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安徽省阜阳市10只可疑狂犬脑组织狂犬病病毒抗原检测分析
近年来安徽省阜阳市狂犬病疫情持续上升,为此2004年我们采集疑似狂犬10只,记录其发病症状及咬伤人和动物情况,并取犬头送卫生部武汉生物制品研究所基因工程室做狂犬病实验室检测,死犬其余部分焚烧消毒.抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体、HRP标记的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体由该室制备[1];异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗鼠IgG抗体由该所免疫研究室提供.用间接免疫荧光法(IFA)和双抗体夹心ELISA检测样品中狂犬病毒[2].
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建立引物双标记的聚合酶链反应-酶联免疫吸附法检测军团菌mip基因
建立一种新的检测嗜肺军团菌mip基因的引物双标记聚合酶链反应-酶联免疫吸附(PCR-ELISA)法,应用于豚鼠军团菌感染的早期检测和诊断.其方法是将一对嗜肺军团菌引物分别标记有生物素和异硫氰酸荧光素,经PCR扩增后,将标记有生物素的PCR扩增产物加入链酶亲和素包被的微孔板中,洗去未结合物后直接加入碱性磷酸酶标记的抗荧光素抗体,待与荧光素结合后,再加入底物产生显色反应,ELISA仪测得A值.
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二次回归通用旋转组合设计法优化枸杞多糖的荧光标记
目的：利用二次通用旋转组合设计试验筛选枸杞多糖荧光标记的优标记条件。方法枸杞多糖与酪胺氨基共价偶联后与异硫氰酸荧光素反应，实现选择性荧光标记。利用二次通用旋转组合设计试验，研究缓冲液pH值、标记时间、温度、酪胺量与标记效率之间的关系，从中筛选出佳的标记条件。结果得回归方程为：Y＝0.08541－0.00282X1－0.01568X2＋0.00811X3＋0.00501X4＋0.00875 X1X2－0.00575X1X3－0.00175X1X4＋0.01063X2X3＋0.000125X2X4＋0.00025X3X4－0.02144X12－0.00889X22－0.001984X32＋0.00366X42，失拟性检验F＝1.76＜F0.05(5,3)＝9.01；显著性检验F＝8.42＞F0.01(11,8)＝5.74，表明二次回归模型有统计学意义。枸杞多糖荧光标记时温度在50℃，pH 值为8.5，反应时间设为4 d时结合效率高。结论在枸杞多糖荧光标记的过程中，在特定的反应温度和缓冲液pH值条件下，适当延长反应时间可提高反应效率。
关键词： 枸杞多糖 异硫氰酸荧光素 酪胺 二次通用旋转组合设计 -
玉屏风散抑制小鼠Th2型变应性接触性皮炎
目的:应用异硫氰酸荧光素(FITC)诱导的Th2(Ⅱ型辅助性T细胞)型小鼠变应性接触性皮炎的模型,探讨玉屏风散对Th2型变应性接触性皮炎的作用.方法:小鼠在第1,2天用1.5%的FITC溶液致敏腹部皮肤2次,同时给予玉屏风散至第5天(诱导相给药),第6天用0.5%的FITC溶液攻击小鼠耳部皮肤,24 h后测定小鼠耳肿胀程度,并做耳病理组织学检查和耳匀浆中白介素-4(IL-4)测定.结果:玉屏风散6.5 g·kg-1(临床等效量)和13 g·kg-1诱导相给药均能显著抑制小鼠耳肿胀度,光镜下测量的耳厚度也表明玉屏风散明显抑制模型小鼠耳肿胀程度;病理组织学检查显示给予玉屏风散小鼠的耳炎症反应减轻,炎细胞浸润明显减少;玉屏风散6.5 g·kg-1组耳组织匀浆中IL-4水平较模型组显著降低.结论:玉屏风散诱导相给药对FITC诱导的小鼠Th2型变应性接触性皮炎有显著的抑制作用,作用机制可能与调节IL-4有关.
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凝胶色谱法测定麦冬多糖MDG-1在大鼠胃肠道含量变化
目的:探讨口服麦冬多糖MDG-1后在胃肠道内的变化.方法:采用异硫氰酸荧光素(FITC)对麦冬多糖MDG-1进行标记,测定取代度.采用荧光凝胶色谱法( HPGPC)对消化道内含量进行测定.胃内含量变化测定:SD雄性大鼠随机分成6组,其中5组分别口服给予不同剂量F-MDG-1,空白组给予水,在1h时测定含量；另取SD雄性大鼠随机分成6组,其中5组分别经口给予相同剂量F-MDG-1,空白组给予水,分别在0,1,2,4h时测定含量.小肠道内含量测定:SD-雄性大鼠分成4组,空白组1组及给药组3组,经胃幽门部注射给药后立即分别结扎胃幽门部及小肠末端,空白组给予水适量,给药组给予F-MDG-1溶液适量,分别在1,2,4h测定内容物内F-MDG-1含量.大肠内含量测定:SD-雄性大鼠分成4组,空白组1组及给药组3组,每组6只,给药方法:经小肠末端部注射给药后立即分别结扎小肠末端及大肠末端近肛门部.空白组给予水适量,给药组给予F-MDG-1溶液适量,分别在1,2,4h测定大肠内容物内F-MDG-1含量.结果:给予相同剂量的F-MDG-1,随着药物在胃内驻留时间的延长,其浓度下降.而在给予不同浓度F-MDG-1后,在1h时测得浓度占给药量的百分比随着给药剂量的增加而增加；但将pH调7.2后,其含量未变化.分别单次给予小肠、大肠F-MDG-1后,随着药物在肠道内驻留时间的延长,其含量逐渐降低.结论:采用FITC对MDG-1进行标记,并采用荧光色谱法对MDG-1在胃肠道内含量变化进行研究是可行的.MDG-1在胃内不分解,其主要代谢部位在肠道,其原因可能是肠道内环境及细菌共同作用的结果.
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栀子提取物ZG对单纯疱疹病毒1型细胞吸附的影响
采用负染技术,借助高倍电子显微镜观察栀子提取物ZG作用后,病毒颗粒及其病毒吸附蛋白(virus attachment protein,VAP)的变化,考察药物是否直接改变或破坏病毒包膜蛋白的结构,使其失去感染性;采用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记病毒,以肝素钠为参照,借助冷却慢扫描电荷耦合器件荧光成象技术,用Aquacomos软件进行图象分析,以探讨栀子提取物ZG不同加药方式对HSV-1吸附量的影响.结果表明栀子提取物ZG对HSV-1包膜表面的VAP无直接破坏作用,不影响病毒对Hep-2细胞的感染性;先加入肝素钠再进行病毒吸附及肝素钠病毒同时加入培养细胞这两种用药方式可明显减少细胞表面病毒的吸附量;栀子提取物ZG各种不同加药方式均能阻止HSV-1对Hep-2细胞表面的吸附,使病毒吸附量减少.
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FITC与抗-FITC系统检测促黄体生成素的应用评价
目的 使用抗-异硫氰酸荧光素(FITC)固相包被板建立促黄体生成素(LH)的酶联免疫(ELISA)检测方法.方法用FITC及辣根过氧化物酶(HRP)分别标记两株抗-LH单克隆抗体,建立一步检测LH的ELISA检测方法,并与经典的双抗体夹心法进行了方法学对比评价.结果 FITC与抗-FITC系统检测LH,在2~50mIU/mL的校准曲线范围内相关系数0.9968,分析内精密度为7.6%,分析间精密度为7.02%,热稳定性下降18.5%,与双抗体夹心法相当,空白检测限为0.15mIU/mL,优于双抗体夹心法,钩状效应(HOOK效应)比双抗体夹心法差.与贝克曼检测结果回归方程Y=0.970X+0.614,相关系数r=0.975.结论 成功建立基于FITC与抗-FITC系统的ELISA检测方法,与双抗体夹心法相比,两种方法均能满足临床检测的需要.
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磁分离酶联免疫法检测IL-4方法的建立
建立磁分离酶联免疫法定量检测人白细胞介素4(IL-4)的方法.用异硫氰酸荧光素(FITC)和碱性磷酸酶(AP)分别标记识别不同表位的两种抗IL-4单克隆抗体(mAb), 用抗FITC多抗或mAb包被免疫磁珠.结果显示: 检测标准品浓度在0-3ng/mL范围内线性关系良好, 敏感性达10pg/mL, 平均回收率为101.7%,批内批间CV均为3.6%,与ELISA比较相关系数为0.9124.此法所需样本量少, 方法稳定, 敏感性高和特异性强, 又无放射性污染, 在临床检验和基础研究中有较大应用价值.
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小鼠抗兔IgG单克隆抗体的制备与应用
制备小鼠抗兔IgG的mAb,经标记HRP和FITC后,应用于ELISA、Western blot、免疫组织化学染色试验以及FCM.以正常兔IgG为抗原,免疫BALB/c小鼠,通过常规B淋巴细胞融合技术,获得两株分泌抗兔IgG mAb的杂交瘤细胞株,间接ELISA腹水效价均达1 ×10-7,且亚类均为IgG1(κ).抗体经鉴定、纯化后,以改良的过碘酸钠法标记HRP,本室常规方法标记FITC.FITC标记的2A1 mAb的F/P值为4.1,2F11的F/P值为2.7.HRP标记抗体的效价和工作浓度分别:2A1为1:25600和1:3200,2F11为1:102400和1:25600.在相同工作浓度条件下,ELISA、Western blot的实验结果,HRP标记的2F11 mAb明显优于商品化抗兔pAb,而且,2A1和2F11mAb经标记后还可用于免疫组化和FCM,显示出很好的应用前景.
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异硫氰酸荧光素标记的神经生长因子缓释微球的制备及评价
目的 探讨异硫氰酸荧光素(FITC)标记的神经生长因子缓释微球的制备,并对其进行体内外评价.方法 采用水-油-水的双乳化技术制备FITC标记的神经生长因子缓释微球.利用扫描电镜和荧光显微镜对其形态特征进行观察,并对其体内外释放情况进行研究.结果 制备的FITC标记的神经生长因子缓释微球包封率和载药量分别为(97.9±8.9)%和(4.90±0.56)%.扫描电镜结果显示所制备的微球呈圆形、形态规整、粒径分布较均匀.荧光显微镜结果显示所包载的蛋白类药物在微球内旱随机分布.缓释微球体外持续释放5周后,有73%的蛋白释放出来;荧光示踪显示在体内能够持续释放达5周以上.结论 采用水-油-水的双乳化技术制备的缓释微球可以将生物大分子药物如神经生长因子成功运载到脑内.
关键词： 聚乳酸羟基乙酸复合物 异硫氰酸荧光素 神经生长因子 微球 -
栀子提取物ZG对单纯疱疹病毒1型吸附量的影响
目的 观察栀子提取物ZG对单纯疱疹病毒1型(HSV-1)吸附过程中病毒吸附量的影响,以探讨其抗病毒作用机理.方法 采用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)作为荧光探针标记病毒,以肝素钠为对照,借助流式细胞仪,通过收集多种不同的加药方式后细胞表面的荧光强度,来考察病毒吸附过程中病毒吸附量的变化及栀子提取物ZG对此变化的影响.结果 单纯疱疹病毒1型在Hep-2细胞表面吸附存在饱和性、特异性;肝素钠3种加药方式均能明显降低病毒吸附量,先加药后吸附及吸附和加药同时进行两种方式,优于先吸附后加药的方式,其吸附抑制率分别为84.76%和82.02%;栀子提取物ZG 3种加药方式均能明显降低病毒吸附量,其中以吸附和加药同时进行组为显著,吸附抑制率为68.46%.结论 栀子提取物ZG可能是通过作用于病毒吸附的多个环节来达到抑制HSV-1的吸附作用.
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在量子点探针介导下共聚焦显微镜检测肾癌组织HSP70的表达意义
本研究探讨新型纳米荧光材料量子点在免疫荧光分析法中的应用价值.我们分别利用量子点QD605或异硫氰酸荧光素(FITC)作为免疫荧光分析中的标记探针,通过激光扫描共聚焦显微镜观察肾细胞癌组织中HSP70的表达,并比较所得图像之间的成像差异性和成像稳定性.在所有的肾细胞癌组织样本中,量子点QD605标记的图像信号都要比常用的荧光染料FITC标记信号发光强度更高,更有特异性,在激光连续照射1 h下QD605标记的图像未有明显的荧光漂白现象,表现出极佳的发光稳定性.因此以新型荧光材料量子点为标记探针,用免疫荧光分析法检测病理组织切片中的蛋白标记物更有特异性,有潜力代替传统的有机荧光染料应用于生物大分子的荧光标记和光学成像.
关键词： 量子点 异硫氰酸荧光素 肾细胞癌 免疫荧光分析 激光扫描共聚焦显微镜 -
反义VEGF寡核苷酸与碘油混合肝动脉注入转染鼠肝癌的可行性
目的:探讨反义VEGF寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)转染Walker-256瘤细胞及其与碘油混合后肝动脉注入转染鼠肝癌及在鼠肝、肺、肾组织的分布情况.方法:将异硫氰酸荧光素(5'-FITC)标记的VEGF ASODN加入培养的Walker-256瘤细胞培养液中,不同时间用荧光显微镜观察细胞内ASODN的分布.12只Walker-256移植性大鼠肝癌模型,一组肝动脉内注入荧光标记的VEGFASODN(TAI组,n=6),另一组肝动脉内注入荧光标记的VEGF ASODN与超液态碘油的混合液(混合组,n=6),两组分别于术后1 d、3d、6d取动物的肝、肺、肾组织行冰冻切片,荧光显微镜观察各组织内ASODN的分布情况.结果:荧光标记的ASODN与Walker-256瘤细胞共同培养后2 h时可见瘤细胞胞质内有点状荧光染色,6 h胞核内有荧光染色,12 h荧光染色强,胞核及胞质中均可见荧光染色,24h荧光物质减少,48h完全消失.1 d和3 d时混合组肝癌组织及肝组织内荧光染色强于TAI组,而肺、肾组织荧光染色弱于TAI组;6 d时TAI组肝、肺、肾组织内荧光染色基本消失,而混合组肝、肺、肾组织仍有少许荧光染色.ASODN可以进入肝癌细胞及瘤周肝细胞.结论:VEGF ASODN可以转染Walker-256细胞,其与碘油混合后可以延长ASODN在肝内的停留时间,增加对肝癌组织的转染率,减少其在肝外组织的分布.与碘油混合后肝动脉注入是VEGF ASODN反义基因治疗肝癌的理想给药方法.
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异硫氰酸荧光素掺入法测定mPEG修饰的红细胞半寿期
目的:为甲氧基聚乙二醇(mPEG)包裹改造红细胞制备通用型血实验提供一种简便、可靠、安全无污染的红细胞半寿期测定方法.方法:用异硫氰酸荧光素(FITC)标记、mPEG包裹小鼠红细胞,然后回输到小鼠体内,用流式细胞仪测荧光标记的细胞百分含量,计算红细胞半寿期.结果:mPEG包裹对红细胞膜上异硫氰酸荧光素荧光强度的检测没有影响,异硫氰酸荧光素的衰减也不会影响红细胞半寿期的测定.低剂量的mPEG包裹不影响红细胞的寿命,而高剂量的mPEG包裹会对红细胞产生损伤,使其寿命明显缩短.结论:此方法简便,易操作,安全无污染,是一种可行的测定红细胞半寿期的方法.
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盐酸博安霉素注射用原位凝胶的体内分布研究
考察盐酸博安霉素(BAM)注射用原位凝胶在裸鼠体内的扩散情况以评价原位凝胶对盐酸博安霉素的阻滞作用.以荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC)标记盐酸博安霉素,制备异硫氰酸荧光素-盐酸博安霉素偶联物(FITC-BAM),采用透析袋透析和Sephadex G25葡聚糖凝胶柱对偶联物进行分离纯化,利用基质辅助激光解析电离/飞行时间(MALDI-TOF)质谱检测偶联效果.建立裸鼠皮下肝癌移植瘤模型,应用动物体内活体光学成像系统定时检测盐酸博安霉素在裸鼠体内的特异性分布情况.MALDI-TOF质谱检测结果显示,FITC成功与BAM发生偶联,且二者偶联的分子比主要为1∶1或2∶1.活体动物成像系统观察显示,盐酸博安霉素注射用原位凝胶组FITC-BAM的扩散较普通注射液组明显延迟.研究表明,将盐酸博安霉素制备成注射用原位凝胶制剂,能够阻滞药物在体内的释放,延长作用时间.
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FITC标记胸腺五肽的合成、纯化及表征
目的:以异硫氰酸荧光素(FITC)标记胸腺五肽(TP5)制备荧光探针FITC-TP5,并对FITC-TP5进行纯化、结构鉴定及活性分析.方法:FITC通过共价结合标记TP5分子,投料比为3:1,采用离子交换色谱柱和凝胶滤过色谱柱分离和纯化FITC-TP5,质谱法进行结构鉴定,氨基酸组分分析仪确定FITC连接位置,淋巴细胞的增殖反应(MIT法)评价FITC-TP5的生物活性.结果:FITC-TP5为单一标记物,FITC连接在TP5的氨基端--精氨酸分子上,标记物FITC-TP5保留了TP5的生物活性.结论:本研究所制备的荧光探针FITC-TP5纯度高且生物活性良好.
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多功能阳离子脂质体跨血脊髓屏障的实验研究
目的：探讨异硫氰酸荧光素(FITC）标记阳离子脂质体通过尾静脉注入后，跨越大鼠血脊髓屏障并在局部聚集的情况。方法30只成年Wistar大鼠随机等分为3组，每组10只，荧光显微镜动态观察脂质体在中枢神经系统(CNS）中靶向聚集与扩散情况，通过组织学观测进一步分析其与CNS细胞的关系。结果相同浓度下(75~600μg/mL），TAT-PEG-阳离子脂质体较未经TAT修饰者具更低细胞毒性，且更易被MCF-7细胞摄取；FITC标记TAT-PEG-阳离子脂质体可跨越BSCB并聚集，低倍镜下观察到许多荧光微粒聚集于CNS组织，高倍镜形象地显示出荧光微粒位于神经细胞内。结论经跨膜肽(TAT）、聚乙二醇(PEG）修饰的阳离子脂质体具有良好的生物相容性与靶向定位特性，可跨过BSCB，聚集于CNS细胞中，安全用作药物载体，为中枢神经系统疾病的治疗提供新的途径。
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转铁蛋白/叶酸双重修饰的薏苡仁油-雷公藤红素微乳制备及其体外靶向抗肿瘤研究
目的 构建转铁蛋白(Tf)和叶酸(FA)双重修饰的薏苡仁油-雷公藤红素微乳(transferrin and folic acid modified coix seed oil-tripterine microemulsion,Tf/FA-CT-MEs),提高其体外靶向抗肿瘤能力.方法 采用经典缩合法制备叶酸-聚乙二醇400 (FA-PEG 400),通过FT-IR与1H-NMR进行结构表征,并连同Tf共同作为靶配体;以薏苡仁油为油相,包埋难溶性抗肿瘤药物雷公藤红素,水滴定法制各Tf/FA-CT-MEs等制剂并表征其理化性质;以异硫氰酸荧光素(FITC)为荧光探针,通过流式细胞仪定量比较MCF-7(Tf/FA受体双过表达)和A549(仅Tf受体过表达)细胞对微乳的摄取量.同时考察微乳抑制细胞增殖作用和诱导细胞凋亡的能力.结果 合成并表征了FA-PEG 400,作为制剂靶配体制备了Tf/FA-CT-MEs等制剂;Tf/FA-CT-MEs外观圆整,平均粒径为(52.52±0.11) nm,多分散指数(PDI)为0.124±0.019,Zeta电位为(-21.50±1.70)mV,且具有较好的体外稳定性.细胞实验表明,Tf/FA-CT-MEs对MCF-7细胞和A549细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为0.77、0.85 μmol/L;4 h细胞摄取荧光强度分别为2 782.33±131.77、2 762.91±23.18;诱导MCF-7细胞凋亡率为(70.60±6.92)％.结论 Tf/FA-CT-MEs在体外干预Tf/FA受体双过表达细胞系时,体外靶向抗肿瘤作用明显增强,此类双靶修饰策略为提高中药纳米制剂针对特定肿瘤细胞的靶向性研究提供依据.
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丁酰半乳糖酯修饰的薏苡仁组分微乳的制备及其体外抗肿瘤活性研究
目的 合成丁酰半乳糖酯(butyryl galactose ester,But-Gal)并制备丁酰半乳糖酯修饰的薏苡仁组分微乳(butyryl galactose ester modified coix component microemulsions,But-Gal-CMEs),对其进行理化性质评价和体外抗肿瘤活性测定.方法 采用酶催化法合成But-Gal,并通过1H-NMR与FT-IR对其结构进行表征.以薏苡仁油为油相,聚氧乙烯氢化蓖麻油(Cremophor(R) RH40)为乳化剂,PEG400为助乳化剂,But-Gal为肝肿瘤细胞靶配体,薏苡仁多糖水溶液为水相,水滴定法制备微乳,测定其粒径、电位和形态.通过MTT法考察薏苡仁组分微乳(CMEs)与But-Gal-CMEs对肿瘤细胞HepG2细胞毒作用;以异硫氰酸荧光素(FITC)为荧光探针,借助荧光倒置显微镜观察HepG2细胞对微乳的摄取行为.结果 经1H-NMR与FT-IR表征确认丁酰半乳糖酯结构与设计一致.制备所得But-Gal-CMEs外观形态圆整,平均粒径为(57.68±6.65)nm,多分散指数(PDI)为0.070±0.006,Zeta电位为(-2.95±0.23)mV.MTT实验表明,But-Gal-CMEs与CMEs对HepG2细胞增殖的半数抑制浓度(IC50)分别为62.55、71.23 μg/mL.HepG2细胞摄取结果显示But-Gal-CMEs组的荧光强度强于CMEs组.结论 所制备的But-Gal-CMEs粒径小,外观圆整,稳定性好,But-Gal能增加HepG2对CMEs的细胞摄取,并增强其对HepG2细胞毒作用.
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胆固醇基修饰的普鲁兰纳米粒的摄取机制及亚细胞分布研究
目的 研究胆固醇基修饰的普鲁兰(CHSP)纳米粒的体外HepG2细胞的摄取机制及亚细胞分布.方法 采用异硫氰酸荧光素(FTTC)标记CHSP,透析法制备FITC标记的CHSP(FITC-CHSP)自组装纳米粒并进行表征.采用MTT法考察CHSP纳米粒对HepG2细胞的毒性.选用选择性的内吞途径抑制剂氯丙嗪、菲律宾菌素和阿米洛利来研究HepG2细胞摄取CHSP纳米粒的机制.后,采用细胞免疫荧光法对内质网、高尔基体和溶酶体进行染色,使用激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察不同的孵育时间CHSP纳米粒的亚细胞分布.结果 成功合成了FITC-CHSP,且FITC-CHSP能在水介质中自组装成纳米粒,该纳米粒呈规则球形,平均粒径为(63.0 ±1.9) nm.MTT结果表明CHSP纳米粒对HepG2细胞无明显的细胞毒性.内吞抑制实验表明网格蛋白介导的内吞途径以及巨胞饮途径共同参与了CHSP纳米粒的入胞过程.纳米粒的亚细胞分布实验表明:在研究的孵育时间(4 h)内,并未发现CHSP纳米粒进入高尔基体和内质网;当纳米粒与HepG2细胞孵育30 min时,没有纳米粒定位于溶酶体中,随着孵育时间的延长,大量纳米粒分布于溶酶体中.结论 CHSP纳米粒有望成为细胞内递送治疗剂的一种通用载体.
关键词： 胆固醇基修饰的普鲁兰 纳米粒 异硫氰酸荧光素 摄取机制 亚细胞分布
