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扣带素--调节血管内皮细胞屏障功能的新靶点
血管内皮细胞间连接顶端的紧密连接是构成旁细胞屏障的重要结构。紧密连接由跨膜蛋白和胞浆蛋白组成，其中胞浆蛋白作为桥梁连接跨膜蛋白和细胞骨架蛋白，因此在决定紧密连接结构的完整性中发挥了重要的作用。然而目前，关于血管内皮中特异性表达的重要胞浆蛋白的研究仍十分有限。扣带素（cingulin）是1988年发现的一种紧密连接胞浆蛋白，已有研究表明 cingulin 在上皮细胞中参与调控紧密连接跨膜蛋白的表达以及细胞的增殖能力。然而，cingulin 在血管内皮中的作用尚不清楚。作者首先使用免疫组化和免疫荧光技术检测到人皮肤、脑和肺组织的血管内皮上存在 cingulin 特异性的表达，其与经典的紧密连接粘连蛋白（zonula occludens-1，ZO-1）存在共定位。在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中过表达 cingulin 可增加紧密连接链的长度，增加跨内皮细胞电阻值，并降低分子量为376 Da 和70000 Da 荧光示踪分子的通透性；而在敲低 cingulin的小鼠内皮细胞中，低分子量荧光示踪分子的通透性显著增加，这提示 cingulin 可经促进紧密连接的形成进而增强内皮细胞的旁细胞屏障功能。进一步，作者在 cingulin 敲除小鼠中通过尾静脉注射生物素（作为旁细胞途径示踪分子）后发现，菱形窝下缘后区的神经元以及浦肯野细胞均呈现生物素阳性染色，提示在这些部位的血脑屏障受到了破坏。以上结果表明，cin-gulin 可调控血管内皮细胞的屏障功能，其机制与调节紧密连接结构的形成和稳定性有关，这为将来治疗脑和外周器官的血管渗透综合症提供了新思路。
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荧光示踪法原位观察大黄蒽醌的骨靶向-抗骨质疏松作用
目的：探讨游离大黄蒽醌类化合物对糖皮质激素诱导性骨质疏松大鼠的骨靶向抗骨质疏松作用。方法采用荧光示踪法观察游离大黄蒽醌类化合物在糖皮质激素诱导的大鼠骨质疏松模型股骨远端骨骺部位对称剖面的荧光，并将其与同位的骨密度（ BMD）和骨矿量（ BMC）进行关联分析，4月龄雌性SD大鼠126只随机分成泼尼松组（ Pred）、泼尼松加大黄蒽醌组（ Pred＋FAQ）和正常对照组（ CON），每个组设7个时间点，灌服给药时间长13 w。以pQCT骨密度仪分别测定各组各时间点大鼠股骨远心端（2 mm）的骨密度和骨矿量，再以荧光显微镜采集Pred＋FAQ组各时间点骨标本骨骺部位对称剖面的荧光图像。结果 Pred＋FAQ组股骨远心端的骨密度相对Pred组均显著增加（ P＜0.05），但Pred＋FAQ组各时间点骨标本骨骺部位对称剖面的荧光强度随骨骺“生长-闭合”周期而“上升-消除”，与骨标本的骨密度无显著相关，骨矿量（ BMC）也与骨标本的骨密度无显著相关。结论游离大黄蒽醌可以预防糖皮质激素性骨质疏松，具有荧光的游离大黄蒽醌类原型化合物在大鼠股骨中无显著的蓄积现象和骨靶向作用。实验为从骨组织原位药效动力学与药代动力学相关联（ pD-pK link）角度探索骨靶向抗骨质疏松成分作了有益的尝试。
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颈椎小关节囊的神经支配及其临床意义
目的:研究颈椎小关节囊的神经支配来源及其通路,为阐明小关节损伤后弥漫性头颈肩部疼痛的机制及其治疗提供依据.方法:39只SD雄性大鼠,分为颈交感神经未切除组(A组,18只)、切除组(B组,18只)及对照组(C组,3只),A、B组分别于C1-2、C3-4或C5-6(各6只大鼠)小关节囊内注射5%双苯甲亚胺(Bb)0.6μl,C组注射等量生理盐水.8h后检查各组C1～C8脊神经节(DRG)和交感神经节(SG)的荧光标记细胞,并作统计学分析.结果:A组脊神经节和交感神经节内均可见到荧光标记细胞,其中,C1-2和C3-4关节囊内注射组的C1～C8 DRG内有Bb(+)细胞,C5-6关节囊内注射组的C3～C8 DRG内可见Bb(+)细胞;B组注射节段和相邻节段Bb(+)细胞无明显减少,但远节段的Bb(+)细胞明显减少;C组未见Bb(+)细胞.结论:颈椎小关节囊神经支配来源于感觉和交感神经系统,脊神经节和交感神经节间有神经纤维联系,在临床上阻断脊神经和交感神经有可能缓解患者的头颈肩痛症状.
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荧光示踪PLGA纳米粒与HL60细胞间相互作用
目的 纳米粒作为药物载体在临床诊断和治疗中有着广泛的研究和应用,其跨细胞膜进入细胞内部的过程与其生物效应直接相关,研究纳米粒与细胞间相互作用可揭示其相关机制.方法 通过荧光示踪法研究荧光素标记的PLGA纳米粒与HL60细胞间相互作用,采用激光共聚焦显微镜定量分析了纳米粒的入胞进程.结果 PLGA纳米粒与HL60细胞间相互作用具有很强的温度依赖性,其中受体介导的细胞内吞机制在纳米粒的入胞过程中起到了重要作用.结论 PLGA纳米粒与HL60细胞间相互作用的研究为纳米药物的设计和应用提供了一定的理论基础.
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超顺磁氧化铁制备及在生物医学领域的应用
背景：超顺磁氧化铁在生物医学领域应用非常广泛，尤其是靶向诊断和治疗方面。目的：总结超顺磁氧化铁的理化性质、制备方法、表面改性、产品检测及其在生物医学领域的应用。方法：以“superparamagnetic iron oxide，preparation，coprecipitation，surface modification，magnetic resonance imaging contrast agent，fluorescent tracing，targeted therapy”为检索词，检索2000至2012年Sciencedirect、PubMed数据库的文献；以“超顺磁氧化铁，制备，表面改性，磁共振，荧光示踪，靶向诊断，靶向治疗”为检索词，检索2006至2014年CNKI、万方数据库的文献。结果与结论：超顺磁性纳米颗粒能够通过实验室的方式制备出来，制备方法包括水热法、气相沉淀法、机械球磨法、液相微介质电加热法、溶胶-凝胶法、乳化法、共沉淀法等，并且能够通过表面改性及修饰使其具备不同的特性，应用于生物医学的多个领域，如磁共振对比剂、荧光示踪、纳米颗粒靶向治疗、磁热疗及生物分离等。
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PKH-26标记ADSCs示踪技术在构建组织工程周围神经中的应用
目的 探讨荧光染料PKH-26在构建组织工程周围神经中作为细胞示踪剂的可行性.方法 取新西兰大白兔颈背部脂肪组织分离,培养脂肪干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs),用荧光染料PKH-26进行标记,荧光显微镜观察并采用流式细胞仪检测标记率,MTT法检测细胞增殖活性；体外成骨、成脂及成软骨诱导鉴定细胞的多向分化潜能；将PKH-26标记后的ADSCs采用显微注射法植入改良脱细胞神经支架上构建组织工程化周围神经,体外培养1、2、4周后采用电镜及冰冻切片技术,观察细胞在支架内存活、迁移的情况.结果 PKH-26能有效标记ADSCs,标记率为95.12％；MTT法检测及成骨、成脂、成软骨诱导结果显示,PKH-26标记对细胞增殖及多向分化潜能没有影响；在体外培养环境下,ADSCs能在脱细胞神经支架上生长并沿着支架迁移,荧光可存留4周以上.结论 PKH-26标记ADSCs可作为一种体外构建组织工程化周围神经短期示踪的有效手段.
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纳米β-磷酸三钙/胶原复合体修复兔颌骨缺损的研究
目的研究纳米β-磷酸三钙/胶原复合体(N-TCP/Co)修复兔下颌骨缺损的效果.方法新西兰长耳白家兔6只,在双侧下颌骨制备1.2 cm×2.5cm缺损区,将自制N-TCP/Co复合体材料植入兔一侧下颌骨缺损区,另一侧设置为空白对照,3个月后摄X线片并处死实验动物,以肉眼观察、石蜡切片及硬组织切片观察成骨情况.结果3个月后家兔实验侧X线片可见骨缺损区无明显透射影像,无明显边界,对照侧透射影像明显,边界清楚;大体观察可见实验侧骨创基本愈合,新生骨组织充满手术区,对照侧软组织充满缺损区;石蜡切片可见实验侧有大量成骨细胞;硬组织切片四环素荧光染色可见网状新生骨基质沉积.结论自制的N-TCP/Co复合体可有效成骨,重建修复家兔颌骨缺损.
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荧光示踪法在体实验研究逆行岛状皮瓣静脉回流
目的 用荧光示踪法研究逆行岛状皮瓣的静脉回流,探讨静脉回流的规律.方法 40只新西兰大白兔,每只取耳静脉血各0.1 ml,分离红细胞、FITC标记及检测.40只新西兰大白兔后肢建立隐动静脉逆行岛状筋膜皮瓣模型,每只将一侧后肢随机设定为实验组,对侧即为对照组,对照组制备相同皮瓣,但不注射示踪剂.实验组按照皮瓣制备的时间不同分成A、B、C、D 4组,再根据注入示踪剂途径的不同,分为动脉和静脉2个亚组.取标记好的红细胞悬液5 μl,在各组分别通过静脉和动脉注入.5 s后取下皮瓣立即冷冻,分别自血管蒂的远段、中段和近段,采用连续的3张冰冻切片(5～7 μm),其中2张行HE染色和GENMED神经染色,另1张不染色直接压片.显微镜观察荧光分布.结果 FITC标记的红细胞荧光强度均匀,可以用于示踪研究.冰冻切片显示试验组皮瓣蒂部均出现荧光,对照组未见荧光.A、B组荧光分布在动脉内膜、外膜和静脉壁;C组除动脉内膜、外膜和静脉肇有分布外,静脉腔偶有点片荧光;D组动脉内膜、外膜、静脉壁和静脉腔都有荧光分布.结论 逆行岛状皮瓣早期静脉血通过动脉内膜、外膜和静脉壁的迷宫途径回流;后期通过动脉内膜、外膜和静脉壁的迷宫途径及经静脉腔的逆瓣膜途径回流.
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薯蓣皂苷对人肾癌786-0细胞缝隙连接功能的影响
目的 探讨薯蓣皂苷(Dioscin,Dio)对人肾癌786-0细胞缝隙连接(Gap junction,GJ)功能的影响及其作用机制.方法 MTT法测Dio对786-0细胞生长的影响,荧光显微镜观察及流式细胞术结合荧光示踪法分析GJ功能变化,RT-PCR和Western blot分析连接蛋白基因表达.结果 0~2.5μmol·L-1 Dio处理786-0细胞48h不影响其存活率;用0、0.1、0.5、1和2 μmol·L-1 Dio处理细胞48 h后,荧光显微镜下观察,Dio能明显提高786-0细胞Calcein传递,流式细胞术分析对照组和实验组的绿色荧光细胞(G4)与双阴性受体细胞(G3)比值(G4/G3)分别是0.13±0.01、0.23±0.01、0.30±0.01、0.56±0.02和1.15±0.02,各实验组G4/G3值明显高于对照组 (P<0.01);RT-PCR和Western blot分析结果显示,用0、0.1、0.5、1和2 μmol·L-1 Dio处理细胞48 h对其Cx43、Cx32和Cx26表达无明显影响.结论 体外较低浓度Dio能够有效促进786-0细胞GJ功能,且具有明显的剂量效应关系.但Dio促进GJ机制并不是通过上调Cx43、Cx32和Cx26蛋白表达途径.
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100例健康人不同部位体表血流量的测量
皮肤血液循环障碍是一个常见的病理现象,可出现于多种疾病的病理过程中.测量皮肤血流量对于深入认识某些疾病的发病机制及发展过程、观察疗效、判断预后均有一定意义.血流量测量有多种方法[1]包括荧光示踪、红外热像、容积脉波和激光多普勒血流量测量等.其中激光多普勒血流量测量以其无损伤、适用范围广、操作简便而得到广泛应用.但多年来应用较多的激光多普勒血流计(LDF)为单点接触式、在使用中影响因素多,结果重复性差[2～4].至目前为止,尚缺乏国人皮肤血流量的正常参考值.激光多普勒血流量图像分析仪(LDPI)[5]是目前测量血流量较先进的仪器,它不需要任何造影剂及示踪元素,非接触性扫描一个暴露组织单位面积内的血流量,并自动生成二维血液灌注图像[6～8].利用此设备,我们检测了100例不同年龄的健康人体表血流量,以探讨中国健康人群不同部位的体表血流值,并比较不同性别及不同年龄间的差异,为临床应用提供参考依据.
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胶质瘤干祖细胞招募骨髓源细胞模型的建立
目的 建立荧光示踪骨髓重建裸小鼠模型及其在胶质瘤干祖细胞招募骨髓源细胞研究中的应用.方法 不同放射剂量辐照裸小鼠并收集辐照后外周血及骨髓数据确定清髓性骨髓毁损的佳剂量;辐照后24 h内经尾静脉移植表达绿色荧光蛋白(GFP)的裸小鼠骨髓细胞.流式检测GFP+细胞在骨髓及外周血中的分布,比较移植前后骨髓细胞集落形成能力、骨髓切片来评价重建骨髓功能;在此模型上原位接种红色荧光蛋白(RFP+)的胶质瘤干祖细胞(SU3-RFP)观察其对骨髓源细胞的影响.结果 6 Gy辐照后3～5d裸小鼠外周血白细胞数接近于0;骨髓细胞集落数与正常组比较显著减少.骨髓移植后裸小鼠外周血白细胞在28 d恢复到辐照前水平;流式结果显示骨髓和外周血中GFP+细胞分别为(90.95±2.05)％和(83.62±0.73)％;骨髓细胞集落数与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05).SU3-RFP原位移植瘤中发现GFP+骨髓源细胞特异性迁徙到肿瘤区域.结论 6 Gy是裸小鼠清髓性骨髓毁损的佳剂量;GFP+骨髓细胞裸小鼠模型可用于示踪研究肿瘤与宿主骨髓源细胞的关系;胶质瘤干祖细胞对骨髓源细胞具有特异性招募作用.
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胶质瘤干祖细胞与巨噬细胞的社会活动:细胞连接、融合及胞释
目的 通过分析免疫细胞社会中的肿瘤细胞与宿主巨噬细胞之间的关系,探寻肿瘤细胞社会中打破免疫平衡的大事件.方法 共培养红绿双色荧光示踪的胶质瘤干/祖细胞与宿主巨噬细胞,置于活细胞工作站实时摄影缩时成像并视频分析目标细胞的社会行为.结果 相关细胞实时动态连续观察发现:(1)细胞间传递信息的连接管道的6种类型.(2)2个活跃细胞相互作用后变成1个细胞,即细胞融合;已融合的细胞与另一个细胞再融合.(3)融合细胞的命运有对称分裂产生子细胞和瞬间凋亡两种.(4)存在一个细胞进入另一细胞内后胞释现象.结论 胶质瘤干/祖细胞与宿主巨噬细胞间连接方式、融合、分裂及胞释过程,可作为胶质瘤干/祖细胞诱导宿主巨噬细胞恶变的细胞行为学依据,对进一步理解肿瘤细胞社会成员间的复杂关系有重要意义.
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大鼠未固定神经组织DiI荧光示踪方法的研究
目的用DiI荧光示踪剂对大鼠未固定神经组织染色,观察神经组织在冰冻保存条件下DiI的示踪效果,以及扩散距离和扩散时间,从而获得使用DiI示踪未固定神经组织的良好方法.方法大鼠脑和脊髓组织取材,放置在-20℃条件下冰冻,用DiI标准溶液表面涂布小脑皮质或脊髓断端,保持-20℃冰冻,染色达到一定时间后用多聚甲醛固定液固定组织,以阻断DiI的传导,冰冻切片观察.结果大鼠未固定神经组织冰冻后,DiI扩散速度较快,均可见顺向.逆向示踪显示,神经元胞体及突起染色效果良好.结论大鼠未固定神经组织在离体后冰冻保存较用固定液保存,其DⅡ扩散速度明显加快.
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荧光示踪法研究逆行岛状皮瓣静脉回流
目的 探讨采用荧光示踪法研究逆行岛状皮瓣静脉回流的可行性,并初步观察静脉回流规律.方法 20只新西兰大白兔,每只取耳静脉血0.1 mL,分离RBC并用FITC标记.流式细胞仪检测已标记的RBC阳性率及荧光强度,倒置荧光显微镜观察其形态.取20只新西兰大白兔,在动物双侧后肢内侧分别建立4 cm×3 cm隐动、静脉逆行岛状皮瓣模型(n=10)和顺行岛状皮瓣模型(n=10),血管蒂长3 cm.将一侧后肢随机设定为实验组,皮瓣制备后注射已标记的RBC悬液5μL;对侧为对照组,不注射示踪剂.实验组按顺行和逆行皮瓣分成两组,即顺行皮瓣组和逆行皮瓣组,每组10个;再根据注入示踪剂途径不同,分为动脉和静脉2个亚组,每亚组5个皮瓣.注射示踪剂5 s后取下皮瓣立即冷冻,取连续的3张冰冻切片(5～7μm),其中2张行HE染色和GENMED染色,另1张不染色直接压片,荧光显微镜观察荧光分布.结果 流式细胞仪分析FITC标记的RBC阳性率在99%以上,荧光强度均≥103:倒置荧光显微镜下标记的RBC呈均匀分布的绿色荧光,荧光强度均匀、稳定.冰冻切片显示实验组皮瓣蒂部均出现荧光,对照组未见荧光.顺行岛状皮瓣组荧光主要分布在静脉腔、静脉壁、动脉内膜和外膜;逆行岛状皮瓣组荧光分布在动脉内膜、外膜和静脉壁.结论 荧光示踪剂可用于静脉回流研究,顺行岛状皮瓣静脉主要通过静脉腔、静脉壁、动脉内膜和外膜回流;逆行岛状皮瓣静脉主要通过动脉内膜、外膜和静脉壁的"迷宫式途径"回流.
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PKH26标记BMSCs示踪技术在构建组织工程骨中的应用
目的 探讨荧光染料PKH26在构建组织工程骨中作为细胞示踪剂的可行性.方法 取1周龄新西兰大白兔骨髓分离培养BMSCs,以PKH26标记第3代BMSCs,荧光显微镜观察并采用流式细胞仪检测标记率:以成骨诱导培养基诱导标记后BMSCs向成骨细胞分化,倒置相差显微镜观察诱导后7、14 d细胞形态变化,并于14 d采用钙钴法检测ALP活性,茜素红矿化结节染色观察诱导结果.将PKH26标记的BMSCs接种子生物衍生骨材料,48 h后荧光显微镜观察细胞与材料的复合情况:将细胞-材料复合物植入成年新西兰大白兔双后肢肌袋,14、28 d后荧光显微镜观察标记细胞的转归. 结果 荧光显微镜观察PKH26标记的BMSCs呈球形,呈现均匀分布的红色荧光;培养24 h后细胞贴壁伸展,轮廓清晰可见.流式细胞仪检测细胞染色阳性率达97.2%.经成骨诱导后,细胞由长梭形变为多边形或立方形,ECM分泌增多,ALP及茜素红染色均呈阳性反应.PKH26标记细胞与生物衍生骨材料复合培养48 h后,荧光显微镜观察可见材料表面及内部发出红色荧光.标记细胞.支架材料复合物植入肌袋后14 d,在植入区可见发出红色明亮荧光的标记细胞;术后28 d,在植入区仍可见发出红色荧光的细胞,但数量较14 d时少,荧光强度也较弱. 结论 PKH26标记BMSCs可作为一种体外构建组织工程骨及短期体内示踪的有效手段.
