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泛素C-末端水解酶-L3在小鼠腹水型肝癌高、低淋巴道转移株中的表达
肿瘤转移机制及防治已成为当今肿瘤研究领域的热点.高淋巴道转移力小鼠腹水型肝癌细胞(Hca-F)、低淋巴道转移力小鼠腹水型肝癌细胞(Hca-P)是由大连医科大学病理教研室自行建立的肿瘤转移机制实验模型.它们是一对高度同源的来自同一小鼠肝癌细胞克隆的不同亚克隆,经615小鼠局部皮下注射后,特异地向引流淋巴结转移.
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HCV准种的结构蛋白在真核表达系统中的表达
本实验从1份HCV持续性感染者血标本中随机筛选的8个C/E1/E2克隆序列亚克隆入真核表达载体pCI-neo,并转染大肠杆菌DH5α,经氨苄青霉筛选、酶切鉴定及DNA测序,构建为插入C/E1/E2的重组质粒.将1μg重组质粒、0.36 mCi/ml H3-亮氨酸加入TNT/T7 Couple Reticulocyte Lysate Systems (含有25μl TNT Lysate、4U T7 RNA聚合酶、20μmol/L不含亮氨酸的氨基酸混合物、40U RNA酶抑制剂),总反应体积50μl.取5μl反应液进行12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,抽干凝胶,-70℃放射自显影3 d.
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细菌内同源重组法构建HBV S区和C区基因非复制型腺病毒载体及其体外表达
目的:构建表达乙肝病毒表面抗原(HB sAg)和e抗原(HBeAg)的非复制型重组腺病毒载体,并检测他能否在真核细胞中有效表达目的基因.方法:扩增乙肝病毒(HBV)前S2/S基因和前C/C基因片段,分别亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生分别携带HBV S区和C区基因的重组腺病毒载体pAd-HBs和pAd-HBe,经脂质体法转化293细胞包装产生重组腺病毒Ad-HBs和Ad-HBe;体外转染293和Vero细胞,RT-PCR和ELISA法检测目的基因的表达.结果:构建了表达HBsAg和HBeAg基因的重组腺病毒,病毒滴度可达5x1012pfu/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因.结论:成功构建表达HBsAg和HBeAg的重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础.
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KAI1正反义基因对MHCC97-H肝癌细胞KAI1蛋白表达的影响
目的:构建KAI1基因正、反义真核表达质粒,了解其对高转移潜能的MHCC97-H肝癌细胞KAI1蛋白表达的影响.方法:利用亚克隆技术构建KAI1基因正、反义真核表达质粒,并用脂质体法将其分别转入高转移潜能的MHCC97-H肝癌细胞系,通过免疫细胞化学SP法检测KAI1蛋白表达情况.结果:限制性内切酶分析证明两个重组子的结构均与KAI1正、反义基因表达质粒的预期结构一致.免疫细胞化学SP法检测显示,转入正义KAI1基因后的肝癌细胞KAI1蛋白染色加深,(细胞积分光密度integra oculus dehter,IOD20.127±5.099 vs12.675±1.921,P＜0.01);而转入反义KAI1基因的肝癌细胞则KAI1蛋白染色变浅,(IOD 8.681±2.472 vs 12.675±1.921,P＜0.01).结论:成功构建了KAI1基因正、反义真核表达质粒.KAI1正义基因能上调肝癌细胞KAI1蛋白的表达,相反,KAI1反义基因则能下调肝癌细胞KAI1蛋白的表达.
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小鼠甲胎蛋白基因的克隆真核表达载体构建及表达鉴定
目的:克隆小鼠甲胎蛋白(AFP)基因,构建小鼠AFP真核表达载体并进行表达鉴定.方法:从Hepal-6细胞中提取总RNA进行RT-PCR,克隆出小鼠AFP基因,亚克隆于pcDNA3.1载体,重组阳性克隆进行酶切和测序鉴定.重组质粒瞬时转染CHO-K1细胞,Western blot检测小鼠AFP的表达.结果:利用RT-PCR从Hepal-6细胞总RNA中成功克隆出1.8kb的小鼠AFP基因,重组阳性克隆经酶切和测序鉴定证实目的基因已正确插入pcDNA3.1载体中,Western blot结果证实重组质粒pmAFP能够在CHO-K1细胞中正确表达.结论:小鼠AFP真核表达载体构建成功,为进一步研究其在肝癌免疫治疗中的作用奠定了基础.
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携带幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白活减毒鼠伤寒沙门菌口服重组DNA疫苗株的构建
目的:构建携带人幽门螺杆菌(Hpylori)中性粒细胞激活蛋白HP-NAP)基因(napA)的重组活减毒鼠伤寒沙门菌口服DNA疫苗.方法:应用基因工程技术扩增全长napA,测序并同源性分析后,将其亚克隆入真核表达载体pIRES,鉴定正确后将重组质粒转化活减毒鼠伤寒沙门菌.结果:重组质粒经PCR及双酶切,证实成功构建了携带HP-NAP基因的重组真核表达质粒pIRES-napA,后者成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL7207.所克隆435bp napA与GenBank中SS1-napA核苷酸和蛋白质的同源性均为98%.结论:成功构建并鉴定了携带HP-NAP基因的重组活减毒鼠伤寒沙门菌口服DNA疫苗,为多价抗Hpylori口服DNA疫苗的研制奠定了基础.
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子宫颈癌组织中热休克蛋白90α mRNA表达的研究
近年来,对热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)基因的生物学作用研究发现,其表达量的变化与肿瘤的发生关系密切.其中,HSP90α基因在不同病理分化程度的肿瘤组织和肿瘤细胞中呈选择性高表达[1].我们也曾经观察到HSP90基因在两株克隆形成率不同的子宫颈癌亚克隆细胞株中的表达有明显差异[2].为了探明HSP90α基因在人子宫颈癌发生、发展中的作用,我们用RT-PCR方法检测宫颈癌组织中HSP90α mRNA的表达.现将结果报道如下.
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高转移性人乳腺癌细胞亚克隆的筛选
目的 筛选高转移潜能的人乳腺癌细胞亚克隆,为人类乳腺癌转移相关的体内外研究提供实验对象.方法 通过有限稀释法分离和培养人乳腺癌细胞MDAMB-435S的单克隆;采用细胞生物学方法体外评价亚克隆的克隆形成、增殖、运动和侵袭能力;将MDA-MB-435S亚克隆细胞通过乳腺脂肪垫接种于免疫双缺陷SCID鼠,验证体外筛选克隆的体内转移能力.定量资料采用独立样本t检验进行统计学分析.结果 筛选得到MDA-MB-435S的高转移亚克隆14-E5;14-E5与亲代细胞呈梭形、伪足较长的细胞形态明显不同,体积比亲代细胞小,呈多边形,触角增多;细胞的体外克隆形成能力、运动能力、侵袭能力及体内自发转移能力均较亲代显著增强(P<0.050);细胞周期S期和G2/M期比例比亲代减少,增殖能力较亲代降低(t=7.047,P=0.002);细胞异质黏附能力、体内成瘤率与亲代之间的差异无统计学意义(P>0.050).结论 筛选并建立了高转移潜能人乳腺癌细胞亚克隆细胞株14-E5,可以用于乳腺癌转移基因筛选、转移机制研究、抗转移药物的研发和评价抗转移实验性治疗疗效.
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含变链菌PAc蛋白编码基因保守区重组质粒pCIA-P的亚克隆构建
人类致龋菌变形链球菌(S.mutans)的一种表面蛋白PAc,由于参与介导细菌对牙面的粘附而被视作S.mutans的重要毒力因子,因此成为研制防龋疫苗的主要备选抗原.我们选择pac基因中编码PAc主要免疫活性区域的DNA序列, 制备出待表达DNA片段, 经亚克隆至pGEM-T质粒后,再克隆到高效哺乳动物表达质粒pCI中构建成含pac基因重要抗原决定簇编码区域的重组质粒,从而为防龋DNA疫苗的免疫实验研究完成了重要准备.
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一种不配对粘末端连接的新策略
整合素是粘附分子的一个家族，是由α和β亚基通过非共价键连接而形成的一类异二聚体，目前已发现20多种［1］。α4β7就是其中一种，它的主要功能是通过与配体粘膜地址素细胞粘附分子-1(mucosal addressin cell adhesion molecule-1，MAdCAM-1)的相互作用而介导淋巴细胞在粘膜部位的归巢和定居，并参与该部位的免疫应答。抗β7的单抗（mAb）可有效阻断α4β7介导的多种功能，已成功用于多种研究。我们将编码β7亚基主要抗原表位的1.8 kb cDNA片段［2］，亚克隆入原核融合表达载体pGEX-3X，以期获取β7的原核表达产物、制备抗体及进行相应功能研究。由于载体与外源片段之间无合适的酶切位点，因此首先利用BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ位点，连接表达载体pGEX-3X和克隆载体pGEM-7Z，从而得以在pGEX-3X中引入SphⅠ位点，再利用BamH Ⅰ/SphⅠ位点，完成目的片段的亚克隆。该过程通过载体之间的连接，引入合适的酶切位点，巧妙地变不配对粘末端的连接为配对粘末端的连接，高效快速地完成了目的片段的亚克隆，不失为一种解决不配对粘末端连接的新策略，可为类似研究提供借鉴。 1 材料与方法1.1 菌株和质粒 大肠杆菌JM109、原核融合表达载体pGEX-3X、克隆载体pGEM-7Z，由本室保存。质粒pBS-β7（带有β7的全长cDNA），由David J. Erle博士惠赠［3］。1.2 限制性内切酶及连接酶 限制性内切酶EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ，SphⅠ购自华美公司，T4 DNA连接酶购自大连六和通公司。1.3 p3X-1.8β7重组质粒的构建 首先，分别对表达载体pGEX-3X和克隆载体pGEM-7Z进行BamHⅠ/EcoR Ⅰ双酶切，再将二者连接，构建成重组质粒p3X-7Z。然后用BamHⅠ/SphⅠ处理带有β7全长cDNA的pBS-β7载体，回收1.8 kb目的片段，与做同样处理的p3X-7Z载体连接，即得到重组表达质粒p3X-1.8β7（图1）。 2 结果2.1 按图1所示构建重组质粒p3X-7Z，BamHⅠ/SphⅠ酶切鉴定，分别在3.0 kb和5.0 kb出现特异条带（图2），与设计相符，证明p3X-7Z重组质粒构建成功。2.2 按图1所示构建重组质粒p3X-1.8β7，BamH Ⅰ/SphⅠ酶切鉴定，分别在1.8 kb和5.0 kb出现特异条带（图3），与设计相符，证明p3X-1.8β7重组表达质粒构建成功。
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pREP8和pREP4质粒对HEK293细胞β2-肾上腺素受体的表达及其介导cAMP蓄积的影响
以质粒携带某一亚型受体的cDNA转染细胞株,通过亚细胞克隆得到稳定表达某亚型受体的亚克隆细胞株,是肾上腺素受体(AR)研究中常用的方法.我们近的研究发现,α1A-、α1B-和α1D-AR全长cDNA分别由pREP8、pREP4和pREP9质粒携带 (pREP8/α1A 、pREP4/α1B、pREP9/α1D),转入人胚肾(HEK293)细胞并稳定表达后,均显著增加原先细胞天然β2-AR的表达量及其介导的cAMP蓄积大效应.本研究拟排除上述作用是由于携带外源cDNA的质粒本身带来的影响,而非转入α1-AR的影响.
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应用改良差速贴壁法和有限稀释技术分离培养小鼠来源肌源干细胞
背景:研究者们通过多种方法从肌组织中分离得到肌源干细胞,并应用于各类组织工程和再生医学研究.目的:结合改良的差速贴壁法和有限稀释技术分离小鼠来源肌源干细胞,并培养其单细胞克隆和亚克隆集落.方法:以新生C57BL/6小鼠四肢作为肌组织取材对象,经三重酶消化和细胞筛过滤,运用改良的差速贴壁法分离出肌源干细胞,予细胞特异标记物以免疫组织化学染色;以有限稀释技术克隆培养的方法,获得稳定的肌源干细胞单克隆和亚克隆集落.结果与结论:差速贴壁培养过程中,肌性细胞占比逐渐增高,首次贴壁1 h可以获得足够数量的细胞进行第6次贴壁培养;肌源干细胞需72 h左右贴壁生长,经10 d左右可以增殖为300~500细胞数量的集落,细胞形态以小圆形细胞为主,并有少量梭形细胞,肌源干细胞能够维持形态并持续增殖;应用有限稀释技术可获得肌源干细胞单克隆和亚克隆集落,肌源干细胞克隆细胞均呈现Desmin染色阳性,Sca-1染色阳性,阳性率为(92.3±4.1)%.提示应用preplate法和有限稀释技术可以分离得到小鼠来源肌源干细胞及其克隆集落.
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人GnRH及其转运肽基因合成及鉴定
目的人工合成人GnRH及转运肽(TRS)基因.方法根据已发表的人GnRH基因mRNA序列以及转运肽(9个左旋精氨酸)基因核苷酸序列,设计一对核苷酸,再用含7 mol/L尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,然后以这对核苷酸3′末端短互补序列退火、补齐,合成长达90 bp的目的序列GnRH/TRS.将其亚克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pYC1.酶切鉴定筛选出阳性克隆pYC1,并测序.结果 GnRH/TRS序列由90个核苷酸组成,扩增产物与原设计序列同源性达100%.结论已成功合成人GnRH/TRS基因,为进一步研究和应用奠定基础.
关键词： 促性腺激素释放激素(GnRH) 转运肽 基因合成 亚克隆 -
HBV X区基因部分序列的亚克隆与PCR检测
目的:探讨HBV X区基因用于乙型病毒性肝炎早期诊断价值和意义.方法:设计特异性引物,将pBR322-HBV质粒X区部分序列PCR 产物AT亚克隆至pBS-T载体,提取和纯化质粒DNA,再对HBV X区序列进行PCR扩增.结果:获得了预期希望的质粒.PCR的佳退火温度为51 ℃,灵敏度达到101拷贝/2μl,线性范围101-1010拷贝/2μl.讨论:pBR322-HBV 质粒中的靶基因成功地被亚克隆至pBS-T载体.pBR322-HBV中X区目的序列扩增产物为57bp,该小片段勿需纯化就可直接AT亚克隆至新载体,有利于后续的常规PCR检测和TaqMan MGB荧光定量PCR检测.
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流感病毒RNA聚合酶PB1-1亚基片段的克隆及表达
目的将流感病毒RNA聚合酶合酶PB1-1亚基进行亚克隆、表达,获得重组的亚克隆多肽,为进一步研究PB1亚基功能奠定基础.方法以PB1亚基cDNA为模板,用PCR方法扩增出PB1-1片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pQE30重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导各亚克隆系高效表达;优化表达条件.结果 PCR法扩增出487bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在E.coli M15中表达得到相对分子量约为20KD的重组蛋白,获得重组多肽.结论成功地亚克隆及表达了流感病毒RNA聚合酶PB1-1亚基.
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肿瘤细胞亚克隆进化模式和影响因素的研究进展
肿瘤细胞具有遗传不稳定性,这种不稳定性终导致不同肿瘤细胞的产生,即具有不同突变和表现的亚克隆,而不同亚克隆的共存机制及生物学后果极为复杂.肿瘤细胞亚克隆可以在不同的选择压力下进行“线性”或“分支”进化,其中肿瘤微环境即为重要的选择压力,其不仅影响着肿瘤亚克隆的进化,而且更广泛地影响着亚克隆的生长及它们的相互作用.肿瘤转移是患者预后差的重要原因,原始肿瘤细胞中的低频亚克隆在转移中扮演着重要的角色,肿瘤细胞中怎样的微妙变化使得低频亚克隆“活化”从而发生转移成为研究的重点.本综述将就肿瘤细胞的亚克隆进化模式及亚克隆的影响因素进行重点介绍,以期通过对亚克隆的研究和了解,指导临床个体化治疗.
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CD59基因的亚克隆
目的"构建pUC18-α珠蛋白DNA-CD59cDNA重组分子. 方法"采用人心肌组织作为RNA的来源,经RT-PCR扩增得到CD59基因的cDNA片段.以pUC18质粒为载体;人α-珠蛋白DNA为启动子,并提供polyA+尾巴;以编码全部CD59蛋白质的核苷酸序列的cDNA作为目标基因,三者拼接成重组分子. 结果"经酶切鉴定,重组分子拼接成功. 结论"该重组分子可作为转基因构件,经微注射输入供体动物受精卵细胞内,建立人CD59转基因动物模型.
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大鼠睾丸减数分裂相关基因的初步筛选
目的:比较成年大鼠睾丸生精小管处于减数分裂期的发育片段和睾丸间质细胞所表达基因的差异,初步筛选出与减数分裂相关的基因,为进一步研究减数分裂相关基因对精子发生的调控奠定基础.方法:运用在透射光解剖显微镜下区分和显微分割的方法,将成年大鼠新鲜睾丸生精小管第ⅩⅢ～Ⅰ期处于减数分裂阶段的片段分离出来,同时分离睾丸问质细胞,将二者进行mRNA差异显示逆转录聚合酶链反应(DDRT-PCR)分析,所得差异片段进行纯化回收,然后进行反向斑点杂交.结果:经mRNA差异显示,第ⅩⅢ～Ⅰ期生精小管片段共回收到7个差异cDNA片段,而间质细胞共回收到9个差异cDNA片段.经反向斑点杂交,共获得11个初步鉴定的特异表达增加的差异cDNA片段,片段大小为200～500 bp,其中6个从第ⅩⅢ～Ⅰ期生精小管片段获得,5个从间质细胞获得.结论:这些差异片段可作为睾丸减数分裂表达的序列标签进行更深入地研究.
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小鼠bcl10基因敲除载体的构建
根据已知的cDNA序列设计引物,通过RT-PCR获得小鼠bcl10基因cDNA片段作为探针,用噬斑原位杂交法克隆129品系小鼠的bcl10基因组DNA,在亚克隆完成序列结构分析的基础上,利用常规分子克隆技术,构建完成了针对bcl10基因的替代型基因敲除载体.两条同源臂分别为bcl10基因exon3上游2.4 kb和exon4下游4.5kb的基因片段.构建完成替代型小鼠bcl10基因敲除载体,为后续获得bcl10基因缺陷型胚胎干细胞系奠定了实验基础.
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卫氏并殖吸虫基因片段的亚克隆及其表达的研究
目的:获得诊断肺吸虫病的特异性重组抗原,以了解其作为免疫诊断抗原的价值.方法:将免疫筛选获得的卫氏并殖吸虫基因克隆双酶切,所得cDNA片段亚克隆入表达载体pRESETB,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,以聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(western blotting)对表达产物进行鉴定.结果:成功地将文库中2个大小不同的卫氏并殖吸虫基因片段连接到载体中.其中Pw-2重组子特异性表达产物是分子质量约为32 ku的蛋白带,可被卫氏并殖吸虫免疫兔血清特异性识别.结论:成功构建了编码卫氏并殖吸虫特异性抗原的重组克隆Pw-2.
