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黄柏提取物在体外对Vero细胞单纯疱疹病毒1型的抑制作用
目的:观察黄柏提取物在体外对单纯疱疹病毒1型的抑制作用.方法:以HSV-1型病毒感染Vero细胞,检测黄柏提取物对单纯疱疹病毒1型(HSV-1)引起的细胞病变的抑制作用,并用阿昔洛韦作对照.结果:黄柏提取物抗病毒的作用优于西药阿昔洛韦组(P＜0.05).结论:黄柏提取物浓度范围0.31～10mg/ml,对10-2和10-5稀释度HSV-1(Sm44株)所致的Vero细胞病变有剂量依赖性抑制作用,IC50值分别为4.19和1.12mg/ml.
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羊栖菜提取物的体外抗病毒作用
目的:探讨羊栖菜提取物的体外抗病毒作用.方法:对羊栖菜的提取物进行了常见的第三类病原体病毒呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16、柯萨奇病毒B2、柯萨奇病毒B3、柯萨奇病毒B5(CVA16、CVB2、CVB3、CVB5)等7种病毒的抗病毒效应研究,显微镜下观察细胞存活率.结果:羊栖菜提取物对上述7种病毒的抑制能力远远优于广谱抗病毒药物利巴韦林,尤以对EV71的抑制效果为明显,抑毒指数极高.结论:羊栖菜提取物对这7种病毒均具有良好的抑制作用,为进一步研究羊栖菜提取物对第三类病原体病毒的广谱抗病毒作用奠定基础.
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人参皂苷Rb1抗单纯疱疹病毒1型感染及保护神经的实验研究
目的 通过研究人参皂苷Rb1(GRb1)抑制单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus,HSV-1)感染导致人星形胶质瘤细胞(U251)凋亡异常及神经生长因子(NGF)mRNA的表达变化,探讨GRb1抗HSV-1感染从而保护神经的作用机制.方法 mTT比色法、流式细胞术检测GRb1对HSV-1感染致U251细胞凋亡异常的抑制作用;应用半定量RT-PCR检测不同处理组NGFmRNA的表达变化.结果 (1)MTT法显示400μg/mL GRb1+HSV-1组在感染24、36、48h的MTT值均高于HSV-1组(P＜0.05);(2)形态学观察HSV-1组细胞感染36h后出现细胞病变效应(CPE),而400μg/mL GRb1+HSV-1组细胞感染36h后融合增多,但大部分细胞为正常形态;(3)流式细胞术显示:400 μg/mL GRb1+HSV-1组凋亡率在感染24、36h均低于HSV-1组(P＜0.05);(4) RT-PCR显示:400 μg/mL GRb1+HSV-1组GRb1组在加药后早期6～12h NGFmRNA表达降低(P＜0.05),但在感染24、36、48h表达增高且明显高于HSV-1组(P＜0.05).结论 适当浓度的GRb1能抑制因HSV-1感染所致细胞凋亡的异常及NGFmRNA的表达变化.推测GRb1可能通过上调NGFmRNA的表达并抑制细胞凋亡,从而起到抗病毒、保护神经的作用.
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栀子提取物ZG对单纯疱疹病毒1型细胞吸附的影响
采用负染技术,借助高倍电子显微镜观察栀子提取物ZG作用后,病毒颗粒及其病毒吸附蛋白(virus attachment protein,VAP)的变化,考察药物是否直接改变或破坏病毒包膜蛋白的结构,使其失去感染性;采用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记病毒,以肝素钠为参照,借助冷却慢扫描电荷耦合器件荧光成象技术,用Aquacomos软件进行图象分析,以探讨栀子提取物ZG不同加药方式对HSV-1吸附量的影响.结果表明栀子提取物ZG对HSV-1包膜表面的VAP无直接破坏作用,不影响病毒对Hep-2细胞的感染性;先加入肝素钠再进行病毒吸附及肝素钠病毒同时加入培养细胞这两种用药方式可明显减少细胞表面病毒的吸附量;栀子提取物ZG各种不同加药方式均能阻止HSV-1对Hep-2细胞表面的吸附,使病毒吸附量减少.
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HSV-1感染大鼠骨髓间充质干细胞及形成潜伏感染的初步研究
在体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察单纯疱疹病毒1型感染骨髓间充质干细胞情况.分离并鉴定BMSCs;HSV-1感染BMSCs,观察细胞病变(CPE);建立BMSCs的HSV-1潜伏感染模型.提取总DNA,PCR法扩增BMSCs内的HSV-1特异性片段,检测HSV-1感染BMSCs及潜伏感染.结果显示骨髓间充质干细胞经14d诱导后,碱性磷酸酶含量增高、形成钙结节,表现出成骨细胞特性.HSV-1感染BMSCs,出现典型的CPE,PCR法证实BMSCs内存在HSV-1的特异性片段.HSV-1潜伏感染的BMSCs,未出现明显的CPE,细胞传至7代,仍可测到HSV-1的基因片段,表明BMSCs有可能形成HSV-1的潜伏感染.大鼠骨髓间充质干细胞在体外可以向成骨细胞方向分化,可作为组织工程学的种子细胞.HSV-1可以在体外感染骨髓间充质干细胞并有形成潜伏感染的趋势.
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单纯疱疹病毒1型引起的发热出疹性疾病需要与手足口病进行鉴别
对2008年在甘肃省发生的一起疑似手足口病(HFMD)的发热出疹性疾病的流行进行病原体的实验室检测,明确引起这起传染病流行的病原体.从4名发热出疹患者采集的8份临床标本中(每个患者采集咽拭子和疱疹液标本),首先将临床标本接种到RD和HEp-2细胞上进行病毒分离,对病毒分离阳性的标本提取病毒核酸,然后使用荧光定量-逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行人肠道病毒(HEV)核酸的检测.对HEV检测结果阴性的标本采用序列非依赖的单引物扩增技术(SISPA)进行“未知病原体”的鉴定.分离到的6株病毒均鉴定为单纯疱疹病毒I型(HSV-1),结合分析这起流行中患者的临床表现、流行病学调查结果以及实验室检测结果,表明HSV-1是引起这起发热出疹性疾病流行的病原体.6株HSV-1的gG区核苷酸和氨基酸水平上差异都较小,同源性分别高达98.8％和97.9％,说明这起疫情是由同一个病毒传播链引起的.HSV-1等病毒引起的发热出疹性疾病需要与HFMD进行鉴别诊断,由于仅从临床症状和流行病学资料上判断引起发热出疹性疾病的病原体是非常困难的,因此,必须依赖于实验室的诊断.
关键词： 发热出疹性疾病 手足口病 序列非依赖的单引物扩增技术 单纯疱疹病毒1型 A基因型 -
siRNA干扰HSV1 gD糖蛋白基因的研究
以HSV1 gD糖蛋白基因为靶点,设计合成5对siRNA,并构建pEGFP-N1-gD融合表达质粒,脂质体法共转染Vero细胞,利用绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的特征,流式细胞仪筛选特异沉默gD表达的siRNA.然后有效siRNA转染Vero细胞并感染HSV1,通过空斑减数实验,Real-time PCR和子代病毒滴度评价其对HSV-1感染的作用.结果显示siRNA能有效抑制gD-EGFP融合蛋白和感染细胞内gD糖蛋白的表达,但对HSV-1的感染性无明显抑制作用,故选择gD作为siRNA抗病毒靶点还需进一步的论证.
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栀子提取物对单纯疱疹病毒1型感染小鼠VP16mRNA和IFN-γmRNA的影响
采用RT～PCR技术,分别在单纯疱疹病毒1型感染BALB/C小鼠4、7、10、14、21天时,检测小鼠脑内VP16mRNA和IFN～γ表达的变化,考察栀子提取物T9对病毒复制和宿主免疫的影响.结果显示,栀子提取物T9各给药组VP16 mRNA相对表达量在同一时间内均低于病毒对照组,其中T9低剂量组VP16 mRNA相对表达量在感染后第21天明显下降,T9高剂量组VP16 mRNA相对表达量随时间变化呈现持续降低状态;栀子提取物T9各给药组在除第4天外的其他时间点IFN-γmRNA相对表达量均高于病毒对照组,其中T9低剂量组IFN-γmRNA相对表达量在感染后第4天至第14天随时间变化而明显增高,之后表达量略有下降,T9高剂量组IFN-γmRNA相对表达量随时间变化呈现持续升高状态.结果提示,栀子提取物T9可能通过上调单纯疱疹病毒感染小鼠脑内IFN-γmRNA相对表达量,来抑制单纯疱疹病毒在小鼠脑内的复制.
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一种肉桂水提物抗单纯疱疹病毒1型活性研究
目的 评价一种肉桂水提物KPC-rg1对单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)的抗病毒活性,并探索其可能的广谱抗病毒作用.方法 体外培养Vero细胞,以HSV-1和HSV-1与KPC-rg1共孵育混悬液分别感染细胞,观察细胞形态并检测病毒载量;利用小鼠和树鼩角膜感染模型对HSV-1和HSV-1与KPC-rg1共孵育混悬液分别感染动物后的角膜病变情况进行评分;通过细胞病变效应实验和荧光衰减实验测定KPC-rg1对9种病毒的体外抗病毒活性.结果 被HSV-1感染的Vero细胞加入KPC-rg1 (0.0001～1.0 mg/ml)后对病毒复制有抑制作用,而HSV-1与KPC-rg1(0.001～1.0 mg/ml)共孵育后能保护细胞不被感染;KPC-rg1对HSV-1感染的动物角膜病变有一定的改善作用,而KPC-rg1与HSV-1共孵育后能完全保护动物不被HSV-1感染;KPC-rg1对多种包膜病毒有潜在的广谱抗病毒作用.结论 KPC-rg1是一种溶胶(丁达尔现象),可能与病毒能快速形成稳定的KPC-rg1/病毒超纳米颗粒结构,使病毒失去感染能力.KPC-rg1通过包裹HSV-1病毒抑制其感染,减少了潜伏或新增殖病毒对机体造成损伤,可缓解患者反复遭受病痛折磨.本研究丰富了肉桂水提物在抗病毒,特别是抗HSV-1的作用,为其开发成为潜在的抗HSV-1药物提供了初步科学依据.
关键词： 肉桂水提物KPC-rg1 单纯疱疹病毒1型 抗病毒 -
BALB/c小鼠在HSV-1不同条件感染下的临床与病理及病原差异分析
目的 探讨BALB/c小鼠模型在不同条件下感染HSV-1后的临床表现、病理现象及组织器官中的病毒分布特性,为HSV-1不同毒株感染模式小鼠的研究提供综合的参考指标体系.方法本研究利用HSV-1 17+和McKrae毒株,经滴鼻和角膜途径感染不同周龄的BALB/c小鼠,建立急性感染模式;经皮下和足垫途径感染不同周龄的BALB/c小鼠,建立慢性感染模式.结果 实验小鼠的临床、病理学、病原学指标的观察结果表明:虽然小鼠临床症状均表现为倒毛、弓背,但在不同条件下感染不同毒株的动物其体重和死亡率指标存在差异;定量PCR技术检测结果证实神经组织(脑、脊髓、三叉)内病毒载量的增殖趋势不同;病理学检查提示急性感染组仅脑组织中出现明显病理损伤,慢性感染组仅三叉神经中表现病理损伤.而慢性感染组动物的三叉神经组织,虽未检测到具有指标意义的潜伏相关转录本(latency associated transcript, LAT),但是其组织块与Vero细胞共培养却可导致细胞出现感染性病变.结论 HSV-1不同毒株经不同攻毒途径感染小鼠后,小鼠在体重、死亡率,毒株在机体内的复制模式等方面存在明显差异.因此,基于不同感染模式的相关研究,其观察指标侧重点应该不同.
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栀子提取物ZG对单纯疱疹病毒1型感染后细胞膜流动性的影响
目的 观察栀子提取物ZG对单纯疱疹病毒1型感染后宿主细胞膜流动性的影响,以探讨其抗病毒作用机理.方法 采用NBD-C6-HPC特异性荧光探针标记Hep-2细胞膜脂质,以肝素钠为阳性对照,借助激光共聚焦扫描技术检测栀子提取物ZG对病毒感染后宿主细胞膜流动性的影响.结果 正常细胞膜具有良好的流动性,漂白后荧光恢复率为73.89%;病毒感染后Hep-2细胞膜流动性显著降低,荧光恢复率为18.54%;栀子提取物ZG作用后细胞膜流动性明显恢复,荧光恢复率为61.21%;肝素钠作用后细胞膜流动性明显恢复,荧光恢复率为56.62%.结论 通过改善细胞膜的流动性,从而维持细胞膜的正常功能可能是栀子提取物ZG抗病毒感染的机理之一.
关键词： 栀子提取物ZG 单纯疱疹病毒1型 膜流动性 NBD-C6-HPC -
基因组编辑技术在1型单纯疱疹病毒研究中的作用和意义
病毒基因组编辑技术对研究病毒基因的功能及病毒感染性疾病的治疗有着不可或缺的作用。随着基因工程技术的发展，多种病毒基因组突变技术应运而生。传统的同源重组技术一直用于编辑病毒基因组，然而，该技术的重组频率极低。此后，基因组较大的病毒如单纯疱疹病毒1型(HSV-1)可以通过细菌人工染色体质粒系统进行编辑，但是将较大的病毒基因组克隆到细菌人工染色体质粒费力费时，并且质粒的部分基因或药物选择标记物可能残留在病毒基因组内而影响病毒基因的功能。2013年发现的CRISPR-cas9系统可以完成对各类DNA病毒高效准确的定点基因编辑，而且该系统在对病毒基因组进行编辑过程中不会遗留系统自身的遗传物质。本文就同源重组技术、细菌人工染色体和CRISPR-cas9系统这三类基因组编辑技术在 HSV-1相关研究中的应用进行简要综述。
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巢式PCR检测龈下菌斑中HCMV、EBV、HSV-1与慢性牙周炎活动性的关系
目的建立临床检测龈下菌斑标本中人巨细胞病毒(HCMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1) 巢式PCR方法,研究这3种病毒与慢性牙周炎活动性的关系. 方法收集62例慢性牙周炎患者(男性27例、女性35例,平均年龄53岁)的牙周炎活动部位、牙周炎静止部位的龈下菌斑,提取DNA后使用巢式PCR检测HCMV、EBV、HSV-1,比较分析其在同一病人不同部位的检出率. 结果牙周炎活动部位的HCMV检出率为38.7%,EBV的检出率为58%,HSV-1的检出率为30.6%,两种以上病毒合并感染的检出率为40.3%;牙周炎静止部位的HCMV检出率为14.5%,EBV为22.6%,HSV-1为11.3%,两种以上病毒合并感染的检出率为11.3%.这3种病毒及其合并感染在牙周炎活动部位的检出率均高于牙周炎静止部位,差异有统计学意义(P<0.05). 结论提示HCMV、EBV、HSV-1与慢性牙周炎的活动性相关.
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栀子提取物T9对单纯疱疹病毒1型感染小鼠脑内VP16mRNA的影响
目的 观察不同时间栀子提取物T9对单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染后的BALB/c小鼠脑内间层蛋白16(VP16)的影响,探讨栀子提取物T9抗HSV-1的作用机制.方法 采用对HSV-1易感的BALB/c小鼠,以HSV-1 VP16为研究对象,借助RT-PCR方法检测栀子提取物T9对小鼠脑内HSV VP16的影响.结果 栀子提取物T9各给药组在同一时间内VP16 mRNA相对表达量均低于病毒对照组.结论 栀子提取物T9能够使HSV感染小鼠脑内VP16 mRNA相对表达量降低,可能是它抗HSV的作用机制之一.
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栀子提取物ZG对单纯疱疹病毒1型吸附量的影响
目的 观察栀子提取物ZG对单纯疱疹病毒1型(HSV-1)吸附过程中病毒吸附量的影响,以探讨其抗病毒作用机理.方法 采用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)作为荧光探针标记病毒,以肝素钠为对照,借助流式细胞仪,通过收集多种不同的加药方式后细胞表面的荧光强度,来考察病毒吸附过程中病毒吸附量的变化及栀子提取物ZG对此变化的影响.结果 单纯疱疹病毒1型在Hep-2细胞表面吸附存在饱和性、特异性;肝素钠3种加药方式均能明显降低病毒吸附量,先加药后吸附及吸附和加药同时进行两种方式,优于先吸附后加药的方式,其吸附抑制率分别为84.76%和82.02%;栀子提取物ZG 3种加药方式均能明显降低病毒吸附量,其中以吸附和加药同时进行组为显著,吸附抑制率为68.46%.结论 栀子提取物ZG可能是通过作用于病毒吸附的多个环节来达到抑制HSV-1的吸附作用.
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三叉神经痛合并根区蛛网膜粘连的病毒病因学研究
目的 探讨原发性三叉神经痛(TN)合并根区蛛网膜粘连与HSV -1感染的关系.方法 对TN患者于显微血管减压术中见其三叉神经根区合并蛛网膜粘连者59例,取其蛛网膜作为实验组；未合并根区明显蛛网膜粘连的TN患者24例,取其蛛网膜作为病例对照组；采用PCR和Western Blot方法分别检测其HSV -1特异性DNA片段、特异性抗原,并以20例外伤患者蛛网膜做正常对照.结果 三组资料中DNA片段阳性率分别为:69％、58％和25％；实验组和病例对照组的DNA片段阳性率均高于正常对照组,且差异有统计学意义(P＜0.05),但实验组和病例对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)；病毒特异性抗原阳性率分别为:51％、25％和15％,实验组病毒抗原阳性率高于病例对照组,也高于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),而病例对照组和正常对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HSV -1病毒增殖性感染可能促使TN患者三叉神经根区蛛网膜的粘连,蛛网膜组织可能是HSV -1潜伏感染的另一基地；HSV -1病毒感染可能是TN又一致病因素.
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硅油抑制单纯疱疹病毒1型的体外实验研究
目的 通过体外实验的方法研究硅油对单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的抑制作用.方法 (1)滴定HSV-1型TCID50.(2)培养Hela细胞并接种于96孔板.(3)将HSV-1原液分别稀释为100TCID50、50 TCID50、30 TCID50、10 TCID50和1 TCID50.(4)将上述各浓度的HSV-1分别加到长满Hela细胞的96孔板中,每个浓度加到16个孔,其中8个孔另加0.1 mL硅油作为实验组,其余8个作为对照组.(5)再取8个孔加维持液和0.1 mL硅油作为实验组,8个孔只加维持液作为对照组.结果 (1)实验后32 h的30 TCID50实验组、实验后45 h的10 TCID50实验组、实验后51 h的1 TCID50实验组细胞病变均明显少于对照组(P＜0.01).(2)在病毒对照组中,30 TCID50、10 TCID50和1 TCID50孔中细胞分别于实验后45 h、58 h和58 h发生100%病变.(3)50 TCID50对照组和实验组以及100 TCID50对照组和实验组细胞于实验后32 h发生100%细胞病变(P＞0.05).结论 在体外实验中,硅油对HSV-1有明显抑制作用.其抑制作用大小与病毒的浓度有一定关系.
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清咽滴丸抗常见呼吸道病毒的实验研究
目的 研究清咽滴丸对呼吸道常见病毒的抑制作用.方法 应用MTT方法,检测清咽滴丸对单纯疱疹病毒(HSV-1)和腺病毒(ADV11)的直接抑制作用、侵入细胞的抑制作用.应用鸡胚培养法,检测清咽滴丸体外灭活流感病毒的作用.建立ICR小鼠感染流感病毒模型,观察并记录小鼠的死亡情况,检测肺指数、肺脏病理改变及T、B淋巴细胞增殖情况和脾指数.结果 ①清咽滴丸对HSV-1和ADVI1有直接抑制作用并且可抑制其侵入细胞.②鸡胚实验结果显示,清咽滴丸具有明显体外灭活病毒的作用.③动物实验结果显示,清咽滴丸不能降低动物的死亡率,但却可明显延长其平均存活时间;对肺脏有较好的抗交作用;有刺激免疫细胞增殖,调节机体免疫功能的作用.结论 清咽滴丸有明确的体外灭活病毒和一定的抗流感病毒鼠肺适应株(FM1)和调节机体免疫力的作用.在抗HSV-1和ADV11实验中,表现出确切的直接抑制作用和阻断病毒侵入细胞的作用.
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HSV-1基因转移载体在荷瘤裸鼠体内的生物分布研究
目的 研究HSV-1基因转移栽体在BALB/c荷瘤裸鼠体内的生物分布.方法 BALB/c裸鼠注射人乳腺癌MCF-7细胞制备肿瘤模型,瘤体内注射1×107pfu HSV-1,每2天给药1次,共给药3次.分别于给药后24h、5d和17d采集组织脏器,采用Taqman实时荧光定量PCR法,检测不同组织脏器中HSV-1基因拷贝数.结果 成功制备裸鼠肿瘤模型.在不同时间点,肿瘤中检测到的病毒载体多,且随着时间延长不断增加；淋巴结、背根神经节和性腺中也有较高水平的病毒载体；其他组织器官中病毒载体量较少.结论 HSV-1能为基因转移提供有效、安全的载体平台,并能用于构建溶瘤基因治疗产品.
关键词： 单纯疱疹病毒1型 肿瘤模型 生物分布 实时定量聚合酶链反应 -
白介素2基因佐剂协同单纯疱疹病毒1型糖蛋白D核酸疫苗免疫诱导的特异性免疫应答
目的研究白介素2(IL-2)cDNA协同单纯疱疹病毒1型(HSV-1)gD核酸疫苗免疫对机体体液免疫和细胞免疫应答的影响,以及在HSV-1病毒角膜攻击时的保护效果.方法利用pcDNA3.1载体分别构建HSV-1糖蛋白D和IL-2的真核表达质粒pgD和pIL-2,体外鉴定其表达.动物实验分为pcDNA3.1空载体对照组、pgD单独免疫组和pgD+pIL-2联合免疫组3组,具体为通过肌肉免疫接种BALB/c小鼠3次,间隔2周,每次接种质粒100μg,第3次免疫后2周,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体滴度并做亚型分析,利用3H-TdR掺人法进行Th细胞增殖实验,ELISA试剂盒检测Th细胞分泌的IL-2、IFN-γ和IL-10水平,耳廓肿胀实验检测迟发型超敏反应(DTH)反应;HSV-1病毒角膜攻击后,裂隙灯显微镜观察角膜上皮病变.结果与pgD单独免疫组相比,pIL-2的协同免疫可以显著提高IgG2a抗体滴度、Th细胞增殖反应和DTH反应,Th细胞分泌IL-2和IFN-γ水平也显著提高,IL-10水平明显下降.在动物保护实验中,pIL-2的协同免疫明显增强了pgD疫苗在病毒攻击时对角膜的保护效果.结论IL-2 cDNA的协同免疫可以显著提高pgD核酸疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫应答水平,增加核酸疫苗的免疫保护效果.
