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DiI顺行追踪大鼠皮质脊髓束
目的 用DiI追踪大鼠皮质脊髓束,探讨DiI在皮质脊髓束顺行追踪中的应用效果.方法 Wistar大鼠24只,随机分为DiI组和溃变组,于DiI组感觉运动区皮质表面涂布5%DiI;对溃变组则损毁相应的感觉运动区皮层.结果 DiI组术后存活5d的鼠,仅在端脑和间脑区见红色荧光标记的纤维,在术后存活10d、15d、20d的鼠脑及脊髓各节段内均可见红色荧光标记的皮质脊髓束纤维;溃变组在脊髓节段可观察到明显的溃变纤维,以术后存活5d为显著,在脊髓以上节段未见明显溃变纤维.结论 采用DiI活体顺行追踪大鼠皮质脊髓束的方法简便易行,对于皮质脊髓束的示踪研究,尤其中脑以下节段的显示具有比较好的应用价值.
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胶体金-荧光素双标配体法研究细胞低密度脂蛋白受体的功能
目的 建立一种利用胶体金-荧光素双标记配体研究细胞低密度脂蛋白受体(LDLR)功能的方法.方法 ①先用荧光素DiI标记LDL,再在一定pH值下将DiI-LDL吸附在胶体金颗粒表面上,获得稳定的双标记配体Au-DiI-LDL.②利用双标配体Au-DiI-LDL结合荧光显微镜、流式细胞仪和透射电镜等技术分别对经LDLR表达诱导剂、抑制剂或姜黄素作用后的ANA-1细胞LDLR进行定性定量分析以及内吞作用的直观检测.结果 荧光显微镜、流式细胞仪和透射电镜的检测结果均表明,能够利用双标配体Au-DiI-LDL检测ANA-1细胞LDLR的活性(P＜0.05).结论 胶体金-荧光素双标记配体法是一种可用于细胞LDLR功能检测的新型高效的方法.
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纳米生物探针双标大鼠骨髓间充质干细胞的成活及生长
背景：超顺磁性氧化铁标记可以活体示踪干细胞在动物体内迁徙情况，荧光活性染料DiI对细胞活力和增殖分化影响较小，适合标记和示踪细胞。
目的：观察超顺磁性氧化铁及DiI双标骨髓间充质干细胞的效果和安全性。
方法：无菌条件下分离大鼠双下肢，低糖DMEM培养液冲出骨髓，运用全骨髓贴壁法体外分离骨髓间充质干细胞，利用差速贴壁原理对细胞进行纯化扩增。对分离纯化并传代培养的大鼠骨髓间充质干细胞标记超顺磁性氧化铁，细胞移植前进行DiI标记。
结果与结论：原代培养8-10 d后可分离得到骨髓间质干细胞，传代周期为三四天，超顺磁性氧化铁-DiI标记率近100%，普鲁士蓝染色显示蓝色铁颗粒位于骨髓间质干细胞胞质内，荧光显微镜下胞浆内示红色荧光，锥虫蓝拒染法检测标记和未标记活细胞数目均在95%左右，说明在含超顺磁性氧化铁-DiI的培养基中骨髓间充质干细胞可继续增殖，细胞形态无明显变化。以上结果显示超顺磁性氧化铁-DiI 可安全有效地标记骨髓间质干细胞。 -
BDNF对视神经切断后视网膜神经节细胞生存的影响
目的应用成熟大鼠视神经切断模型研究BDNF对视网膜神经节细胞的保护作用.方法应用DiI经双侧上丘逆行标记视网膜神经节细胞后,切断视神经,同时玻璃体腔内注入BDNF,14天后取出视网膜,荧光显微镜计数存活的神经节细胞数,并同正常对照及阴性对照比较.结果单纯视神经切断2周后的视网膜神经节细胞生存数为466±105/mm2.玻璃体内注入BDNF视网膜神经节细胞生存数为1052±173/mm2.切断视神经后玻璃体内注入BDNF实验组和单纯切断视神经组比较存活的RGCs有明显差异(P＜0.001).结论本实验证实了BDNF可维持视网膜神经节细胞的存活.
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羰化青类荧光剂在神经示踪中的应用进展
逆行示踪是神经解剖学和神经生物学研究领域的常用方法之一,常用的示踪剂还有HRP、WGA-HRP、CTB、EB等,其中DiI细胞毒性小,不影响被标记细胞的存活、生长和发育;在组织的液相中不扩散,能特异性的标记神经元的胞体和突起,可沿神经纤维进行顺行和逆行扩散;结合状态稳定,能获得持久的染色效果;对神经元没有显著的毒性作用.因此,DiI越来越多地应用于神经科学研究领域[1].
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人类胚胎三叉神经节细胞的局在性分布
目的:应用三维重建方法对人类胚胎三叉神经节细胞的局在性分布进行研究.方法:本研究选用非疾病死亡的引产胚胎标本8例,胎龄20-26周,在获取标本1-4小时内,对标本进行灌流固定.其中2例标本在手术显微镜下开颅取出三叉圣经节,石蜡包埋、冰冻切片、HE染色、光学显微镜下观察、照相,用三位重建技术制作三维立体图片.其余6例标本在手术显微镜下开颅、找出三叉神经三大分支眼神经、上颌神经及下颌神经,各选2例分别注入DiI结晶体、在37℃恒温箱内保存3个月,取出标本、明胶包埋、冰冻切片,在荧光显微镜下观察、照相,用三位重建技术制作三维立体图片.结果:①眼神经的节细胞分布于神经节的前内侧、下颌神经的节细胞在神经节的后外侧、上颌神经的节细胞位于眼神经和下颌神经节细胞之间.②上颌神经和下颌神经节细胞之间存在少量的重叠.结论:三叉神经节细胞在神经节内由前内侧向后外侧分别为眼神经、上颌神经、下颌神经的顺序排列;上颌神经和下颌神经的起始细胞之间存在少量的重叠现象;三维重建图片结果显示人胚胎三叉神经节细胞即眼神经、上颌神经及下颌神经的起始细胞存在明显的局在性分布特征.
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人类胚胎三叉神经运动核的定位研究
目的:探讨人类胚胎三叉神经运动核的位置及细胞分布特征.方法:选用非疾病死亡的引产胚胎标本4例,胎龄20-26周(根据胎儿B超检测和孕妇末次月经日期来计算并获得胎龄),在获取标本1-4小时内,对标本进行灌流固定.其中,2例标本在手术显微镜下开颅取出脑干,石蜡包埋、冰冻切片、HE染色、光学显微镜下观察、照相,其余2例标本在手术显微镜下开颅、分离三叉神经根,注入DiI结晶体、在37℃恒温箱内保存3个月,取出脑干、明胶包埋、冰冻切片,在荧光显微镜下观察、照相.结果:①胚胎三叉神经运动核位于脑桥三叉神经根连脑水平;②三叉神经运动核为多级细胞、胞体较大、位于三叉神经根入脑桥的一束纤维的腹内侧;③三叉神经运动核呈椭圆形,神经核细胞呈大小不等,体积较大,胞体呈多角形.结论:人类胚胎三叉神经运动核为大型的多级细胞成群所形成的核团,位于脑桥三叉神经根连脑水平.
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DiI示踪标记固定脑组织内神经元及其突起的方法
目的:对DiI标记固定大脑皮质内神经元及其突起的技术进行改进,使操作更简单、便捷,效果更为高效、理想.方法:将DiI颗粒植入已固定小鼠大脑胼胝体,然后将标记后的脑组织放入4％多聚甲醛固定,于室温下避光孵育1～2周.结果:这种标记方法可以很直观地显示出大脑皮质神经元及其突起的精细结构,其中包括树突棘.结论:DiI示踪标记法可以用于标记固定脑内的神经元及其突起和树突棘,效果令人满意.
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DiI在神经系统示踪研究方面的应用
1, 1'-双十八烷-3, 3, 3', 3'-四甲基吲哚羰花青-高氯酸盐(1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate, DiI),分子式为C59H97ClN2O4,分子量为933.88,是一种羰花青族荧光染料,为紫红色晶体,无毒,具有高度的亲脂性,在水中的溶解度极低,可溶于乙醇、甲醇,二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)和N,N-二甲基甲酰胺(N, N-dimethylformamide, DMF).
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双荧光逆向追踪法研究大鼠视网膜节细胞的中枢投射
目的:观察向上丘投射的大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)在视网膜内的分布、密度及细胞类型上的差异.方法:将DiI与荧光金(FG)注射入SD大鼠的同侧和(或)对侧上丘,不同时相荧光显微镜下观察两种荧光标记RGCs的分布情况.结果:视网膜与视神经内均可见荧光标记;视网膜内标记RGCs的数目随时间延长略有增加,DiI与FG的标记效率无明显差异;RGCs大多数为对侧投射;视网膜颞背侧区域可见双侧投射细胞;视网膜颞腹侧周边区集中存在同侧投射细胞,多数胞体较大;视网膜其它区域可见零星同侧投射细胞.结论:DiI与FG可高效率逆行标记RGCs及部分突起;SD大鼠视网膜内并存着向对侧、双侧及同侧脑区投射的RGCs,后二者数量较少,分布局限;同侧投射以大胞体细胞为多.
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骨髓间充质干细胞对肌腱移植物在骨隧道内愈合效果及示踪的实验研究
[目的]观察骨髓间充质干细胞对肌腱移植物在骨隧道内愈合的影响,并为干细胞的标记示踪提供实验依据.[方法]采用贴壁分离筛选法获取大鼠的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),用超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)和DiI(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)对其标记.39只8周龄雄性SD大鼠随机分为两组,实验组21只,对照组18只.实验组在骨隧道内腱-骨结合面注入含双标的BMSCs和Pluronic F-127载体,对照组只注入载体,术后2、4、8周进行生物力学评估愈合效果,实验组2、4、8周组织冰冻切片荧光显微镜和手术后即刻、3、7 d行7.0 T MR示踪移植的BMSCs.[结果]SPIO、DiI能有效标记干细胞.实验组2、4、8周荧光显微镜观察在腱骨界面有DiI标记的阳性细胞存在.7.0 T MR未能在实验组腱骨界面观察到明显信号改变.生物力学大拔出载荷实验组和对照组在术后2周无统计学差异,在4、8周实验组显著高于对照组(P<0.05).[结论]移植的骨髓间充质干细胞可以促进骨隧道内腱骨结合部的早期愈合,DiI能有效标记示踪干细胞,SHO能有效标记干细胞,但在该实验模型中7.0T MR可能不能活体示踪磁粒子标记的干细胞.
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大鼠巨细胞网状核与脑干眼球外肌运动神经核的纤维联系
目的:观察大鼠脑干网状结构抑制区巨细胞网状核与脑干眼球外肌运动神经核的纤维联系.方法:将2种神经元示踪剂麦芽凝集素-辣根过氧化物酶(WGA-HRP)、1,1'-双十八烷-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青-高氯酸盐(DiI) 分别注入大鼠左侧巨细胞网状核后,镜下观察示踪剂在脑干眼球外肌运动神经核的分布.结果:WGA-HRP逆行标记神经元胞体及顺行标记神经纤维终末出现于双侧动眼神经核、滑车神经核,标记胞体同侧多于对侧;动眼神经核小细胞部也发现逆行标记细胞;展神经核未见标记.2种示踪剂显示结果基本一致.结论:大鼠巨细胞网状核与脑干眼球外肌运动神经核有直接纤维联系.
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大鼠未固定神经组织DiI荧光示踪方法的研究
目的用DiI荧光示踪剂对大鼠未固定神经组织染色,观察神经组织在冰冻保存条件下DiI的示踪效果,以及扩散距离和扩散时间,从而获得使用DiI示踪未固定神经组织的良好方法.方法大鼠脑和脊髓组织取材,放置在-20℃条件下冰冻,用DiI标准溶液表面涂布小脑皮质或脊髓断端,保持-20℃冰冻,染色达到一定时间后用多聚甲醛固定液固定组织,以阻断DiI的传导,冰冻切片观察.结果大鼠未固定神经组织冰冻后,DiI扩散速度较快,均可见顺向.逆向示踪显示,神经元胞体及突起染色效果良好.结论大鼠未固定神经组织在离体后冰冻保存较用固定液保存,其DⅡ扩散速度明显加快.
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大鼠皮质脊髓束的磁共振与DiI示踪对照研究
目的:验证Mn2+增强磁共振技术与DiI荧光示踪技术对于大鼠皮质脊髓束的追踪效果,并对两种方法进行比较评价.方法:采用Wistar大鼠30只,随机分为MnCl2组和DiI组各15只,分别经感觉运动区皮层进行MnCl2(0.8 mol/L)注射和5%DiI涂布.MnCl2组,于术后24h行MR扫描;DiI组动物存活10d后,灌杀、切片、观察.结果:两种方法在颈髓以上节段对皮质脊髓束的示踪结果一致.结论:Mn2+增强磁共振技术与DiI荧光示踪技术对皮质脊髓束的示踪效果好,二者结合应用,对临床影像学神经束路追踪研究具有较大的应用价值.
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荧光活性染料DiI标记观察人骨髓基质干细胞与部分脱钙骨粘附的实验研究
目的通过荧光活性染料 DiI标记观察骨髓基质干细胞在部分脱钙骨上的粘附.方法用 DiI标记人骨髓基质干细胞,接种于部分脱钙骨上,测定细胞的粘附率.于接种后第 2、 4、 7天激光共聚焦显微镜观察细胞在支架材料上的生长状况.结果 DiI标记的骨髓基质干细胞的粘附率为 (99.9± 0.2)%,未标记的骨髓基质干细胞粘附率为 (99.1± 1)%,两者无统计学差异( P >0.05);第 7天时细胞脱钙骨内孔覆盖.结论荧光活性染料 DiI标记不影响骨髓基质干细胞在部分脱钙骨支架上的粘附,是观察骨髓基质干细胞在脱钙骨支架上粘附状况的较好方法.
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三种示踪技术标记人脂肪组织来源干细胞的对照研究
目的 比较3种不同的荧光示踪技术标记人脂肪组织来源干细胞(ASCs)的效率,以寻找脂肪组织来源干细胞佳的标记示踪方法.方法 吸脂术获取人脂肪组织,胶原酶消化法后体外贴壁法培养,获得的长梭形细胞经鉴定为脂肪组织来源干细胞.分别使用5μlDiI,10μg/ml的脱氧尿苷BrdU及50 MOI的携带绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒进行标记,荧光显微镜观察不同时间点及不同代数的脂肪干细胞的标记效率及形态变化.结果 成功分离获得ASCs,经鉴定其表达间充质干细胞表面标志,并能被成功实现成脂、成骨及成软骨的诱导分化.DiI标记ASCs 48 h后,荧光显微镜下观察可见100%细胞浆呈现红色荧光,胞核未染,保持了良好的正常形态.但细胞传代后荧光衰减迅速.10μg/ml BrdU标记ASCs 48h后,90%的胞核呈绿色荧光,传代后胞核荧光逐渐衰减.携带GFP重组腺病毒转染ASCs 24 h后胞浆内即可见绿色荧光,5 d后90%以上的细胞呈现绿色荧光.反复传代后未见明显的荧光衰减.结论 DiI,BrdU及携带GFP的重组腺病毒均能有效的标记人脂肪组织来源干细胞.DiI示踪技术为细胞膜标记,BrdU为细胞核标记,两项技术均操作简单,但传代后衰减迅速,适合于短期标记示踪.携带GFP的腺病毒标记方法较为复杂,但反复传代后仍不衰减,适合于长期的标记示踪观察.
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胚胎心肌干细胞体外的分化
目的 鸡胚原肠胚形成期含有心肌干细胞(cardiac stem cell, CSC)的生心区原条组织离体后体外培养,使其增殖分化成具有舒缩功能的心肌组织.方法 改良滤纸鸡胚胎整体培养法取胚,37℃孵箱孵育,待胚胎发育到原肠胚的HH4期,无菌环境内选择性离体胚胎生心区原条组织(原条组织的前25%～40%)于10%FBS DMEM-F12培养基中培养,2～5 d后得到局部跳动的细胞组织,通过原位杂交、免疫组织化学、DiI示踪和细胞的超微结构鉴定是否分化为心肌组织.结果 FGF8特异性表达于心管和神经管;N-cadherin特异性表达于心管、神经管和体节;DiI标记的细胞迁移参与心管的形成;细胞的超微结构显示心肌组织特有的结构--闰盘.结论 CSC体外培养可以定向分化发育成心肌组织,为进一步研究心肌细胞的发育分化和生理药理学实验提供了良好的平台.
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血清高密度脂蛋白的超速离心、氧化修饰及DiI标志
目的:探讨一种方便快捷地从血浆中分离高密度脂蛋白(HDL)及氧化修饰、荧光标记的方法.方法:采用一次性密度梯度超速离心法,经超速离心分离后获得HDL(10℃,50 000 r/min,5 h),并用Cu2+进行氧化修饰(37℃,50 μmol/L,24 h)及DiI进行荧光标记(37℃,15 mg/mL,15 h).结果:5 h内成功分离出脂蛋白,并氧化、标记了HDL;琼脂糖凝胶电泳、Bradford蛋白质定量及MDA测定证实其为纯度和浓度较高的HDL及氧化HDL(OX-HDL);标记的HDL(DiI-HDL)结合到体外培养的ECV-304细胞,表明DiI-HDL保持了正常脂蛋白的配体功能.结论:本方法缩短了超速离心时间并降低了标记成本,效果理想,可成功应用于脂蛋白受体的研究.
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经股后肌群注射DiI逆行示踪标记神经元胞体的实验研究
目的 探讨经股后肌群注射DiI行逆行示踪以精确显示支配神经元胞体在脊髓的时空分布情况.方法 新生昆明小鼠65只,经左后肢股后肌群注射DiI,在注射2、4、6、8、12、24 h和2、4、7、14、28 d及2、3个月后观测背根神经节和腰段脊髓示踪荧光的分布和强度.结果 ①示踪细胞分布在左侧L2～S2脊髓段和相应的背根神经节,主要集中在L4～L6段;②注射DiI 6 h后,在背根神经节和脊髓前角可见发微弱红色荧光的神经元;③标记的神经元数量逐渐增多,4 d达到高峰;④6～24 h每个标记神经元荧光逐渐增强,24 h后达到高峰;⑤3个月后荧光强度无显著降低.结论 经股后肌群注射DiI作逆行示踪,可快速、准确、持久地标记背根神经节感觉神经元和脊髓运动神经元,且适当延长示踪时间可提高神经元的标记率.
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一种在体标记成体大鼠室管膜/室下区细胞的方法
目的 研究正常成体大鼠侧脑室注射DiI标记室管膜/室下区(SVZ)细胞的方法.方法 50只雄性SD大鼠随机分为5组,每组10只,均接受2 g/L的 DiI 10 μL右侧脑室注射.采用H33258染色和激光共聚焦显微镜检测DiI注射后6 h、12 h、24 h、36 h和48 h时左侧脑室壁的标记细胞以及标记组织厚度.结论 右侧脑室DiI注射后24 h,DiI标记细胞位于左侧脑室的室管膜层; DiI注射后48 h,DiI标记细胞限定于左侧室的管膜层和室下区.此外,左侧室管膜/中隔室下区(SVZspt)和室管膜/神经节隆起的生后对应物(SVZge)部位荧光标记组织的厚度分别在DiI注射12 h和24 h后维持于稳定水平,而且,在相应各时间点上,室管膜/SVZge部位荧光标记组织的厚度都厚于室管膜/SVZspt部位(P＜0.05).结论 2 g/L 的DiI 10 μL注射于正常大鼠侧脑室后24～48 h,可能仅标记室管膜/室下区细胞.
