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2012-2016年广州市人感染恙虫病东方体基因型与流行病学特征分析
目的 了解广州市2012-2016年人感染恙虫病东方体的基因分型与流行病学特征.方法 收集2012-2016年广州市临床诊断恙虫病患者全血,利用巢式聚合酶链式反应(PCR)扩增56 kDa型特异性抗原基因并测序,通过MEGA 5.0软件构建系统发生树并进行同源性分析.结果 共收集到临床诊断恙虫病患者标本906份,其中220份经巢式PCR检测阳性(阳性率24.3％),包括Karp型138株、Kato型29株、Gilliam型39株和TA763型13株,另有1株未确定型别.两个发病高峰期为5-6月和9-10月,发病区域集中在从化区、增城区等农村地区.结论 近年来广州市恙虫病东方体基因型呈现多样性,但以Karp型为主要流行型,需要加强对恙虫病东方体的分子流行病学监测分析工作.
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多重-巢式PCR检测食品中单增李斯特菌研究
[目的] 建立多重-巢式PCR联合检测体系快速检测食品中的单增李斯特菌.[方法] 针对单增李斯特菌中多个稳定的特异性基因(hlyA、plcB、prfA、iap),设计并筛选出6对引物用于多重PCR、2对引物用于巢式PCR,组成多重-巢式PCR联合检测单增李斯特菌,并对珠海地区6类冷冻冷藏食品中单增李斯特菌的带菌情况进行了初步调查.[结果] 建立的多重-巢式PCR联合检测体系特异性良好,多重PCR的灵敏度达到1×102cfu/ml,巢式PCR的灵敏度达到1×101cfu/ml.在检测的3439份样品中,单增李斯特菌阳性率达22.39%.[结论] 该检测体系具有快速可靠、灵敏准确及特异性好的特点,有效缩短了检验周期,从传统的14d缩短到2d.对珠海地区6类冷冻冷藏食品中单增李斯特菌的带菌情况有了一定了解.
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反复自然流产孕妇流产组织中人细小病毒B19的检测意义
目的:探讨HPV B19感染与反复自然流产(RSA)的关系.方法:建立人细小病毒B19巢式PCR检测方法,检测RSA孕妇流产组织和正常妊娠人工流产组织中HPV B19 DNA.结果:检测HPVB19的巢式PCR方法具有很好的特异性和敏感性;42例RSA孕妇流产组织中HPV B19 DNA阳性率26.2%(11/42),40例正常妊娠人工流产组织中HPV B19 DNA阳性率2.5%(1/40),两组HPV B19感染率差异有统计学意义(χ2=9.20,P＜0.01).不同流产次数组HPV B19 DNA阳性率差异无统计学意义(χ2=0.06,P＞0.05).结论:HPV B19感染可能与反复自然流产的发生有关.
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左归丸抗乳腺癌破骨性骨转移机制探讨
目的:研究左归丸的抗乳腺癌破骨性骨转移作用,并探讨其机制.方法:采用左心室注射人乳腺癌MDA-MB-231细胞法建立裸鼠乳腺癌实验性骨转移模型,实验分为空白组、左归丸(21,42 g·kg-1)组,采用巢式PCR特异性扩增裸鼠骨髓中人细胞角蛋白(CK19),确定肿瘤细胞在骨髓组织中的转移情况.体外分离小鼠破骨细胞前体细胞小鼠骨髓巨噬细胞(BMMs),外源性加入核转录因子-κB(NF-κB)受体活化因子配体(sRANKL),模拟肿瘤条件下破骨细胞活化,观察左归丸对破骨细胞活化、组织蛋白酶K(Cathepsin K)分泌以及骨片吸收的影响.采用免疫印迹法(Western blot)检测破骨细胞前体细胞NF-κB受体活化因子(RANK)表达的影响.结果:与空白组比较,左归丸(21,42 g·kg-1)组均可显著抑制乳腺癌骨转移动物骨髓组织中人CK19表达的影响(P＜0.01).体外血清药理学研究表明,左归丸含药血清可显著抑制BMMs分化为具有多细胞核的破骨细胞(P＜0.05),同时可明显抑制破骨细胞分泌Cathepsin K(P＜0.05).10％左归丸含药血清组的骨片吸收窝的数量和面积明显低于正常大鼠血清组(P＜0.05).Western blot实验结果表明,左归丸含药血清可明显抑制RANK蛋白表达(P＜0.05).结论:左归丸具有明显的抗乳腺癌破骨性骨转移作用,RANKL/RANK系统活性可能是其作用机制之一.
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人细小病毒B19在结直肠癌中表达增强
目的 探讨人类细小病毒B19感染与结直肠癌的关系.方法 运用巢式PCR检测50例结直肠癌患者的肿瘤组织和对应的癌周结直肠组织以及10例正常成人结肠组织中的B19 DNA,免疫组化检测B19结构蛋白VP1/VP2.结果 肿瘤组织B19 DNA阳性率为96%,显著高于癌周(60%)及正常对照(60%).免疫组化显示,腺癌组织82%VP1/VP2蛋白表达,显著高于癌周组织(30%)及正常对照(20%).结论 人细小病毒B19可能在结直肠癌的发生中起一定作用,为探讨结直肠癌的发病机制提供新思路.
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巢式PCR检测日本血吸虫感染的研究
本研究通过设计2对巢式引物扩增日本血吸虫高拷贝的Sjα1基因片段,建立检测日本血吸虫感染的巢式PCR技术,并对感染小鼠血清、全血样本以及实验和现场钉螺样本进行检测.建立的巢式PCR方法特异性扩增日本血吸虫420 bp的Sjα1片段,和曼氏血吸虫没有交叉,基因组DNA作为模板时低检测量为0.1fg.小鼠感染日本血吸虫后2周的血清样本中即能检测出特异性DNA,建立的方法能同时检测血清和全血标本.钉螺实验感染4 h后能检测到日本血吸虫DNA,现场采集钉螺的检测结果显示比传统的镜检方法敏感性高.建立的巢式PCR检测日本血吸虫感染具有较高的敏感性和特异性,为疾病诊断和媒介调查提供了新的分子生物学检测技术.
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应用巢式PCR对恶性疟原虫培养中支原体污染的检测
目的 应用巢式PCR检测恶性疟原虫体外培养中的支原体污染. 方法 根据支原体16s和23s保守序列设计PCR引物,应用巢式PCR检测恶性疟原虫体外培养中的支原体. 结果 体外培养的恶性疟原虫标本16份,PCR检测支原体均阳性,经测序比对后确认为口腔支原体.已知阴性对照无扩增带. 结论 应用巢式PCR能敏感和特异地检出恶性疟原虫体外培养中的支原体.
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巢式PCR扩增恶性疟原虫DHFR基因直接测试序列的意义
目的 巢式PCR方法扩增恶性疟原虫DHFR基因直接进行DNA序列测序.方法 在巢式PCR程序中,设置2次退火(退火45 ℃45 s;退火65 ℃ 1 min),产生足量的DNA模板,进行其序列测试.结果 共测试2组样本,dhfr基因序列全长218样本为647 bp,217样本为692 bp,其中218样本在170、193、341位点发生变异.结论 该方法省时,节约材料,可满足现场快速凋查恶性疟原虫耐药基因的要求.
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我国西北地区蜱土拉弗菌感染的检测与基因分型研究
目的:了解我国西北部分地区蜱土拉弗菌自然感染状况及基因型别特征.方法:采用布旗法收集蜱标本,鉴定种属后采用巢式PCR检测土拉弗菌的fopA基因,阳性标本用型特异性引物鉴定细菌种,通过两短串联重复序列(SSTR9、SSTR16)位点扩增进行基因型分析,用生物学软件对序列进行比较.结果:共捕获11个蜱种、2460只蜱标本,PCR扩增土拉弗菌fopA基因7个蜱种75只阳性,总阳性率为3.05%,不同蜱种阳性率差异有统计学意义(x2=20.91,P<0.01),以日本血蜱的阳性率高,为17.39%.所有阳性标本均属于B亚种.75份阳性蜱标本在SSTR9区共有9种不同的基因型,其中拷贝数为9的基因型在阳性蜱标本中占40.o0%(30/75);不同地区的阳性标本在SSTR9区基因型别存在明显交叉,而在SSTR16区有完全相同的序列及重复序列的拷贝数.结论:我国西北部分地区存在蜱土拉弗菌感染,且细菌的基因型丰富、复杂.
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巢式PCR法在日本血吸虫易感水域哨鼠监测中的应用
目的 建立巢式PCR法用以辅助日本血吸虫易感水域中哨鼠的监测.方法 选择日本血吸虫基因组重复序列DNA SjR2(2456～3171 bp)作为外道PCR的区域,其中2719～3019 bp作为内道PCR的扩增区域.以不同稀释度的日本血吸虫成虫基因组DNA为模板进行敏感性测试,并对未感染和感染10条、40条尾蚴的小鼠血清进行检测.将巢式PCR法用于2013年8个哨鼠监测点的监测,观察其应用价值.结果 巢式PCR中内道引物扩增产物为301 bp,血吸虫基因组DNA浓度低至10-5 ng/μl时,仍扩增阳性;以10条和40条尾蚴感染4周的小鼠血清DNA为模板进行巢式PCR,结果为阳性.将巢式PCR用于2013年血吸虫易感水域小范围哨鼠的监测,第2组的20只小鼠中有2只阳性,但解剖小鼠未检出虫体.结论 巢式PCR法可辅助血吸虫易感水域中哨鼠的监测,特别对感染度较低水域的监测有一定帮助.
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云南省卵形疟原虫的实验室诊断研究
目的 通过实验室综合诊断一例卵形疟原虫感染,为云南省鉴别当地罕见疟原虫虫种提供借鉴. 方法 对一例尼日利亚务工回国疟疾病例采血,制作厚、薄血涂片,经Giemsa染色后在油镜下观察薄血膜疟原虫形态,鉴定虫种.针对P.v、P.f、P.m、P.o4种疟原虫的18S rRNA基因进行巢式PCR扩增并测序,在GenBank分别与P.f的M19172和P.o的KC866363、HQ697267、KF192072、KF192073、KJ871672、AF145337、KC633223、L48987参比虫株进行Blast比对,应用MEGA5.1软件进行DNA序列同源性比较并绘制系统进化树. 结果 显微镜下可观察到成熟度各异的卵形疟原虫滋养体和裂殖体,薄血膜中被寄生的红细胞大小正常或稍胀大,变形,边缘呈伞矢状或锯齿状,并有凹凸、拖尾、毛刺等卵形疟特征性形态,经巢式PCR扩增出约800 bp的卵形疟特异性基因片段,经Blast比对与GenBank中已知卵形疟部分参比虫株18S rRNA的同源性为89％～91％. 结论 经镜检、巢式PCR、测序及同源性分析,基本证实该例自尼日利亚务工回国的疟疾病例为卵形疟原虫感染.
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3种常见呼吸道病毒检测基因芯片的制备
目的 建立一种可同时检测鼻病毒、呼吸道合胞病毒以及腺病毒的基因芯片方法. 方法 根据GenBank已发表的鼻病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒的基因序列,应用生物学软件设计相应的引物和寡核苷酸探针,构建检测芯片；使用巢式PCR扩增标记目的片段,将其与检测基因芯片进行杂交和扫描分析；通过特异性、灵敏性和重复性试验评估基因芯片方法. 结果 设计的全部探针均能与相应的标记样品特异性杂交,其中探针1a和1b可特异检测鼻病毒；探针2a、2b和2c可特异检测呼吸道合胞病毒,探针3a和3b可特异检测腺病毒.基因芯片法检测3种病毒的低拷贝数分别是2.59×10 2个/μl、2.21×101个/μl和2.05×102个/μl. 结论 构建的基因芯片可特异性检测样品中低滴度的鼻病毒、呼吸道合胞病毒以及腺病毒,有望为临床提供确诊依据.
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巢式PCR在弓形虫检测和基因研究中的应用进展
弓形虫是一种专性细胞内寄生的寄生虫,人感染后多呈隐性感染,临床检测及诊断困难.巢式PCR是利用2套引物,对靶细胞基因2次识别并进行2轮扩增的方法,它可从极少量的模板中获得较高浓度和纯度的靶片段,在弓形虫的检测和基因研究中具有敏感性高、特异性强、稳定性好的优点.本文对巢式PCR在弓形虫中的应用进行了综述.
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新疆伽师县荒漠型黑热病流行区人群利什曼原虫感染调查
目的 了解新疆伽师县荒漠型黑热病流行区人群利什曼原虫感染现状,为荒漠型流行区利什曼病传染源研究提供依据. 方法 2014年4月在伽师县荒漠型黑热病流行区卧托里格拉克乡采集既往黑热病患者及其家属静脉血,制作滤纸血片.以核糖体转录间隔区(ITS-1)为目的基因,采用巢式PCR检测滤纸血片中利什曼原虫特异性DNA片段,并对检测结果进行统计分析. 结果 共检测滤纸血片110份,PCR阳性率为88.18％(97/110).其中既往患者血样PCR阳性率为88.89％(40/45),既往患者家属血样PCR阳性率为81.54％(53/65),差异无统计学意义(x2=1.10,p＞0.05). 结论 伽师县荒漠型黑热病流行区居民利什曼原虫无症状感染率较高,须进一步研究无症状感染者在利什曼病传播中的作用.
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宕昌县人群及家养动物利什曼原虫感染与流行现状调查
目的 调查甘肃山丘型黑热病流行区人群及家养动物利什曼原虫感染与流行现状. 方法 选择山丘型黑热病流行区甘肃省宕昌县行政村,通过人户问卷调查及血样巢式PCR检测,调查当地人群及家养动物利什曼原虫感染现状,应用IBM SPSS21.0及SAS9.3对黑热病相关影响因素进行统计分析. 结果 共调查当地居民215人,家犬40只,驴、羊、马等家畜共计35头.人群血样利什曼原虫巢式PCR检测阳性率为22.74％(49/215),犬血样阳性率为22.54％(9/40),驴和马各有一匹阳性.单因素分析劳动年龄人口分组、是否养犬、是否有畜圈、夏秋季是否使用蚊帐、夏秋季晚间户外活动频率不同的人群组间巢式PCR阳性率有统计学差异(P＜0.05);多因素分析劳动年龄人口分组与夏秋季晚间户外活动频率纳入多因素回归模型.结论 甘肃省宕昌县山丘型黑热病流行区存在大量无症状感染人群,也存在家畜利什曼原虫感染.当地非劳动年龄人口(儿童、老年人)感染率较高,夏秋季晚间户外活动频繁是感染利什曼原虫的危险因素.
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巢式PCR用于疑似莱姆病患者血清标本检测的研究
目的 研究rrf(5S)～rrl(23S)rRNA基因间隔区巢式PCR用于疑似莱姆病患者血清标本的检测效果.方法 收集疑似莱姆病患者血清标本及其流行病学和临床资料,提取DNA进行巢式PCR、普通PCR检测.结果 共收集102份疑似莱姆病患者血清,巢式PCR检测阳性39例,阳性率为38.23％,其中蜱叮咬时间在2个月内的为33例,占84.62％;普通PCR只有1份阳性,阳性率为0.98％,远低于巢式PCR(38.23％).结论 rrf(5S)～rrl(23S)rRNA基因间隔区巢式PCR可用于疑似莱姆病患者血清标本检测,从病原学角度支持莱姆病的诊断.
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巢式PCR法检测髓系白血病患者外周血人类疱疹病毒-6的DNA
人类疱疹病毒-6型(human herpesvirus-6,HHV-6)是一种常见的病毒,与多种人类疾病有关.由于研究过程所采取方法不同,对于白血病病人感染HHV-6情况的报道也不一致.本研究首次运用巢式PCR检测了38例髓系白血病病人外周血单个核细胞中的HHV-6 DNA,其中急性髓性白血病(AML)30例和慢性粒细胞白血病(CML)8例.结果显示:与正常对照HHV-6的DNA检出率相比,AML患者的阳性率明显降低,而CML中则无明显异常,其临床意义有待进一步探讨.
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巢式PCR检测龈下菌斑中HCMV、EBV、HSV-1与慢性牙周炎活动性的关系
目的建立临床检测龈下菌斑标本中人巨细胞病毒(HCMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1) 巢式PCR方法,研究这3种病毒与慢性牙周炎活动性的关系. 方法收集62例慢性牙周炎患者(男性27例、女性35例,平均年龄53岁)的牙周炎活动部位、牙周炎静止部位的龈下菌斑,提取DNA后使用巢式PCR检测HCMV、EBV、HSV-1,比较分析其在同一病人不同部位的检出率. 结果牙周炎活动部位的HCMV检出率为38.7%,EBV的检出率为58%,HSV-1的检出率为30.6%,两种以上病毒合并感染的检出率为40.3%;牙周炎静止部位的HCMV检出率为14.5%,EBV为22.6%,HSV-1为11.3%,两种以上病毒合并感染的检出率为11.3%.这3种病毒及其合并感染在牙周炎活动部位的检出率均高于牙周炎静止部位,差异有统计学意义(P<0.05). 结论提示HCMV、EBV、HSV-1与慢性牙周炎的活动性相关.
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检测病毒性肝炎患者血清中SEN病毒及其临床意义
目的检测病毒性肝炎患者血清中SEN病毒D和H(SENV-D、SENV-H),并探讨其临床意义. 方法采用巢式聚合酶链反应法(nPCR)检测甲、乙、丙、戊型肝炎和非甲～戊型肝炎患者血清中SENV-D和 SENV-H DNA. 结果在180例病毒性肝炎患者血清中,SENV-D和SENV-H 检出率分别为17.2%(31/180)和5.6%(10/180),总检出率为18.3%(33/180).甲、乙、丙、戊型肝炎患者的SENV-D/H检出率高于非甲～戊型肝炎患者.从甲、乙、丙、戊型肝炎和非甲～戊型肝炎患者中分离的SENV-D/H核苷酸序列,与SENV-D/H原型株比较,其同源性在94%以上.甲、乙、丙和戊型肝炎患者有无SENV-D/H合并感染,其血清生化学指标无明显差异. 结论 SENV-D/H可能不是非甲～戊型肝炎的病原,甲、乙、丙和戊型肝炎患者合并感染SENV-D/H并不加重病情.
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NSCLC患者外周血中三种肿瘤标志物mRNA联合检查的意义
目的对NSCLC患者外周血LUNX、CEA和SCC的mRNA进行联合检测,并探讨其意义.方法标本为外周血分3组.肺癌组50例;良性疾病10例;健康志愿者15例.应用Nested PCR对外周血LUNX、CEA和SCC的mRNA进行检测.任意一种或一种以上标志物mRNA定为阳性.分析PCR检测结果与NSCLC各项临床指标之间的关系,行统计分析.结果肺癌组74.0%(37/50)例为阳性;良性疾病和健康对照组均为阴性.肺癌组中,Ⅰ期的患者仍有33.3%(3/9)呈现阳性,阳性率随肿瘤临床分期而升高(P＜0.05),而与患者性别、肿瘤分化程度、病理类型无统计学意义上的相关性.在肺癌组中各标志物的表达率为LUNX52.0%(26/50),高于CEA30.0%(15/50)和SCC16.0%(8/50),差异有显著性(P＜0.05).结论LUNX mRRNA是NSCLC外周血微转移检测的较好标志物.NSCLC微转移发生早,发生率较高.提示即使病理分期较早的患者手术后仍有可能发生远处转移.应用PCR法对NSCLC患者进行有LUNX mRNA组合的联合检测,有利于早期发现微转移,利于制定更优化的治疗策略.
