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双酶切和同源重组方法构建pMIR-reporter载体的比较
目的 以pMIR reporter为载体骨架,通过双酶切方法和同源重组方法构建载体,比较两种不同载体构建方法的优缺点.方法 双酶切方法使用HindⅢ和MluⅠ两种限制性内切酶分别酶切pMIR-reporter和经T A克隆后靶基因PCR片段,形成带有相同粘性末端的线性载体片段和PCR片段,然后利用T4 DNA连接酶连接,连接产物转化大肠埃希菌感受态细胞,转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平扳进行阳性单克隆筛选并测序.同源重组方法利用同源重组原理,通过重组酶将靶基因PCR片段和经HindⅢ酶切pMIR-reporter线性载体重组连接,连接产物转化入大肠埃希菌感受态细胞中,转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平饭进行阳性克隆筛选并测序.结果 从载体构建耗时、总步骤数和阳性率三方面进行比较,双酶切载体构建方法需要26个独立试验,试验净耗时96h,阳性率为95%;同源重组法需要14个独立试验,试验净耗时33h,阳性率为70%.结论 双酶切载体构建方法步骤繁琐.同源重组法步骤相对简单,可以高效快速地构建载体,但是假阳性率略高.
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聚合酶链反应改良技术及其用途
80年代中期出现了一种新技术,称为聚合酶链反应(Polymerase chain reation,PCR),其基本原理是在目的基因的两端人工合成两段寡核苷酸引物,在提取于水生嗜热菌中的DNA聚合酶TaqI作用下,以溶液中4种脱氧核苷酸为原料,以待测的目的基因为模板,在人工控制的变性温度、复性温度及延伸温度条件下,于短期内完成目的基因的体外扩增。PCR技术诞生之初基本的用途之一是基因诊断。近随着分子生物学及分子遗传学的进步,针对PCR系统中模板取材、引物设计的改良及PCR产物的不同运用,PCR技术及其用途被多层面、全方位地发展了,从而也显示了PCR技术在生命科学不同领域中运用的强大功能。本文首先就普通PCR技术在各环节的革新方式作一简介,再例举不同PCR改良技术在各研究领域的运用。1 针对PCR技术各环节的革新措施1.1 引物的改良 引物的设计和选择是PCR技术的重要部分,直接关系到PCR的敏感性和特异性,通常需要了解基因背景信息而设计合成引物。随着所合成引物可裁信息量的增加,引物的职能也在不断增加,除了引导脱氧核糖核酸按模板限定聚合外,还可制造出特定的结构以便PCR产物进一步用于基因片段克隆及或基因突变位点的鉴定。如对裂殖子表面蛋白1的17区基因片段(MSP1-17)的PCR扩增,其引物设计时,在正向引物上设计有SalⅠ限制性内切酶位点及起始码,反向引物上设计有BamHⅠ限制性内切酶位点及终止码,由这对引物引导合成的DNA片段属于MSP-17基因,经SalⅠ和BamHⅠ双酶切后的回收片段能与被同样双限制性内切酶切的puc18质粒载体重组[1]。此处的引物的所含的4个功能序列为终得到MSP1-17基因片段的克隆提供了便利。又如,对恶性疟原虫二氢叶酸还原酶(DHFR)基因进行多态研究时,所用PCR引物F/3′末端以个别碱基替换的机制生成了DraⅠ限制性内切酶位点,通过相应限制性内切酶切后能灵敏地检测出该164号密码子为编码异亮氨基酸多态[2]。又如,为了能直接从PCR扩增产物的指纹图鉴定恶性疟原虫多药抗性基因(Pfmdr1)片段的多态性,使DCW3引物3′末端的碱基以替换方式产生TAT序列,带该3′末端序列的引物只能扩增可与该引物产生全面互补、且含酪氨酸编码序列多态的Pmdr1基因,从而对PCR产物的电泳分析就能鉴别酪氨酸编码的存在[3]。另外,在PCR引物末端带上某种配体,以便PCR通过配体结合机制与别的系统联结,如扩增恶性疟原虫SSUrRNA基因序列中疟原虫种特异保守序列的引物5′末端结合有生物素,带有生物素的PCR产物与包被在聚乙氯烯板上的亲和素结合,结合体可在荧光素标记的寡核苷酸探针介导下与ELISA系统相接[4]。这种对引物的改良所建立的有PCR参予的系统其敏感性、特异性均高于一般PCR。
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PCR结合酶切和微流控电泳检测载脂蛋白CⅢ基因C-482T多态性
载脂蛋白CⅢ(apo CⅢ)由79个氨基酸残基组成,其相对分子质量为8 800,主要在肝脏中合成,小肠中也有少量表达.apo CⅢ通过抑制脂蛋白脂肪酶(LPL)、肝脂酶(HL)以及受体活性影响血浆富含甘油三酯脂蛋白(rrRL)的代谢,apo cⅢ通过表达可延缓TRL如乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)脂解的速度,从而引起高甘油三酯血症(HTG).
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霍乱弧菌O1群和O139群SXT基因扩增及其酶切分型
霍乱是一种烈性传染病,其致病菌为霍乱弧菌[1].根据菌体(O)抗原的不同,霍乱弧菌已被分为200个以上的O血清群[2],其中只有O1和O139群能引起霍乱大流行,其他群主要引起散发[3-5],因此,关于霍乱弧菌的检测包括O1群和O139群.霍乱弧菌的快速检测对控制霍乱流行及治疗有重要的意义.
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一种快速等温检测核酸目标序列方法的建立
基因诊断技术因其灵敏性和特异性较高,问世后即得到广泛运用[1].目前,基因检测主要为PCR和核酸杂交为基础的两类方法.我们建立一种经核酸杂交和切刻内切酶酶切[2-3]的快速等温核酸检测方法(rapid isothermal detection and amplification,RIDA),并对其方法学性能进行评价.
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人类抗凋亡基因survivin的克隆及其原核表达
目的:克隆人类抗凋亡基因survivin(SVV),实现SVV基因在大肠杆菌中的高效表达.方法:提取胃癌细胞系SGC-7901总RNA,RT-PCR扩增人SVV全长cDNA,克隆于载体pGEM-T,酶切、测序鉴定.将人类SVV基因全长cDNA克隆入原核表达载体pRSET,实现该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达.结果:得到人SVV基因全长cDNA,经测序与SVV基因的已知序列相同,原核表达所获融合蛋白经SDS-PAGE电泳与已知SVV基因的蛋白质表达产物大小相近.结论:克隆出人SVV基因的全长cDNA,并克隆入原核表达载体pRSET,并在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.
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端粒酶核酶真核表达质粒pBBS212Rz的构建与鉴定
目的:构建含人端粒酶RNA(hTR)核酶基因的真核表达质粒pBBS212Rz,为以端粒酶为靶点的基因治疗消化系肿瘤研究奠定基础.方法:将人工合成的端粒酶核酶基因通过基因重组定向克隆插入到真核表达质粒载体pBBS212中.根据260nm的紫外光吸收值计算重组质粒pBBS212Rz浓度.结果:端粒酶核酶基因成功地定向插入了载体pBBS212,经酶切后用聚丙烯凝胶电泳鉴定确认.重组质粒浓度为1.77 g/L.结论:成功构建了含人端粒酶RNA(hTR)核酶基因的真核表达重组质粒pBBS212Rz.
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复制缺陷型HCV C基因腺病毒表达载体的构建包装及鉴定
目的:构建能表达HCV C基因的复制缺陷型腺病毒表达载体.方法:将HCV H株C区基因定向插入到腺病毒穿梭质粒pAd.CMV-Link.1中,获得重组质粒pAd.HCV-C,再与pJM1 7共转染293细胞,包装腺病毒表达载体.通过酶切、PCR及测序对穿梭质粒进行了鉴定.对腺病毒载体进行了感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定.利用间接免疫荧光法和Western blot检测了腺病毒载体在人肝癌细胞HepG2中的表达.结果:酶切、PCR及测序鉴定证实,穿梭质粒插入片段为HCV C区基因.包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带HCV C区基因,并可以在HepG2细胞中表达HCV C抗原.结论:包装成功的复制缺陷型腺病毒载体可以在HepG2细胞中表达HCV C抗原,为丙型肝炎的基因治疗及疫苗的进一步研究奠定了基础.
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小鼠甲胎蛋白基因的克隆真核表达载体构建及表达鉴定
目的:克隆小鼠甲胎蛋白(AFP)基因,构建小鼠AFP真核表达载体并进行表达鉴定.方法:从Hepal-6细胞中提取总RNA进行RT-PCR,克隆出小鼠AFP基因,亚克隆于pcDNA3.1载体,重组阳性克隆进行酶切和测序鉴定.重组质粒瞬时转染CHO-K1细胞,Western blot检测小鼠AFP的表达.结果:利用RT-PCR从Hepal-6细胞总RNA中成功克隆出1.8kb的小鼠AFP基因,重组阳性克隆经酶切和测序鉴定证实目的基因已正确插入pcDNA3.1载体中,Western blot结果证实重组质粒pmAFP能够在CHO-K1细胞中正确表达.结论:小鼠AFP真核表达载体构建成功,为进一步研究其在肝癌免疫治疗中的作用奠定了基础.
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降钙素受体基因多态性与绝经后妇女骨质疏松的相关性探讨
几个多态性的基因通过相互作用调节骨钙的流动,降钙素受体(CTR)基因是其中之一[1].CTR基因有7个潜在的区域在7种组织中表达[2].1997年日本的Nakamura等[3]发现,CTR基因在第1 377个核甘酸表达脯氨酸(CC型)或亮氨酸(TT型),经过限制性核酸内切酶(Alu-Ⅰ)酶切呈限制片段长度多态性,杂合型为TC.本实验采用聚合酶链反应(PCR)限制片段长度多态性(RFLP)技术,检测65例绝经后骨质疏松的老年妇女和238例绝经后非骨质疏松的老年妇女CTR基因型,旨在探讨CTR基因多态性与骨质疏松的相关性.
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用RT-PCR方法从人胎肝细胞内克隆VEGF基因的研究
血管内皮细胞生长因子具有维持血管正常功能,促进血管内皮细胞增殖,提高血管通透性,改变细胞外基质的等作用,与创伤组织的修复和血管生成密切相关.为此,本研究利用RT-PCR技术钓取VEGF基因的cDNA序列.具体方法是,用常规方法从胎肝组织中提取纯度高RNA后进行甲醛变性凝胶电泳;电泳结束后,在紫外灯下可看见凝胶上有28s和18s两条清晰的电泳带,其亮度之比约为2:1,这显示:获得的RNA较完整,没有降解.取适量胎肝细胞总RNA,遵循PolyATtract(mRNA Isolation System的操作要求分离纯化mRNA后,以Oligo(dT)为引物,遵循cDNASynthesis System操作步骤合成dscDNA.根据文献报道的VEGF基因序列,用Goldkey软件设计的PCR反应体系中的上下游引物,它们分别为:上游引物为:5'-CGGCTAGCGC-CTCCGAAACCA TGAACT-3',下游引物为:5'-GGTAC-CTCACCGCCTCGGCTTGTCACATCT-3',两条引物5'端下画线碱基序列分别为NheI和KpnI的酶切位点.以逆转录反应的产物dscDNA为模板,用保真性强的pfu TaqDNA聚合酶进行扩增,其中设计的上下游引物浓度各为1mM,反应参数为:94℃变性30秒,60℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,共25循环,后于72℃继续保温5min,反应产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定.研究发现:经PCR反应后,获得的DNA片段长度为470bp左右,与预先实验设计相吻合.用干净的刀片切下含DNA片段的凝胶条,以PCR产物纯化试剂盒回收.纯化的DNA片段催化dATP加尾后,插入pGEM-T-Easy克隆载体中,构建的重组体转化DH-5a细菌,筛选出的阳性克隆命名为pT-VEGF.提取的重组质粒DNA,用限制性内切酶NheI和KpnI进行双酶切鉴定,酶切得到470bp大小的DNA片段.这进一步表明:VEGF基因的cDNA序列已克隆成功.pT-VEGF阳性克隆在ABI377全自动测序仪上进行序列分析,结果显示:通过RT-PCR方法克隆出来的DNA序列,与Genebank网站上的人VEGF121的cDNA序列完全一致,由Kozak序列,转录起始密码子ATG,信号序列,编码序列和终止密码子等部分组成.因此,本研究克隆出了表达VEGF的cDNA序列,为下一步构建VEGF基因的表达载体,揭示VEGF作用的分子机制和体外大规模合成VEGF细胞因子奠定基础.
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电离辐射对EL-4细胞Caspase-3蛋白表达的影响
Caspase-3(cysteinyl aspartic acid protease-3)是人类白细胞介素1β转化酶家族的重要成员之一,是细胞凋亡过程中的重要激酶.在凋亡的执行阶段,Caspase-3负责对全部或部分关键性蛋白的酶切(激活或灭活).许多凋亡调节因子终作用于下游效应器Caspase-3,形成凋亡特征性改变[1].电离辐射可诱导多种正常组织和肿瘤组织发生凋亡.笔者采用流式细胞术系统研究了不同剂量X射线对Caspase-3蛋白表达的影响,从而为探讨电离辐射引起细胞凋亡机制提供一定的科学依据.
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我国马免疫球蛋白制品现状及展望
马免疫球蛋白(equine immunoglobulin)是用目标抗原免疫马匹后,产生抗该种抗原的抗体免疫球蛋白,经胃酶消化、纯化提取制得,分别用于各相应疾病的预防(被动免疫)和治疗. 基本原理是采用无致病性的致病物质多次免疫马匹,待免疫抗体达到较高滴度后,采血提取抗体免疫球蛋白IgG, 利用胃蛋白酶切掉无中和活性的Fc段,仅保留具有中和活性的抗体V形F(ab')2片段,利用其特异性中和致病原的功能进行疾病预防与治疗.
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B病毒PCR检测方法的建立
目的 建立B病毒核酸的PCR检测方法.方法 设计引物,用PCR方法扩增B病毒,并验证其灵敏性和特异性.结果 引物P1、P2及P3、P4在以B病毒为模板时有特定大小的目的 片段出现,在以其他病毒为模板时无目的 片段出现;引物P5、P6以B病毒和人单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSVI)为模板能扩增出382bp的产物,经SacⅡ酶切后,B病毒产生176bp和206bD的两个片段,HSVI无变化.结论 通过PCR方法成功的区分开B病毒,并且鉴定区分了B病毒和HSVI.
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中国汉族人凝血因子Ⅶ基因中三个多态位点的研究
近年来,凝血因子在动脉血栓形成中的地位倍受关注.研究表明,凝血因子Ⅶ(FⅦ)是动脉血栓形成的危险因子[1].遗传因素与环境因素对FⅦ有很大影响,遗传因素主要是FⅦ基因内的几个多态位点:FⅦ基因启动子区域0或10 bp的插入(5′F7)、内含子7中的可变数目串联重复序列(IVS7)及FⅦ蛋白催化区域353位谷氨酰胺代替精氨酸(R353Q).目前尚未见到中国人FⅦ基因内各个多态位点等位基因频率及基因型频率的系统报道,我们用PCR技术结合酶切方法进行了这方面的研究.
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血清生长激素与慢性肾衰竭的关系
生长激素(Growth hormone,GH)是由217个氨基酸组成的前生长激素经酶切去26个氨基酸的前肽后转变而成.GH主要的两个生理学功能是:间接促生长作用及直接促代代谢作用[1].慢性肾衰竭(Chronic renal failure,CRF)过程包括:肾小球肥大增生,肾小球硬化和间质纤维化,GH可加速肾小球硬化进程.本文研究的目的是通过对CRF患者GH的测定,了解其血清GH的变化及意义,并进一步探讨延缓患者肾功能恶化进展及提高患者生存时间的措施.
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重组蛋白酶切方法的比较与分析
目的 探讨制备纯化重组蛋白的酶切方法,比较不同蛋白纯化方法的差异.方法 在大肠杆菌BL-21中分别诱导表达pGEX-6p-3/CT1,pGEX-6p-3/CT3,pGEX-6p-3/CaM,pGEX-6p-3/CaMK Ⅱ.采用超声破碎、B-per试剂以及B-per试剂加变性复性试剂盒等方法制备带GST标签的融合蛋白,进一步在不同条件下使用蛋白酶进行酶切获得相应蛋白.将制备得到的蛋白进行SDS-PAGE电泳鉴定,同时,使用pull-down方法对蛋白活性进行鉴定.结果 采用B-per试剂以及变性再复性试剂盒,同时酶切时加入DTT,能得到较高浓度与纯度的CT1蛋白.而无论采用B-per试剂或超声破碎,只要酶切时加入DTT均能获得CT3蛋白.采用简单的超声破碎,酶切时不需加入任何试剂即可得到高浓度与高纯度的胞浆蛋白CaM,而目前仍没找到纯化CaMKⅡ蛋白的理想方法,需进一步的实验研究.结论 重组蛋白酶切纯化方法存在差异,DTT可能在酶切纯化蛋白时起到关键作用.
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大鼠C-sis基因克隆及其真核表达载体的构建
背景:原癌基因C-sis具有促进细胞增殖并抑制凋亡,进而促进组织修复的功能。假设C-sis可能在受损肝组织的修复和暴发性肝衰竭的治疗中发挥积极作用。
目的:构建pcDNA3.1/C-sis真核表达载体,检测其在大鼠正常肝细胞株BRL细胞和在体大鼠肝脏细胞中的表达。
方法:通过RT-PCR的方法克隆C-sis基因的选全长编码序列,构建pcDNA3.1/C-sis真核表达载体。鉴定无误后经脂质体介导转染到BRL细胞中,并通过将质粒注入尾静脉后导入大鼠肝脏。后通过荧光定量PCR和Western Blot鉴定其在BRL细胞和在体大鼠肝脏细胞中的表达。
结果与结论:①成功克隆了C-sis基因全长编码区;测序证明pcDNA3.1/C-sis重组真核表达载体构建成功;②将其转染至BRL细胞和在体大鼠肝脏,可使C-sis表达升高;③实验结果为后续研究C-sis基因对大鼠暴发性肝衰竭的影响提供了先决条件。 -
COX-2与防癌
一、COX-2与COX-1:两种同功酶的必要性由膜磷脂质以磷脂酶切断的游离花生四烯酸(AA)通过COX途径可生成前列腺素(PG)E2、PGF2α、PGD2、PGI2和凝血(口恶)烷(TX)A2等等一系列的类前列腺素(prostanoid).COX途径限速酶系PGH合成酶,一般简称"COX".
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人A组和B组鼻病毒3C蛋白表达、纯化及酶切活性验证
目的 在大肠埃希菌中表达人A组和B组鼻病毒(rhinovirus,RV)3C蛋白,纯化后检测其酶切活性.方法 分别将A组鼻病毒RV1B和B组鼻病毒RV6的3C蛋白编码基因克隆至原核表达载体pET-30a中,构建重组原核表达质粒pET-30a-1B-3C和pET-30a-6-3C,转化至E coli BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化.利用具有3C蛋白酶切位点的15VP1-6P蛋白,分析不同温度(4和37℃)下3C蛋白的酶切活性.结果 原核表达的目的蛋白为带His标签的可溶性蛋白,RV1B-3C蛋白相对分子质量约25 000,RV6-3C蛋白相对分子质量约23 000,纯度可达约70%.RV1B-3C和RV6-3C蛋白对15VP1-6P蛋白均具有酶切作用,而且在4和37℃均有酶切活性.结论 在大肠埃希菌中成功表达了具有酶切活性的A组和B组鼻病毒3C蛋白,为进一步研究鼻病毒的致病机制奠定了基础.