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白细胞介素-8的临床意义
白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)是近年由多家实验室发现的细胞因子; 曾有不同命名:如中性粒细胞激活蛋白(NAP-1),白细胞粘附抑制因子(LAF),T淋巴细胞趋化因子TCF).IL-8在炎症因子IL-1、TNF及脂多糖刺激下由多种细胞合成表达. 内皮细胞、T淋巴细胞、肺泡巨噬细胞、肝细胞、滑膜细胞、成纤维细胞和中性粒细胞等均可产生IL-8, 其中以血单核细胞产量为丰富.基因工程IL-8由72个氨基酸组成, 分子量为8kDa.
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表面表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白枯草芽孢的免疫原性
目的 构建表面表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白(NAP)的重组枯草芽孢,并鉴定其免疫原性.方法 以构建的pGEX-4T-1-NAP质粒为模板,采用特异性引物扩增幽门螺杆菌NAP基因,与构建的以枯草芽孢外衣蛋白Cotc融合表达的质粒Pus186-Cotc连接,转化枯草杆菌WB600,提取质粒进行酶切、测序鉴定.应用营养耗竭法诱导枯草芽孢生成,提取重组芽孢外衣蛋白进行电泳及免疫印迹分析,并使用NAP特异性抗体免疫荧光检测芽孢表面重组蛋白的表达.以普通芽孢作为对照组,使用表面表达NAP的重组枯草芽孢口服免疫小鼠,ELISA法检测小鼠免疫后0、15、30、45 d的NAP特异性血清IgG水平,判断重组芽孢免疫原性.结果 以pGEX-4T-1-NAP质粒为模板,扩增了NAP基因,并成功克隆入Pus 186-Cotc质粒,重组Pus 186-Cotc-NAP双酶切鉴定可见435 bp目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中.营养耗竭法可诱导重组枯草芽孢生成,产量达1×1011/L,提取芽孢外衣蛋白电泳见相对分子质量25 600的目的条带.免疫印迹显示使用NAP特异性抗体在相应相对分子质量25 600可见识别带.并且使用NAP特异性抗体可检测到重组芽孢免疫荧光,表明NAP在芽孢表面成功表达.与对照组相比,NAP重组芽孢口服免疫小鼠15d后,NAP特异性IgG升高即达高峰,30、45 d后一直维持在高峰平台期(均P＜0.05),表明重组芽孢具免疫原性.结论 成功构建了表面表达NAP的枯草芽孢工程菌,重组芽孢口服免疫小鼠具免疫原性,为幽门螺杆菌枯草芽孢疫苗的研制提供了依据.
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应用噬菌体随机肽库技术筛选幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的抗原表位
目的 筛选和鉴定幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)中性粒细胞激活蛋白(neutrophil-activating protein,NAP)的有效抗原表位,为Hp疫苗的研制提供基础.方法 以抗NAP的单克隆抗体作为固相筛选分子,经3轮吸附-洗脱-扩增免疫,筛选噬菌体随机7肽库,随机挑选噬菌体克隆,经噬菌体酶联免疫吸附试验(ELISA)、交叉反应试验及竞争抑制试验鉴定阳性克隆,测定阳性克隆所携带DNA序列并进行计算机辅助分析.以制备的阳性噬菌体克隆短肽液免疫小鼠,免疫血清与NAP经Western blot分析,以验证NAP的模拟表位.结果 经3轮免疫筛选后挑选到45个阳性克隆,经ELISA鉴定有12个阳性克隆,测序结果显示5种表位,其中P17噬菌体展示肽FAHLATQ与NAP氨基酸序列(137～143)高度同源,位于NAP高抗原区域(118～140),免疫血清可识别NAP.结论 用噬菌体随机7肽库成功筛选到了NAP的模拟表位,为基于NAP的诊断和疫苗的研制提供了基础.
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幽门螺杆菌重组中性粒细胞激活蛋白蛋黄抗体的制备
目的:制备高效价的.抗Nap蛋黄抗体(IgY).方法:大量诱导、培养重组菌pQE30-NapA-DH5α获得重组蛋白Nap,经Ni2+-NTA树脂纯化后,Bradford法测定蛋白浓度.用纯化的Nap蛋白免疫鸡,水稀释结合氯仿有机沉淀法提取IgY.ELISA法测定抗体产生的时间-效价变化.将效价高的Nap-IgY用硫酸铵沉淀法纯化浓缩,间接ELISA法检测效价,Bradford法测定蛋白含量.Western blot检测制备的Nap-IgY的抗体活性.结果:Nap重组蛋白主要以包涵体形式表达,蛋白含量为0.37 g/L.免疫鸡的蛋黄提取物可与Nap发生特异性反应,IgY效价随免疫时间增加而升高,在110 d达高效价.经纯化浓缩后,Nap-IgY的效价为1:12800,蛋白浓度为23.67 g/L.结论:成功制备了高浓度、高效价的Nap特异性IgY.
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抗幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的单克隆抗体的制备和鉴定
目的:从抗幽门螺杆菌(H pylori)全菌蛋白的单克隆抗体(mAb)中,应用重组中性粒细胞激活蛋白(NAP),筛选出抗NAP单抗并进行鉴定.方法:临床分离H pylori DY01,DY04株.免疫BALB/c小鼠后,应用杂交瘤技术制备mAb.再用ELISA方法以重组表达的NAP蛋白筛选相应的单抗,对NAP单抗进行亚类鉴定和效价检测,并用Western blot和免疫组化方法鉴定其特异性.结果:获得3株针对H pylori-NAP蛋白的特异性mAb,抗体亚类为IgG1,轻链为κ型.单抗细胞培养液的抗体效价为1/16-1/32,腹水的抗体效价是1/32000-1/64000.Western blot鉴定表明,抗NAPmAb针对NAP蛋白产生特异性条带,具有高度的特异性;免疫组化分析显示:3株NAP mAb能与H pylori临床菌株发生特异性结合反应,菌体染成深棕色.结论:获得抗H pylori-NAP蛋白的特异性mAb,为幽门螺杆菌感染的诊断、预后判断及表位疫苗的研究提供基础.
关键词： 幽门螺杆菌 中性粒细胞激活蛋白 单克隆抗体 Western blot 免疫组化 -
携带幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白活减毒鼠伤寒沙门菌口服重组DNA疫苗株的构建
目的:构建携带人幽门螺杆菌(Hpylori)中性粒细胞激活蛋白HP-NAP)基因(napA)的重组活减毒鼠伤寒沙门菌口服DNA疫苗.方法:应用基因工程技术扩增全长napA,测序并同源性分析后,将其亚克隆入真核表达载体pIRES,鉴定正确后将重组质粒转化活减毒鼠伤寒沙门菌.结果:重组质粒经PCR及双酶切,证实成功构建了携带HP-NAP基因的重组真核表达质粒pIRES-napA,后者成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL7207.所克隆435bp napA与GenBank中SS1-napA核苷酸和蛋白质的同源性均为98%.结论:成功构建并鉴定了携带HP-NAP基因的重组活减毒鼠伤寒沙门菌口服DNA疫苗,为多价抗Hpylori口服DNA疫苗的研制奠定了基础.
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肾母细胞瘤瘤体中差异性炎症因子的鉴定及其临床意义
目的 利用蛋白组学技术研究肾母细胞瘤瘤体存在的差异性炎症因子,分析其与肿瘤的临床分期、病理分型、淋巴结转移及血管侵犯的相关性.方法 收集2010年1月至2014年12月收治的肾母细胞瘤患儿的瘤体(瘤体组)40例,肿瘤临床分期Ⅰ期6例,Ⅱ期12例,Ⅲ期13例,Ⅳ期9例;预后良好型37例,预后不良型3例;淋巴结转移17例,无淋巴结转移23例;血管侵犯9例,无血管侵犯31例.同时收集肿瘤近端(距肿瘤边缘1 cm)肾组织35例、肿瘤远端(距肿瘤边缘5 cm)肾组织25例.通过表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术筛选3组间的差异性蛋白峰,对瘤体中存在的高表达蛋白峰通过固相萃取技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离、纯化,胶内酶解后的肽段混合物置入色谱串联质谱,根据氨基酸序列鉴定目标蛋白身份.根据瘤体中炎症蛋白峰的表达强度,在临床分期、病理分型、淋巴结转移及血管侵犯各组内进行比较分析.结果 肿瘤组织高表达的蛋白峰中,m/z12138和m/z13462分别被鉴定为巨噬细胞移动抑制因子和中性粒细胞激活蛋白,两者在瘤体组的表达量(1437.8±997.3和1730.4±1147.8)高于肿瘤近端肾组织(952.6±591.2和1031.1±1120.8)及肿瘤远端肾组织(315.4±296.5和114.7±118.9),3组比较差异有统计学意义(P＜0.001).瘤体组中m/z12138和m/z13462的表达量按不同病理特征分组进行比较:临床分期Ⅰ期(678.8±189.0和746.2±238.7),Ⅱ期(664.0±202.0和1180.7±404.9),Ⅲ期(1524.7±407.9和2160.4±1252.3),Ⅳ期(2850.2±861.2和2498.4±1290.5);预后良好型(1271.7±809.2和1553.3±991.4),预后不良型(3487.2±166.2和3915.1±507.3);淋巴结转移组(2207.1±961.7和2569.5±1285.2),无淋巴结转移组(869.2±474.6和1110.2±433.6);血管侵犯组(2850.2±861.2和2498.4±1290.5),无血管侵犯组(1027.8±521.3和1507.5±1019.9),各病理特征分组内比较差异均有统计学意义(P＜0.001).结论 炎症因子巨噬细胞移动抑制因子和中性粒细胞激活蛋白高表达于肾母细胞瘤瘤体中,与肿瘤的临床分期、病理分型、淋巴结转移、血管侵犯具有相关性.
关键词： 巨噬细胞移动抑制因子 中性粒细胞激活蛋白 肾母细胞瘤 -
幽门螺杆菌的免疫反应及疫苗研究进展
Hp的自然免疫Hp可激活胃黏膜中多种天然防御体系,如同时激活Toll样受体(TLR)和Nod样受体(NLR),终会导致T辅助(Th)1细胞的强烈反应.Hp的不同菌体成分均能激活免疫细胞,其中Hp-中性粒细胞激活蛋白(NAP)是Hp激活TLR的重要因子.
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幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的基因克隆与表达
目的克隆、表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白基因napA,为研究幽门螺杆菌致病机理提供材料.方法用PCR从幽门螺杆菌DNA中扩增出目的基因napA,定向插入原核表达载体pQE30中,测序分析确认后,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达,表达蛋白以NI2+-NTA柱进行纯化.结果 PCR扩增出435bp目的基因片段napA,克隆入pQE30质粒.工程菌诱导后SDS-PAGE显示新生表达蛋白带,相对分子质量为17000,与预期一致,约占菌体总蛋白的38%,经Ni2+-NTA柱纯化后可获得纯度为95.5%重组蛋白.Westem blot显示重组蛋白具有良好的抗原性.结论克隆napA基因成功,并在大肠杆菌DH5α中高效表达.
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幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白核酸疫苗实验研究
目的构建幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(Hp-NAP)口服DNA疫苗,初步评价其免疫治疗作用,为Hp疫苗研制奠定基础.方法 PCR扩增全长Hp-NAP基因(napA),测序并同源性分析后,亚克隆入真核表达载体pIRES,双酶切并PCR鉴定.将重组质粒pIRES-napA转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,口服接种长期感染Hp之BALB/c小鼠,观察疗效.结果 PCR扩增出一435 bp产物,序列分析表明,所克隆序列与GenBank中SS1-napA核苷酸及蛋白质同源性均>98%.PCR及双酶切证实,成功构建了携带napA的重组减毒鼠伤寒沙门菌DNA疫苗.疫苗接种后4周,治疗组3/4小鼠快速尿素酶检测阴性,对照组均阳性(P=0.0476);治疗组血清抗Hp-NAP抗体效价明显升高.结论成功构建了具有较好免疫治疗作用的Hp-NAP口服重组DNA疫苗,为进一步研制多价抗Hp DNA疫苗奠定了基础.
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幽门螺杆菌UreB-NAP-HpaA三价DNA疫苗的构建及免疫原性初步研究
目的:构建幽门螺杆菌(Hp)尿素酶亚单位B(UreB)、中性粒细胞激活蛋白(NAP)及黏附素A(HpaA)三价重组DNA疫苗并研究其抗原性,为Hp疫苗的开发奠定基础.方法:PCR扩增UreB、NAP、HpaA全长序列,分别克隆入pMD 18-T载体,测序并鉴定方向后依次连接,构建融合基因UNH,然后将其亚克隆入真核表达载体pIRES,以此转染COS-7细胞,Western印迹检测表达蛋白的抗原性.结果:PCR分别获得约1 707、432和750 bp产物,与GenBank中相关序列具有高度同源性,三者融合后获得一约2 901 bp目的基因.重组质粒pIRES-UNH转染COS-7细胞后表达相对分子质量约107 000的蛋白质,Western印迹显示该重组蛋白可为UreB、NAP、HpaA抗血清特异识别,具有良好的抗原性.结论:成功构建了具有良好免疫原性的UreB-NAP-HpaA三价重组DNA疫苗,为进一步探讨其免疫保护性及Hp疫苗的研制奠定了基础.
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幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白DNA疫苗的构建及其免疫保护作用
目的:构建携带幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白(Hp neutrophil-activating protein,Hp-NAP)基因(napA)活减毒鼠伤寒沙门菌重组DNA疫苗,初步观察其对慢性Hp感染的免疫保护作用.方法:应用基因工程技术扩增全长napA,测序并经同源性分析后,将其亚克隆入真核表达载体pIRES,鉴定正确后将重组质粒转化活减毒鼠伤寒沙门菌构建Hp-NAP口服DNA疫苗.口服Hp-SS1建立SS1长期感染小鼠模型,30周后随机均分为3组,每组各5只.治疗组予109cfu/0.4 ml疫苗菌灌胃,1次/周×3周;2个对照组分别予等体积生理盐水或空白质粒.末次免疫4周后行快速尿素酶检测,ELISA测定血清抗体效价.结果:重组真核表达质粒pIRES-napA成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL7207;所克隆napA与GenBank中SS1-na-pA核苷酸和蛋白质的同源性均＞98%.免疫后4周治疗组75%(3/4)小鼠快速尿素酶检测阴性,对照组均阳性,差异显著(P＜0.05);治疗组血清抗Hp-NAP抗体效价明显升高.结论:成功构建了具有较好免疫保护作用的Hp-NAP口服重组DNA疫苗,为进一步研制多价抗Hp核酸疫苗奠定了基础.
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幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的表达及免疫原性
目的克隆幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(NAP)基因并制备其原核表达系统,研究其表达蛋白的免疫原性,为Hp疫苗研制提供理论依据.方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增Hp-NAP基因,测序并作同源性分析后,亚克隆入原核表达载体pET-22b,转化表达菌BL21-CodonPlus(r)(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,Western blot鉴定其免疫原性.结果PCR扩增一408 bp产物,与基因库中相关序列具有高度同源性(＞98%).重组质粒pET-22b-nap转化BL21-CodonPlus(r)(DE3)后表达一相对分子质量约19 000的融合蛋白,能与Hp全菌抗体产生结合反应,Western blot显示特异的单一条带.结论成功构建Hp-NAP原核表达系统,所表达NAP融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Hp疫苗的候选抗原.
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幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白在乳酸菌中的表达及免疫活性
目的 构建表达幽门螺杆菌(H.pylori)中性粒细胞激活蛋白A(NapA)的重组乳酸乳球菌菌株,为研究NapA作为疫苗抗原和免疫调节剂的应用效果奠定基础.方法 用PCR方法从H.pylori基因组DNA中扩增napA基因,将napA经NaeⅠ和SphⅠ双酶切与表达载体pNZ8110连接,用电穿孔法转入乳酸乳球菌菌株NZ3900中,并通过SDS-PAGE和Western blots分析鉴定napA表达产物.结果 扩增的napA基因长度为435 bp,构建的重组乳酸乳球菌经nisin诱导可表达分子量约为19 kD的重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白量的12.4％,该重组蛋白可被小鼠抗H.pylori血清识别.结论成功构建了表达NapA的重组乳酸乳球菌菌株,该菌株在H.pylori口服疫苗和黏膜免疫调节研究中具有应用潜力.
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亲和层析纯化重组中性粒细胞激活蛋白
目的:直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化重组麦芽糖结合蛋白-中性粒细胞激活蛋白(recombinant maltose-binding protein-neutrophil-activating protein,rMBP-NAP).用于支气管哮喘模型小鼠进行免疫调节实验.方法:IPTG诱导基因工程菌E.coli TB1 (pMAL-c2X-nap)表达rMBP-NAP,离心收获细胞,过柱缓冲液重悬菌体并超声破碎,再次离心取上清和沉淀,SDS-PAGE分析rMBP-NAP可溶性；直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化rMBP-NAP;SDS-PAGE凝胶扫描分析纯化后rMBP-NAP纯度；蛋白定量试剂盒测定rMBP-NAP浓度.结果:IPTG诱导工程菌表达的rMBP-NAP主要以可溶性形式存在于超声上清中,相对分子质量约为57kD,与预期结果一致；亲和层析法纯化rMBP-NAP纯度可达96.5％,浓度可达0.625g/L.结论:用直链淀粉树脂亲和层析法,可纯化得到高纯度、高浓度的融合蛋白rMBP-NAP.
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幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白抗体水平与胃癌的相关性
目的 探讨幽门螺杆菌(HP)中性粒细胞激活蛋白(NAP)抗体水平与胃癌的相关性.方法 应用ELISA方法,对正常人和HP感染患者外周血中的NAP抗体水平进行检测,并用PCR方法检测HP临床菌株中nap基因存在状况.结果 所有检测的HP临床菌株中都存在napA基因;正常人血清中NAP抗体阳性率为42.6%;胃癌患者血清HP-NAP抗体阳性率为97.5%,明显高于胃溃疡患者92.9%和慢性胃炎患者85.7%的抗体阳性率;胃癌患者NAP抗体水平明显高于胃炎患者,但与胃溃疡患者无明显差异;NAP抗体水平与患者年龄无明显相关性.结论 NAP抗体水平与胃癌有一定相关性,提示NAP蛋白可能有致胃癌的作用.本研究为HP相关性胃癌的致病机制、诊断和疫苗研究提供基础.
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幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白分子内佐剂融合疫苗的构建、纯化及活性研究
目的 构建幽门螺杆菌(HP)中性粒细胞激活蛋白基因(napA)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(heat-labile enterotoxin B subunit,LTB)的分子内佐剂融合蛋白疫苗,并通过口服免疫小鼠研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础.方法 利用分子克隆技术构建携带napA-LTB融合基因的重组原核表达质粒pET-22b-napA-LTB,转化E.coli BL21(DE3),进行原核表达,重组表达蛋白采用亲和层析柱Chelating Sepharose进行纯化,Tris-Tricine电泳和Western blot鉴定,GM1-ELISA检测rNAP-LTB与神经节苷脂的结合.口服免疫BALB/c小鼠,检测重组融合蛋白的抗原性.结果 重叠延伸PCR扩增出了约760 bp的napA-LTB融合基因,其核苷酸序列与GenBank公布的相关序列一致.重组融合蛋白以可溶和包涵体两种形式表达,表达量约占细菌总蛋白的30%,Tris-Tricine初步测定目的 蛋白的相对分子质量(Mr)约29 000,纯化后纯度大于90%.Western blot检测其具有良好的抗原性.该重组蛋白保持了与GM1神经节苷脂结合的生物学活性.动物实验表明,分子内佐剂疫苗口服免疫小鼠后血清特异性IgG,IgA和胃黏液、肠黏液的抗原特异性sIgA抗体显著高于无佐剂单一亚单位疫苗.结论 所获得的重组融合蛋白具有良好的抗原性和黏膜佐剂活性,为进一步的疫苗研究奠定了基础.
关键词： 幽门螺杆菌 中性粒细胞激活蛋白 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 疫苗 分子内佐剂 -
幽门螺杆菌napA-ctxB融合蛋白的基因克隆与表达
目的 克隆、表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白napA与霍乱毒素B亚单位ctxB融合基因napA-ctxB(nctB),为制备预防H.pylori感染的疫苗奠定基础.方法 用PCR方法扩增ctxB目的基因片段,克隆至pQE30-napA质粒的napA基因上游,构建含双基因的表达质粒pQE30-napA-ctxB(pQE30-nctB),经测序分析确认后转化E.coli DH5α,经IPTG诱导表达融合蛋白NCTB,融合蛋白NCTB经镍离子柱纯化.结果 PCR扩增出807 bp的目的基因片段nctB.工程菌pQE30-nctB-DH5α经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,Mr为30 000,与预期的一致,约占菌体总蛋白的27%,重组蛋白用Ni2+-NTA 树脂提纯,纯化后的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带,图象软件分析表明纯度可达94%以上.Western blot 显示重组蛋白质有良好的抗原性.结论 构建含双基因的表达质粒pQE30-nctB成功,并在大肠杆菌DH5α中高效的表达.
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幽门螺杆菌分子内佐剂三价疫苗的构建、纯化及活性研究
目的 构建幽门螺杆菌(helicobacter pylori,Hp)中性粒细胞激活蛋白基因napA、黏附素hpaA、尿素酶B亚单位活性功能片段ureB414与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(heat-labile enterotoxin B subunit,LTB)的分子内佐剂三价融合蛋白疫苗,并通过口服免疫小鼠研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础.方法 利用分子克隆技术构建携带napA-hpaA-ureB414-LTB融合基因的重组原核表达质粒pET-22b-NHUL,转化E.coli BL21(DE3),进行原核表达,重组表达蛋白采用HK 26/60 Superdex-75分子筛和亲和层析柱Chelating Sepharose进行纯化,Tris-Tricine电泳和Western blot鉴定,GM1-ELISA检测rNHUL与神经节苷脂的结合.口服免疫Balb/c小鼠,检测重组融合蛋白的抗原性.结果 重叠延伸PCR扩增出了约1 590 bp的NHUL融合基因;其核苷酸序列与GenBank公布的相关序列一致.重组融合蛋白以可溶和包涵体两种形式表达,表达量约占细菌总蛋白的25%,Tris-Tricine初步测定目的蛋白的Mr约59 000,纯化后纯度大于90%.Western blot检测其具有良好的抗原性.该重组蛋白保持了与神经节苷脂GM1结合的生物学活性.动物实验表明,多亚单位疫苗口服免疫小鼠后血清特异性IgG、IgA和胃黏液、肠黏液的抗原特异性sIgA抗体显著高于单一亚单位疫苗.结论 所获得重组融合蛋白具有良好的抗原性和黏膜佐剂活性,为进一步的疫苗研究奠定了基础.
关键词： 幽门螺杆菌 中性粒细胞激活蛋白 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 疫苗 分子内佐剂
