隆的效率。
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XRCC1基因RNA干扰重组子克隆及序列分析
[目的]构建XRCC1基因的发卡样siRNA(small interfere RNA)真核表达载体,为建立XRCC1缺陷的细胞株,及进一步研究XRCC1的功能奠定基础. [方法]根据GenBank提供的XRCC1基因cDNA序列及软件构建发卡样XRCC1基因siRNA逆转录病毒载体;选择酶切位点,将包括U6启动子和siRNA序列的片段切下,并亚克隆至入CMV当动子指导的pEGFP-C1荧光蛋白表达载体,构建XRCC1基因siRNA绿色荧光蛋白真核表达载体,构建载体通过荧光测序鉴定. [结果]通过分子克隆和琼脂糖凝胶电泳鉴定,成功构建了发卡样XRCC1基因siRNA逆转录病毒载体;经过亚克隆和琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定成功获得pEGFP-C1-XRCC1 siRNA真核表达载体. [结论]成功构建pEGFP-C1-XRCC1 siRNA真核表达载体,为建立XRCC1蛋白缺陷细胞株提供材料.
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利用RTS500系统进行抗菌肽葛佬素蛋白的体外表达
目的:构建含目的基因葛佬素(Gloverin)的重组子并通过体外快速翻译系统RTS500(Rapid Translation System)对其进行表达.方法:采用PCR方法扩增gloverin cDNA,将其与表达载体pIVEX2.3连接;采用PCR及双酶切方法鉴定连接产物.将含目的基因片段的阳性重组质粒通过体外表达翻译系统RTS500,使其蛋白能在大肠杆菌(E. coli)裂解产物中进行表达.