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实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌重组质粒标准的构建
[目的]构建蜡样芽胞杆菌16s-23sITS重组质粒,为实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌提供质粒标准.[方法]选择蜡样芽胞杆菌16s一23sITS特异基因作为目的靶序列,设计、合成引物和探针,采用普通PCR扩增特异靶序列,克隆到pGM-T载体后,转化感受态大肠埃希菌DH5α,经蓝白斑筛选,再分别用EcoRI酶切,普通PCR及测序3种方法证实目的片段已成功重组.建立荧光定量PCR检测蜡样芽胞杆菌的标准曲线.[结果]成功构建目的重组质粒,并以此为标准制作荧光定量PCR标准曲线.重组质粒标准具有较大的线性范围(102copies/μl～108%opies/μl)和灵敏度.[结论]该方法构建的16s-23sITS基因重组质粒能满足实时荧光定量测定对参考标准的要求,为后续实时荧光PCR快速检测蜡样芽胞杆菌的推广应用提供了条件.
关键词： 杆菌 蜡样芽胞 TaqManTM探针 重组质粒 实时荧光定量PCR -
草鱼肾细胞电转条件的优化及草鱼呼肠孤病毒NS26蛋白的瞬时表达
本研究先以pEGFP-N1载体质粒中的绿色荧光蛋白基因为报道基因进行电转实验,优化电压、脉冲时间、质粒添加量和电击次数等电转条件,确立佳条件.实验表明,细胞密度为1.5×107/mL时,取200 μl在0.2 cm电击杯中进行电击转染,电压为200 V,脉冲时间为45 ms,添加质粒30 μg,电击1次时,转染效果佳.提取草鱼呼肠孤病毒基因组总RNA,以其逆转录的cDNA作为扩增模板,设计特异引物扩增出GCRV非结构蛋白NS26的基因片段,重组到pEGFP-N1载体上得到重组质粒pEGFP-NS26,将其导入CIK细胞中用电转法高效表达了EGFP-NS26融合蛋白.本研究为进一步研究NS26的功能奠定了基础.
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鹅细小病毒主要免疫原性蛋白基因的克隆与序列分析
利用PCR技术,从纯化鹅细小病毒SYG99-5毒株鹅胚尿囊液中扩增出病毒主要免疫原性蛋白基因.将该PCR扩增片段克隆入pGEMR-T质粒载体的HincⅡ和SacⅠ位点之间,酶切分析筛选并进一步通过Southern杂交验证后,获得含1.6kb基因片段的重组质粒GpG3.序列测定结果表明,该片段与国外已报道的GPV B株苷酸序列有96%的同源性,氨基酸序列有97%的同源性.
关键词： 鹅细小病毒 聚合酶链式反应 VP3基因 Southern杂交 重组质粒 -
人间质胶原酶基因高效表达对体外肝纤维化的影响
目的:观察人间质胶原酶(MMP1)基因高效表达对体外肝纤维化的影响.方法:利用DNA重组技术构建了pcDNA3-MMP1真核表达重组质粒.经脂质体包裹后,并将其转染张氏传代人肝细胞,Western blot检测MMP1蛋白表达量.在体外乙醇诱导纤维化培养条件下,LSAB免疫组织化学法检测肝细胞周围Ⅰ、Ⅲ型胶原生成状况,经图象分析仪半定量分析胶原纤维的相对含量(relative content of collagen,RCC).结果:成功构建了真核表达质粒pcDNA3-MMP1.RCC结果显示未转染组为132.6±5.7,转染组为118.8±4.8;未转染组明显高于转染组(P＜0.01).从而证明重组质粒pcDNA3-MMP1能在体外致纤维化培养条件下拮抗细胞间质过多胶原产生.结论:本研究结果表明通过MMP1基因的高效表达,加速Ⅰ、Ⅲ型胶原降解,在体外表现一定抗肝纤维化作用,从而为以后肝纤维化基因导入治疗打下基础.
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膜联蛋白A5重组质粒的构建及其过表达对SiHa细胞增殖的影响
目的 构建膜联蛋白A5(ANXA5)重组质粒并探讨过表达ANXA5对宫颈癌SiHa细胞的增殖产生的影响. 方法 将ANXA5基因克隆入含His标签的pcDNA3.1质粒载体,构建pcDNA3.1-ANXA5重组质粒;用磷酸钙共沉淀法将重组质粒和pcDNA3.1空质粒分别转染宫颈癌细胞系SiHa细胞,G418加压培养,免疫印迹法筛选过表达ANXA5的细胞克隆,免疫组织化学筛选已转染pcDNA3.1空质粒的细胞克隆;将过表达ANXA5蛋白的细胞、载有pcDNA3.1空质粒的细胞以及未处理的SiHa细胞分别进行四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)实验和CCK-8实验检测细胞增殖情况. 结果 成功构建了peDNA3.1-ANXA5重组质粒,测序证实ANXA5基因序列正确;普通未处理的SiHa细胞和转染了pcDNA3.1空质粒的SiHa细胞生长速度较快,两组同无显著性差异(P>0.05);过表达ANXA5的SiHa细胞其增殖速度比前两组显著降低(P<0.05). 结论 膜联蛋白A5可能对宫颈癌细胞系SiHa细胞的增殖具有抑制作用.
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CMY型AmpC酶新基因亚型的序列分析与表达载体构建
目的 对两株弗劳地枸橼酸杆菌所产CMY型AmpC酶进行基因克隆、序列分析和重组表达载体的构建.方法 以产CMY型AmpC酶的弗劳地枸橼酸杆菌30、31号总基因组DNA为模板,PCR扩增CMY基因,将其克隆人pGEM-T载体后测定该核苷酸序列.30、31号菌与受体菌进行质粒接合实验,构建pBV220-CMY重组表达载体.对原菌株和重组菌株进行AmpC酶检测.结果 PCR扩增出大小为1146 bp的基因片段,与GenBank上多种CMY亚型的基因序列同源性为97%.质粒接合实验证实质粒上含CMY基因,为可转移质粒.三维实验结果显示30、31号菌和重组菌株所产的酶均能水解头孢西丁.结论 30、31号菌所产的CMY型AmpC酶为CMY新基因亚型.成功构建重组表达载体pBV220-CMY,为下一步酶的表达和纯化提供了依据.
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人β防御素2在大鼠子宫内膜异位模型异位病灶组织中的转染表达
目的 构建人β防御素2(hBD-2)的真核表达载体PLXSN的重组质粒pLXSN-hBD2,将其转染至大鼠子宫内膜异位症(EMS)模型的局部异位病灶组织,并检测hBD-2基因和蛋白表达.方法 利用双酶切定位定向克隆技术,将hBD-2基因片段连接于pLXSN质粒的EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ两个酶切位点之间,构建重组质粒pLXSN-hBD2.自体内膜移植法建立大鼠EMS模型,将pLXSN-hBD2局部多点注射至其局部异位病灶组织,Western印迹检测局部病灶组织中的hBD-2蛋白表达.结果 经过重组质粒的鉴定电泳以及测序鉴定,设计合成的基因片段序列与GenBank中hBD-2cDNA序列完全相同,其中碱基54-248为目的基因hBD-2序列.Western印迹证实大鼠EMS模型异位病灶局部有hBD-2蛋白的表达.结论 通过局部多点注射的方法,可将携带hBD-2基因的重组质粒pLXSN-hBD2成功转染至大鼠EMS异位病灶组织中,并获得hBD-2蛋白的表达.
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刚地弓形虫ROP10-ROP18真核表达载体的构建与鉴定
目的 构建刚地弓形虫棒状体蛋白10 (ROP10)、棒状体蛋白18(ROP18)复合基因真核表达载体pVAXD-ROP10-ROP18,并在HeLa细胞内表达目的蛋白. 方法 设计ROP10、ROP18基因特异引物,采用RT-PCR扩增ROP10、ROP18基因并测序,将ROP10和ROP18基因分别定向插入双启动子真核表达载体pVAXD的多克隆位点中,构建单价质粒pVAXD-ROP10和pVAXD-ROP18,然后将ROP18基因插入pVAXD-ROP10中构建双启动子真核表达载体pVAXD-ROP10-ROP18.经PCR和双酶切验证后将pVAXD-ROP10-ROP18转染至HeLa细胞内,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,以此为模板分别进行ROP10基因和ROP 18基因的RT-PCR鉴定;采用间接免疫荧光试验(IFA)检验ROP10和ROP18蛋白表达情况. 结果 成功克隆ROP10、ROP18基因片段并构建了重组质粒pVAXD-ROP10-ROP18,测序、双酶切和PCR验证重组质粒构建正确.分别将3种重组质粒转染至HeLa细胞后经RT-PCR鉴定,pVAXD-ROP10-R()P18组可同时扩增出1 761 bp(ROP10基因)和1 665 bp(ROP18基因)2个片段,而pVAXD-ROP10组和pVAXD-ROP18组分别扩增出1 761 bp和1 665 bp的目的片段;IFA显示pVAXD-ROP10组和pVAXD-ROP18组均有绿色荧光,即分别表达ROP10和ROP18蛋白. 结论 成功构建重组质粒pVAXD-ROP10-ROP18、pVAXD-ROP10和pVAXD-ROP18质粒可在真核细胞中分别表达ROP10和ROP18两种蛋白.
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肠出血性大肠埃希菌O157∶H7外膜蛋白A的表达、鉴定和纯化
目的 构建肠出血性大肠埃希菌O157∶H7外膜蛋白A基因重组质粒,研究其在大肠埃希菌中的表达情况. 方法 用RT-PCR法从肠出血性大肠埃希菌O157∶H7菌株克隆OmpA基因,构建重组质粒pET-30a (+)-OmpA,经双酶切及基因测序鉴定后在E.coli BL21(DE3)原核表达系统中诱导OmpA的表达,通过蛋白质电泳技术检测蛋白的表达,用Western blot法测定和分析免疫反应性. 结果 获得的目的 基因为1 041 bp,与预期值相符,测序结果与GenBank公布序列的同源性达100%,重组质粒pET-30a (+)-OmpA在原核系统下可表达OmpA, Western blot分析His-Tag单抗能与OmpA(His-Tag)发生免疫反应. 结论 OmpA重组质粒构建成功,表达产物具有抗原性.
关键词： 肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 外膜蛋白A 重组质粒 原核表达 -
盆腔炎患者感染大肠埃希菌中重组质粒pGEX-SrtA△N59的构建及测序分析
目的 构建盆腔炎患者感染大肠埃希菌重组质粒pGEX-SrtA△N59并进行测序鉴定,为寻找盆腔炎患者感染大肠埃希菌的治疗新方法和新药研发奠定基础. 方法 分别提取pMD20-SrtA和pGEX-4T-1质粒并进行鉴定.然后根据SrtA基因序列来设计特异性引物,以pMD20-SrtA为模板进行SrtA△N59基因PCR扩增.将目的片段克隆至pGEX-4T-1中,构建pGEX-SrtA△N59重组质粒,进行酶切和测序分析. 结果 pMD20-SrtA酶切目的基因片段约为618 bp,与预期SrtA基因片段大小相符合,可作为模板扩增SrtA△N59.pGEX-4T-1经单、双酶切均获得5 000 bp片段,大小与预期值(4 900 bp)相符合,该质粒可应用于构建重组质粒.PCR扩增产物约460 bp,与SrtA△N59基因的大小符合.构建的pGEX-SrtA△N59重组质粒经双酶切,获得460 bp目的基因片段,表明SrtA△N59基因成功插到载体pGEX-4T-1中;基因测序显示,其与AF162687基因序列100％匹配.SrtA△N59基因大小应为441 bp,但本实验设计引物时在其两端分别加有酶切位点以及保护性基团,所以所得扩增产物的目的片段大小约为460 bp. 结论 构建的pGEX-SrtA△N59中成功插入SrtA基因,重组质粒构建正确.
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EPEC O2、O78及融合双价弱毒菌株O2,78(Chlr Norr)ompA基因原核表达载体重组构建
目的 构建PThioHisA-ompA重组质粒. 方法 根据GenBank中大肠埃希菌K-12外膜蛋白A基因的核苷酸序列设计引物,从大肠埃希菌O2、O78及其融合株O2,78(ChlrNorr)中分别扩增得到外膜蛋白A基因(ompA)序列,进行序列测定及分析.重组PMD-18-ompA经双酶切切下ompA片段,电泳回收;原核表达载体PThioHisA质粒双酶切,回收大片段.再将回收的ompA插入回收大片段原核表达载体PThioHisA上. 结果 按预期PThioHisA-ompA重组质粒PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,在约1 kb处有一清晰条带,与预期值相符. 结论 成功构建PThioHisA-ompA重组质粒,为致病性大肠埃希菌基因疫苗的抗原筛选和构建奠定了实验基础.
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刚地弓形虫RH株ROP18基因真核表达载体的构建
目的 PCR扩增刚地弓形虫(Toxplasma gondii)棒状体蛋白18 (ROP18)基因,构建真核表达载体pVAX1-ROP18,并检验其在真核细胞中的表达.方法 ROP18基因和质粒pVAX1分别经HindⅢ和BamH I双酶切,在T4连接酶作用下连接过夜,将连接产物转化至大肠埃希菌E.coil XL1-Blue感受态细胞,经菌落PCR、双酶切及测序正确的重组质粒pVAX1-ROP18转染至HeLa细胞内.试验设空白对照组和pVAX1空质粒对照.提取各组HeLa细胞的总RNA并将其逆转录成cDNA,分别进行管家基因β-actin和ROP18基因的RT-PCR扩增;采用Western blot法检测转染后各组细胞ROP18蛋白的表达情况.结果 经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测,ROP18基因的RT-PCR扩增片段大小为1665bp,与预期值相符;ROP18基因重组质粒转化菌菌落PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定,大小为1665bp,与预期值相符;双酶切重组质粒得到预期酶切片段;重组质粒的目的基因序列与弓形虫RH株ROP18基因(登录号AM075204.1)序列比对完全一致.脂质体转染后各组β-actin的RT-PCR扩增目的片段均为613bp,与预期值相符;pVAX1-ROP18重组质粒转染组的ROP18的RT-PCR扩增目的片段大小为1665bp,而其他组无该目的基因条带.Western blot检测重组质粒pVAX1-ROP18能够在HeLa细胞内表达ROP18蛋白.结论 成功构建了真核表达载体pVAX1-ROP18,且该重组质粒能够在真核细胞内表达ROP18蛋白.
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旋毛虫抗原基因Ts87在真核细胞中的表达
目的在体外真核细胞COS7中表达重组质粒pcDNA3.1/Ts87,为旋毛虫病DNA疫苗的研究奠定基础. 方法将重组质粒pcDNA3.1/Ts87经脂质体Lipofectamine介导,体外转染真核细胞COS7,通过细胞免疫组化,细胞裂解物的SDS-PAGE电泳和Western-blot分析检测表达产物. 结果重组质粒能够在COS7中表达出约38 ku的目的蛋白,并能够被旋毛虫阳性血清特异识别. 结论构建的重组质粒可在体外真核细胞COS7中成功表达.
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弓形虫Ⅰ、Ⅱ型虫株ROP16基因重组表达载体的构建及其对A549细胞STAT3/6磷酸化水平的影响
目的 探索弓形虫Ⅰ、Ⅱ型虫株ROP16在A549细胞中的功能. 方法 提取弓形虫Ⅰ(RH)、Ⅱ(ME49)型虫株总RNA,PCR扩增ROP16基因全长序列后克隆至真核表达载体pEGFP-N1,转染A549细胞,采用Western blot方法检测细胞中STAT3/6磷酸水平,采用实时荧光定量PCR检测IL-12、iNOS、ARG1mRNA表达水平. 结果 PCR扩增Ⅰ、Ⅱ型虫株ROP16基因全长为2148bp.双酶切和测序验证重组载体构建正确,pEGFP-N1-RH ROP16和pEGFP- N1-ME49ROP16过表达载体转染A549细胞后ROP16mRNA表达水平较未转染组上调(P＜0.05,F=824.184, 270.904),pEGFP-N1-ME49ROP16转染A549细胞p-STAT3/6表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05,F =1.051,1.203),IL-12 、iNOS mRNA 与对照组表比呈高表达(P＜0.01,F=157.705,173.623).pEGFP-N1-RH ROP16转染组相比A549细胞对照组p-STAT3/6表达水平上调(P＜0.05,F=121.227,68.324),IL-12mRNA表达下调(P＜0.01,F=186.397),ARG1mRNA表达上调(P＜0.01,F=126.236). 结论 弓形虫Ⅰ型RH 株ROP16蛋白具有激活p-STAT3/6作用,且能使ARG1mRNA 的表达上调,IL-12mRNA的表达下调,而弓形虫Ⅱ型ME49虫株 ROP16蛋白则无激活p-STAT3/6作用,但能使IL-12mRNA和iNOS mRNA的表达上调.
关键词： 弓形虫 ROP16 A549人肺腺癌细胞 重组质粒 -
日本血吸虫重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达
目的 构建日本血吸虫重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增获Sj26GST和Sj32抗原编码基因;采用基因拼接法(gene SOEing)剪接Si26GST和Sj32,得到Sj26GST-Si32融合基因;将融合基因克隆至原核表达载体pQE30,构建重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32并转化大肠埃希菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定.结果 基因拼接法扩增出约1991 bp的Si26GST-Sj32融合基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST-Sj32融合基因成功插入pQE30中,SDS-PAGE显示表达产物为分子质量单位约为61 ku的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的18%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了日本血吸虫重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性.
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抗人IL1RAP单克隆抗体重、轻链基因的克隆及重组嵌合受体的构建
目的:克隆抗人IL1RAP(IL-1 receptor accessory protein)单克隆抗体(McAb)可变区基因及构建嵌合抗原受体(CAR)重组质粒.方法:采用RACE、重叠延伸PCR技术,从3H6E10、10D8A7杂交瘤细胞总RNA中克隆扩增IL1RAP McAb的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)段DNA,并连接成IL1RAP特异性单链抗体可变区基因片段(scFv).将hCD8α跨膜段、hCD137胞内段、hTCRξ链、hCD8α引导肽(Signal peptide)、scFv-anti-IL1 RAP连入载体LV-Lac,并与辅助载体pMD2.G、psPAX2共同转染293FT细胞,包装获得病毒颗粒.结果:获得了两种抗人IL1RAP McAb的VH及VL基因,3H6E10 VH和VL基因全长402 bp和393 bp,可分别编码134、131个氨基酸;10D8A7 VH和VL基因全长423 bp和381 bp,可分别编码141、127个氨基酸.构建重组表达载体LV-3H6E10 scFv-ICD、LV-10D8A7 scFv-ICD(ICD:CD8α跨膜段-CD137胞内段-TCRξ链)后,经测序证实目的片段序列正确.重组质粒转染293FT细胞获得慢病毒颗粒.结论:本实验成功构建了能特异性结合人IL1RAP蛋白的嵌合受体,为以后制备IL1RAP-CAR杀伤性T细胞疫苗打下基础.
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人同源盒基因HoxB4真核表达载体的构建及鉴定
本研究旨在构建人同源盒基因HoxB4真核表达载体并进行鉴定,为进一步研究HoxB4的作用提供物质基础.采用RT-PCR的方法从健康产妇脐血单个核细胞中扩增出该基因,并将HoxB4的PCR产物用EcoRI和BamHI双酶切后连接到用EcoRI和BamHI双酶切的带有EGFP编码序列和内部核糖体转入位点(IRES)的真核表达载体pIRES2-EGFP中,重组质粒在大肠杆菌DH5α内扩增后,对其进行双酶切及测序鉴定以证实载体构建成功.结果表明,双酶切和质粒测序结果证明HoxB4基因正确的连接到真核表达载体pIRES2-EGFP中,开放阅读框架正确,pIRES2-EGFP/HoxB4真核表达载体构建成功.结论:利用PCR,DNA重组等分子生物学技术,成功构建了pIRES2-EGFP/HoxB4真核表达载体,为探讨HoxB4基因在造血干细胞的增殖和分化的调控功能提供了实验基础.
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纤溶酶原激活物抑制剂1反义RNA对猪主动脉内皮细胞中成纤维细胞生长因子的影响
许多研究表明纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)在动脉粥样硬化病变处的表达增加.PAI-1可以通过促进细胞外基质积聚、促进血栓形成和调节平滑肌细胞迁移和增殖而促进动脉粥样硬化的发展[1],因此,降低动脉壁PAI-1表达有可能延缓动脉粥样硬化的发展.我们观察了构建的PAI-1反义RNA重组质粒转导入离体培养的猪主动脉内皮细胞(EC)后,表达的PAI-1反义RNA对细胞中PAI-1表达的作用及对成纤维细胞生长因子(FGF)的影响.
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SFTS病毒非结构蛋白重组质粒的构建及其体液免疫原性研究
目的 研究SFTS病毒(SFTS virus,SFTSV)的非结构蛋白(Nonstructural proteins,NSs)重组质粒的体液免疫原性.方法 利用聚合酶链反应法(Polymerase chain reaction,PCR)构建真核表达质粒pJW4303-NSs、pJW4303-NSs-opt、pJW4303-NSs-Flag;引入Nhe Ⅰ酶切位点及tPA(Tissue plasminogen activator,tPA)信号肽,构建质粒pJW4303-tPA-NSs-opt.将质粒转染至HEK 293T细胞,蛋白质印迹法(Western blot,WB)验证NSs表达.NSs相关质粒免疫BALB/c小鼠,采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测SFTSV NSs特异性IgG抗体.结果 成功构建了重组NSs质粒,WB验证了NSs可在HEK293T细胞内表达.pJW4303-NSs、pJW4303-NSs-opt、pJW4303-tPA-NSs-opt重组质粒均可诱导小鼠体内产生特异性IgG,其中单优化型质粒pJW4303-NSs-opt的免疫原性较好,在第6、8周的IgG水平显著高于野生型NSs质粒,差异具有统计学意义.结论 本研究构建的SFTSV的NSs重组优化型质粒具有良好体液免疫原性,其中单优化型效果佳.
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瘤体内直接注射mIL-21基因抑制小鼠实验性淋巴瘤生长及其机制的初步研究
IL-21的生物学功能比较广泛,能促进骨髓中的NK细胞增殖与分化并表达CD16分子,与抗CD40单克隆抗体(McAb)协同可刺激B细胞增殖,与抗CD3 McAb协同可刺激T细胞增殖.我们利用先前构建的含小鼠IL-21基因重组质粒pcDNA3.1/mIL-21,直接在小鼠皮下Sp2/0肿瘤模型的瘤体局部注射治疗,探讨IL-21能否在肿瘤的基因治疗中发挥一定的作用,从而寻找新的用于肿瘤治疗的生物应答调节剂.
