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食品中生物素检测方法概论
文章对于食品中生物素的国标测定方法微生物法进行综合阐述,对生物素检测试验前处理及操作过程中重要环节加以分析探讨,以确保实验结果的精度和准确度.
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生物素营养状况评价方法
生物素是一种水溶性维生素,是哺乳动物体内羧化酶的辅酶,参与糖脂和能量代谢.同时,生物素还参与基因表达、代谢和机体的生长发育过程.近年来有关生物素缺乏引起的机体健康营养状况改变的研究较多,尤其是孕期生物素缺乏对胎体致畸作用的发现,引起人们对生物素缺乏的广泛关注.然而,关于生物素营养状况评价方法存在较多的争议,没有统一的结论,本文对生物素营养状况评价方法进行综述.
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生物素对2型糖尿病大鼠血糖的影响
目的 探讨生物素对2型糖尿病大鼠血糖以及糖代谢关键限速酶葡萄糖激酶(GCK)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶1(PCK1)基因表达的影响.方法 90只健康Wistar大鼠根据血糖随机分为5组(正常对照组,模型组,生物素低、中、高剂量组).正常对照组给予普通维持饲料,蒸馏水灌胃;模型组给予高脂高糖饲料,蒸馏水灌胃;生物素各剂量组给予高脂高糖饲料同时分别给予生物素0.6、3.0和6.0 mg/kg BW灌胃.在高脂高糖饲料喂养2月后,应用小剂量链脲佐菌素腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型.于造模第10周进行OGTT实验后,处死大鼠.检测血糖、血清胰岛素、肝糖原、肌糖原等指标,用RT-PCR方法检测糖代谢关键限速酶GCK、PCK1基因的表达.结果 与模型组相比,生物素各剂量组对空腹血糖、血清胰岛素没有影响,但生物素高剂量组血糖曲线下面积明显下降(P＜0.05),餐后30 min血糖值也显著降低(P＜0.05).生物素中剂量组和高剂量组肌糖原含量明显下降(P＜0.05).生物素对糖代谢关键限速酶GCK、PCK1的表达有影响,分别出现了明显的基因表达上调和下调(P＜0.05).结论 生物素可能通过影响糖代谢关键酶GCK和PCK1的活性,促进糖酵解和糖原合成而抑制糖异生,从而影响餐后血糖应答.
关键词： 生物素 血糖 2型糖尿病 葡萄糖激酶 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶1 -
肿瘤标志在良恶性胸水鉴定的应用
目的:探讨胸腔积液肿瘤标志CEA、CA19-9、CA12-5、NSE、CYFRA21-1的检测在鉴别结核性胸积液与癌性胸积液的意义.方法:应用生物素-链霉亲和素双抗夹心法测定.
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高效液相色谱法测定保健食品中的生物素
为了测定保健食品中的生物素的含量,建立方便可靠的测定方法,采用高效液相色谱法对保健食品中生物素含量进行了测定.使用Hypersil ODS色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈+0.05 mol/L磷酸二氢钾(15+85,pH=3.5)为流动相,检测波长200 nm.方法的加标回收率为86.8%～106.0%,RSD为8.4%,低检出量为0.5 mg/kg.该方法简便、准确,有良好的重现性,技术参数指标符合食品理化分析的要求.
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高效液相色谱-串联质谱法同时测定复合维生素片中的叶酸和生物素
目的 建立高效液相色谱-串联质谱法同时定性和定量分析复合维生素片中叶酸和生物素的方法.方法 样品用水溶液溶解,经Eclipse C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)分离,流动相为0.1％甲酸溶液和乙腈梯度洗脱,流速0.2 ml/min,采用电喷雾离子源正离子模式,多反应监测(MRM)进行检测.结果 叶酸和生物素在5 min内得到较好的分离.叶酸和生物素的线性范围分别为42 ～523和47～583 ng/ml,线性回归方程分别为y=1157.63x-6698.38 (r2 =0.9999)和y=207.93x-3052.26 (r2 =0.998 2),低、中、高3个添加水平的回收率分别为99.9％～108.7％和90.1％ ～94.5％,相对标准偏差(RSD)均为1.0％(n=6),检出限分别为0.33和0.08.μg/g.结论 高效液相色谱-串联质谱法可靠、灵敏、准确,可用于复合维生素片中叶酸和生物素同时定性和定量分析.
关键词： 叶酸 生物素 高效液相色谱-串联质谱 复合维生素片 测定 -
让你精力旺盛的好食物②
(接上期)6.玉米玉米是大家经常食用的杂粮之一.中医认为玉米“味甘、淡,性平”,有开胃益智、宁心活血、调理中气等功效.玉米含有丰富的营养成分,而且几乎整株都有食疗的价值,其所含有的营养成分包括蛋白质、糖类、维生素E、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟碱酸、泛酸、生物素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄素、钙、磷、铁、镁、硒、卵磷脂、亚油酸等.
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建立引物双标记的聚合酶链反应-酶联免疫吸附法检测军团菌mip基因
建立一种新的检测嗜肺军团菌mip基因的引物双标记聚合酶链反应-酶联免疫吸附(PCR-ELISA)法,应用于豚鼠军团菌感染的早期检测和诊断.其方法是将一对嗜肺军团菌引物分别标记有生物素和异硫氰酸荧光素,经PCR扩增后,将标记有生物素的PCR扩增产物加入链酶亲和素包被的微孔板中,洗去未结合物后直接加入碱性磷酸酶标记的抗荧光素抗体,待与荧光素结合后,再加入底物产生显色反应,ELISA仪测得A值.
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"合谷"穴和口面部联系的解剖学基础
目的:用形态学的方法探讨"合谷"穴与口面部的传入联系.方法:本实验分神经生物素示踪和fos蛋白表达两部分,每部分均选用雌性Wistar大鼠24只.将神经束路示踪剂神经生物素分别注射于"合谷"穴区和口面部,观察标记纤维在颈段脊髓和低位脑干的分布.电针"合谷"穴和口面部,利用免疫组织化学的方法,观察其二者的传入信息在颈髓和低位脑干诱导的fos样免疫反应阳性神经元的分布.结果:"合谷"穴区的初级传入纤维主要止于颈髓5～8节段;来自口面部的初级传入纤维主要止于同侧三叉神经脊束核,尚有少量分支直接投射至同侧孤束核和网状结构.电针"合谷"穴的传入信息除主要到达颈部脊髓背角外,也可到达孤束核和网状结构;而电针口面部的传入信息主要抵达同侧三叉神经脊束核、孤束核和网状结构,也可影响到颈髓背角等结构的神经元.结论:"合谷"穴和口面部均与孤束核有着直接或间接的纤维联系,这可能是"合谷"穴和口面部联系的形态学基础.
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识别真假猪苓
猪苓又名豕零、野猪食，为多孔菌科植物猪苓的干燥菌核，南方全年皆可采收，北方多在夏、秋两季采收。野生猪苓隐生于地下，地上无苗，故寻找比较困难。据有经验的药农介绍，凡生长猪苓的地方，其土壤肥沃，发黑，雨水渗透也快，小雨过后地面仍显干燥，现在猪苓已能够人工培养栽种。挖出猪苓后去掉泥沙，晒干即可入药。猪苓性平，味甘淡，入脾、肾、膀胱经，含有麦角甾醇、生物素、糖类和蛋白质等成分，具有利尿渗湿的功效，用于治疗小便不利、水肿胀满、脚气、泄泻、淋浊、带下等症，为“渗湿气，利水道，分解阴阳之的药也。（《本草汇言》）”市场上有以某种植物的菌核冒充猪苓，使用时注意鉴别。
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β2-MG新型酶免疫分析方法研究
本文将通用固相二抗和生物素-亲和素系统应用于酶免疫分析中,成功地建立了β2-MG新型酶免疫分析方法.该方法的各项指标均可满足临床检测的要求,其优点是:二抗包被板可以通用、保存期长、节省抗体,检测方法的灵敏度高、精密性好.
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IgG4酶联免疫分析的建立及初步应用
用兔抗人IgG4的多克隆抗体(IgG4Ab)包被成固相板,以识别结合待测标本中的IgG4.用生物素标记IgG4Ab得Bio-IgG4Ab;用亲和素标记辣根酶得HRP-A.在已包被IgG4Ab的固相板中加入IgG4标准品(或待测样品),反应、洗涤后,加入Bio-IgG4Ab,反应、洗涤后,加入HRP-A,反应、洗涤后,板上形成IgG4Ab-IgG4-Bio-IgG4Ab-HRP-A复合物,加酶底物显色,用酶标仪在490 nm波长测定OD值,作标准曲线,根据标准曲线,查出标本中IgG4含量.该法测定范围:2.5～200ng/mL,低检出量2.1ng/mL,批内和批间CV分别8.4%和11.2%.测得血清IgG4含量:青年人(30名)为37.7±2.3ng/mL;30名献血员为42.7±9.9ng/mL,49例重症监护患者明显升高为71.2±9.2ng/mL;49例肺部感染患者明显降低为28.4±9.2 ng/mL.结果表明该法稳定,灵敏度适于检出人血清IgG4水平.
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生物素-亲和素预定位技术在肿瘤诊断和治疗中的应用
预定位概念首先由Goodwin等[1]提出,是针对放射性核素标记的抗体类药物而言的.在预定位治疗中,放射性核素和单克隆抗体是分开施用的.首先施用未标记单抗,给予足够时间后使其在肿瘤组织聚集达到大值,然后特别是在血液中的单抗被清除以后,使肿瘤结合抗体和体内未结合抗体之比达到大,施用携带放射性核素且能够与单抗特异性结合的小分子物质,将放射性核素带到肿瘤部位,达到肿瘤显像、治疗和降低本底的目的.
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人生长激素的生物素-亲和素放大酶联免疫法的建立
为建立有生物素和亲和素放大系统的人血清生长激素(hGH)酶联免疫分析法(BA-ELISA),以微量的GH抗原免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤技术制备出29株分泌抗hGH单克隆抗体(MCA)的杂交瘤株.选择佳配对MCA,利用亲和素与生物素高亲和力的特性,建立了血清hGH双位点的BA-ELISA法.我们的MCA滴度为(0.5 ～ 50.0)×104,亲和常数Ka=(0.13～1.40)×1010L/mol.血清hGH的ELISA的灵敏度为0.04±0.01 μg/L;在血清中分别加入1,2.5,5μg/L的hGH,其回收率为 90.7%～107.6%(平均为 101.20% ±0.03 %);hGH含量为2.8、10.0、29.8μg/L 的血清批内、批间变异系数分别为4.9%、3.8%、7.9%和6.2%、3.5%、9.5%;用本法测定了正常儿童、生长激素缺乏症(GHD)患儿和活动性肢端肥大症患者空腹血清hGH水平,分别为1.87±3.0、0.30±0.42和8.71±6.95 μg/L.上述结果表明,本ELISA方法灵敏、特异、稳定、准确,能确切反映hGH分泌功能,在诸多方面均优于RIA.
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扣带素--调节血管内皮细胞屏障功能的新靶点
血管内皮细胞间连接顶端的紧密连接是构成旁细胞屏障的重要结构。紧密连接由跨膜蛋白和胞浆蛋白组成，其中胞浆蛋白作为桥梁连接跨膜蛋白和细胞骨架蛋白，因此在决定紧密连接结构的完整性中发挥了重要的作用。然而目前，关于血管内皮中特异性表达的重要胞浆蛋白的研究仍十分有限。扣带素（cingulin）是1988年发现的一种紧密连接胞浆蛋白，已有研究表明 cingulin 在上皮细胞中参与调控紧密连接跨膜蛋白的表达以及细胞的增殖能力。然而，cingulin 在血管内皮中的作用尚不清楚。作者首先使用免疫组化和免疫荧光技术检测到人皮肤、脑和肺组织的血管内皮上存在 cingulin 特异性的表达，其与经典的紧密连接粘连蛋白（zonula occludens-1，ZO-1）存在共定位。在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中过表达 cingulin 可增加紧密连接链的长度，增加跨内皮细胞电阻值，并降低分子量为376 Da 和70000 Da 荧光示踪分子的通透性；而在敲低 cingulin的小鼠内皮细胞中，低分子量荧光示踪分子的通透性显著增加，这提示 cingulin 可经促进紧密连接的形成进而增强内皮细胞的旁细胞屏障功能。进一步，作者在 cingulin 敲除小鼠中通过尾静脉注射生物素（作为旁细胞途径示踪分子）后发现，菱形窝下缘后区的神经元以及浦肯野细胞均呈现生物素阳性染色，提示在这些部位的血脑屏障受到了破坏。以上结果表明，cin-gulin 可调控血管内皮细胞的屏障功能，其机制与调节紧密连接结构的形成和稳定性有关，这为将来治疗脑和外周器官的血管渗透综合症提供了新思路。
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聚合酶链反应改良技术及其用途
80年代中期出现了一种新技术,称为聚合酶链反应(Polymerase chain reation,PCR),其基本原理是在目的基因的两端人工合成两段寡核苷酸引物,在提取于水生嗜热菌中的DNA聚合酶TaqI作用下,以溶液中4种脱氧核苷酸为原料,以待测的目的基因为模板,在人工控制的变性温度、复性温度及延伸温度条件下，于短期内完成目的基因的体外扩增。PCR技术诞生之初基本的用途之一是基因诊断。近随着分子生物学及分子遗传学的进步，针对PCR系统中模板取材、引物设计的改良及PCR产物的不同运用，PCR技术及其用途被多层面、全方位地发展了，从而也显示了PCR技术在生命科学不同领域中运用的强大功能。本文首先就普通PCR技术在各环节的革新方式作一简介，再例举不同PCR改良技术在各研究领域的运用。1 针对PCR技术各环节的革新措施1.1 引物的改良 引物的设计和选择是PCR技术的重要部分，直接关系到PCR的敏感性和特异性，通常需要了解基因背景信息而设计合成引物。随着所合成引物可裁信息量的增加，引物的职能也在不断增加，除了引导脱氧核糖核酸按模板限定聚合外，还可制造出特定的结构以便PCR产物进一步用于基因片段克隆及或基因突变位点的鉴定。如对裂殖子表面蛋白1的17区基因片段（MSP1-17）的PCR扩增，其引物设计时，在正向引物上设计有SalⅠ限制性内切酶位点及起始码，反向引物上设计有BamHⅠ限制性内切酶位点及终止码，由这对引物引导合成的DNA片段属于MSP-17基因，经SalⅠ和BamHⅠ双酶切后的回收片段能与被同样双限制性内切酶切的puc18质粒载体重组［1］。此处的引物的所含的4个功能序列为终得到MSP1-17基因片段的克隆提供了便利。又如，对恶性疟原虫二氢叶酸还原酶（DHFR）基因进行多态研究时，所用PCR引物F/3′末端以个别碱基替换的机制生成了DraⅠ限制性内切酶位点，通过相应限制性内切酶切后能灵敏地检测出该164号密码子为编码异亮氨基酸多态［2］。又如，为了能直接从PCR扩增产物的指纹图鉴定恶性疟原虫多药抗性基因（Pfmdr1）片段的多态性，使DCW3引物3′末端的碱基以替换方式产生TAT序列，带该3′末端序列的引物只能扩增可与该引物产生全面互补、且含酪氨酸编码序列多态的Pmdr1基因，从而对PCR产物的电泳分析就能鉴别酪氨酸编码的存在［3］。另外，在PCR引物末端带上某种配体，以便PCR通过配体结合机制与别的系统联结，如扩增恶性疟原虫SSUrRNA基因序列中疟原虫种特异保守序列的引物5′末端结合有生物素，带有生物素的PCR产物与包被在聚乙氯烯板上的亲和素结合,结合体可在荧光素标记的寡核苷酸探针介导下与ELISA系统相接［4］。这种对引物的改良所建立的有PCR参予的系统其敏感性、特异性均高于一般PCR。
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生物素化HCV多抗原表位融合基因的克隆及可溶性表达
为了建立丙型肝炎病毒抗体(HCV-Ab)的双抗原夹心ELISA检测方法,克隆表达带有生物素标签的HCV多种抗原优势表位融合蛋白,选取HCV各抗原如Core,NS3,NS4,NS5和E的优势抗原表位片段编码序列,克隆重组为融合基因,插入PinpointTMXa-1 T栽体中诱导表达,并用Westem blot进行抗原性及标签生物素活性鉴定;表达抗原经Promega SoftLink Soft Release Avidin Resin系统亲和层析纯化后包被酶联板,用抗HCV单片段抗体阳性血清对表达融合蛋白各区的抗原性作间接ELISA法鉴定.结果显示:成功构建了带有生物素标签的HCV多抗原表位融合基因表达载体,该载体可在JM109(DE3)中可溶性表达目的蛋白,表达产物携带生物素标签,融合的各片段区均具有良好的抗原性.结论:所构建融合抗原可可溶性表达,可以用作双抗原夹心ELISA的酶标抗原,所含生物素标签也可用作酶联检测的生物素-亲和素信号放大系统.
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加热抗原修复对内源性抗生物素蛋白结合物的影响及其对策
目的深入研究加热抗原修复对内源性抗生物素蛋白结合物(EABA)的影响程度和范围,以及探讨消除EABA对免疫组织化学染色干扰的对策或方法.方法采用高效、快捷的组织芯片技术、微波加热处理法、免疫组织化学SP染色法及蛋清液封闭法,对甲醛固定石蜡包埋的76种(102份)人体正常组织和88种(577份)人体肿瘤组织以及4种(80份)大鼠正常组织标本进行系统性EABA检查,同时对9种(15份)人体冷冻组织进行EABA检查.结果 (1)冷冻组织中存在EABA;(2)经甲醛固定石蜡包埋后组织中的EABA被封闭;(3)加热抗原修复可造成EABA暴露;(4)EABA暴露的强度各不相同,强者可到强阳性;(5)EABA在组织中的分布形式,既有散在分布也有弥漫分布,主要以颗粒状形式存在于胞质中;(6)EABA广泛存在于上皮源性组织,特别是腺上皮组织(包括正常组织和肿瘤组织),亦存在于部分非上皮组织;(7)EABA暴露的强弱与修复液亦有关,EGTA(pH 9.0)的暴露能力较柠檬酸(pH 6.0)和乙二胺四乙酸二钠(pH 8.0)更强;(8)加热抗原修复暴露的EABA可以被20%蛋清液封闭.结论加热修复可使甲醛固定石蜡包埋组织中的EABA重新暴露,暴露的EABA可广泛见于人体正常和肿瘤组织细胞中,也见于大鼠正常肝、肾、肺、胰组织中,因而可能对正常免疫组织化学染色造成干扰;暴露的EABA可被蛋清液封闭,或采用非生物素检测系统,达到消除EABA对正常免疫组织化学染色干扰的目的.
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循环引物介导原位标记技术在结直肠癌检测中的应用
引物介导的原位DNA标记(PRINS)是分子生物学领域近年来发展的一项新技术,具有方便、特异性强、敏感性高的优点[1-4].然而,我们在实验中发现单纯的PRINS技术对检测样本拷贝数有着较高的要求,尤其是石蜡切片中mRNA拷贝数量很低,阳性信号表达较弱.为提高检测效果,我们采用PRINS与PCR技术相结合的新方法--循环引物介导的原位标记(cycling-PRINS,C-PRINS),生物素连接辣根过氧化物酶标记,DAB显色法,以提高石蜡切片检测mRNA表达的敏感性.
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鼻咽癌血清学检测方法的改进
目的 改进现有鼻咽癌血清学早期诊断方法,提高检测灵敏度.方法 用链霉亲和素.生物素放大免疫酶法与既有常规免疫酶法对鼻咽癌防治示范基地所取294份普查血清IgA/VCA,IgA/EA抗体进行血清学检测,并用SPSS统计软件对检测结果进行χ2检验和t检验.结果 共检测30岁以上294份普查人群血清,其中鼻咽癌患者血清106份,健康人血清188份.改进的链霉亲和素一生物素放大免疫酶法与既往已有的免疫酶法相比,血清IgA/VCA、IgA/EA抗体的检测阳性率增加;检测血清抗体的几何平均数明显提高.结论 改进方法可以提高血清学检测的灵敏度,同时保证了检测结果的特异性,提高了鼻咽癌的检出率,可以应用于鼻咽癌早期筛查工作.
