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左归丸抗乳腺癌破骨性骨转移机制探讨
目的:研究左归丸的抗乳腺癌破骨性骨转移作用,并探讨其机制.方法:采用左心室注射人乳腺癌MDA-MB-231细胞法建立裸鼠乳腺癌实验性骨转移模型,实验分为空白组、左归丸(21,42 g·kg-1)组,采用巢式PCR特异性扩增裸鼠骨髓中人细胞角蛋白(CK19),确定肿瘤细胞在骨髓组织中的转移情况.体外分离小鼠破骨细胞前体细胞小鼠骨髓巨噬细胞(BMMs),外源性加入核转录因子-κB(NF-κB)受体活化因子配体(sRANKL),模拟肿瘤条件下破骨细胞活化,观察左归丸对破骨细胞活化、组织蛋白酶K(Cathepsin K)分泌以及骨片吸收的影响.采用免疫印迹法(Western blot)检测破骨细胞前体细胞NF-κB受体活化因子(RANK)表达的影响.结果:与空白组比较,左归丸(21,42 g·kg-1)组均可显著抑制乳腺癌骨转移动物骨髓组织中人CK19表达的影响(P＜0.01).体外血清药理学研究表明,左归丸含药血清可显著抑制BMMs分化为具有多细胞核的破骨细胞(P＜0.05),同时可明显抑制破骨细胞分泌Cathepsin K(P＜0.05).10％左归丸含药血清组的骨片吸收窝的数量和面积明显低于正常大鼠血清组(P＜0.05).Western blot实验结果表明,左归丸含药血清可明显抑制RANK蛋白表达(P＜0.05).结论:左归丸具有明显的抗乳腺癌破骨性骨转移作用,RANKL/RANK系统活性可能是其作用机制之一.
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大黄素对兔主动脉平滑肌细胞Cat K,Cat D mRNA表达的影响
目的:探讨大黄素对兔主动脉平滑肌细胞(CCC-SMC-1)组织中蛋白酶K(Cat K),组织蛋白酶D(Cat D)mRNA表达的影响.方法:以2×104/mL密度接种细胞,实验分5个实验组,大黄素0.01,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25 mmol·L-组,对照组为培养基空白组,培养24 h,每组设5个复孔.MTT法观察大黄素对兔主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用,PCR法检测大黄素对兔主动脉平滑肌细胞Cat K,Cat D mRNA的表达.结果:MTT法显示大黄素在0.05～ 0.25 mmol·L-1浓度对CCC-SMC-1细胞增殖有抑制作用,作用24 h后的半数抑制浓度(IC50)为0.10 mmol·L-1,且IC50随作用时间的延长显著前移.PCR法显示,不同浓度的大黄素作用于兔主动脉平滑肌细胞24 h后,与正常组细胞相比,Cat K,Cat D mRNA表达上调(P＜0.05).结论:大黄素能抑制CCC-SMC-1细胞的增殖,其机制可能与上调Cat K,Cat D mRNA表达有关.
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莪术油对人肺腺癌A549细胞中组织蛋白酶D,K表达的影响
目的:探讨莪术油对A549细胞中胶原及组织蛋白酶D,K表达的影响.方法:用不同浓度的莪术油(0,40,80,120 mg·L-1)作用A549细胞,苦味酸天狼猩红染色法观察莪术油对A549细胞层胶原分泌的动态变化；酶法测定细胞中可溶性羟脯氨酸的分泌；Western blot检测Cat D,Cat K的表达情况.结果:莪术油刺激细胞后A549细胞分泌的胶原含量随剂量和作用的时间增加而减少.Cat D,Cat K蛋白的表达随作用时间持续而增强.结论:莪术油减少肺腺癌A549细胞胶原沉积,其机制可能与上调Cat D,Cat K蛋白表达有关.
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组织蛋白酶K在黑色素细胞病变中的表达及意义
目的 研究组织蛋白酶K在黑色素细胞病变中的表达情况,评价其在黑色素细胞病变诊断及鉴别诊断中的应用价值.方法 收集41例恶性黑色素瘤、29例色素痣(6例非典型性痣及23例普通痣)的存档蜡块、病理及临床资料,应用免疫组化方法检测组织蛋白酶K、S-100、HMB45、melan-A在黑色素细胞病变中的表达,同时与多种非黑色素细胞肿瘤进行对照.结果 70例黑色素细胞病变中组织蛋白酶K的平均阳性率为87.8％,S-100、HMB45和melan-A的平均阳性率分别为90.2％、58.5％和68.3％ (P ＜0.01),57例非黑色素细胞肿瘤均为(-).结论 组织蛋白酶K在黑色素细胞病变中的表达具有较高的敏感性和特异性,对黑色素细胞病变的诊断、鉴别诊断具有较高的应用价值.
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血管周上皮样细胞肿瘤免疫表型分析
目的 研究血管周上皮样细胞肿瘤(PEComa)的免疫表型和分子遗传学改变及其与临床病理特征的关系.方法 收集25例PEComa患者的存档蜡块、病理及临床资料,采用免疫组织化学(SP法或EnVision法)检测相关免疫标志物,同时以多种肿瘤进行对照.运用荧光原位杂交(FISH)方法检测25例PEComa中TFE3基因的易位及扩增情况.结果 25例患者年龄21 ～61岁(平均43岁),男女比例为1∶1.3.22例为肝脏和肾脏的血管平滑肌脂肪瘤(AML),由成熟脂肪组织、梭形或上皮样平滑肌细胞和特征性的厚壁血管组成；3例为肝肾外PEComa,形态与经典AML有明显区别,肿瘤由单行性上皮样或梭形细胞构成,呈片状、巢状排列.免疫组织化学结果显示:25例PEComa组织蛋白酶K(cathepsin K)均呈强阳性(100％,25/25),HMB 45、Melan A和平滑肌肌动蛋白(SMA)的阳性率分别为80％ (20/25)、88％ (22/25)和88％(22/25),阳性瘤细胞占所有瘤细胞的百分比平均值:cathepsin K为90％、HMB 45为36％、Melan A为41％、SMA为35％.TFE3在肝肾AML中全部阴性(22/22),而在肝肾外PEComa中均为阳性(3/3).经FISH证实25例PEComa均不存在TFE3基因融合或扩增.结论 肝肾外PEComa的组织学形态与经典AML有明显区别,其发病与TFE3蛋白高表达关系密切,可能为独立的PEComa分子亚型.cathepsin K在PEComa中阳性率高,敏感性优于HMB 45、Melan A和SMA,可用于PEComa与其他常见的多种肿瘤的鉴别诊断.
关键词： 血管肿瘤 上皮样细胞 免疫组织化学 组织蛋白酶k 小眼畸形相关转录因子 -
骨质疏松相关信号通路--药物潜在靶点
骨重建是正常成年脊椎动物的骨骼保持自我更新的过程,当此协调失衡,骨吸收超过骨形成时,即导致骨质疏松.目前预防和治疗骨质疏松症的药物主要涉及的信号途径:NF - KB受体活化基因配体(Receptor activator of nuc lear factor kappa B ligand,RANKL)、Wnt信号通路、组织蛋白酶K.也成为近年来骨质疏松研究中的一个热点.
关键词： 骨质疏松 NF-KB受体活化基因配体 Wnt信号通路 组织蛋白酶k -
肥胖症患者脂肪组织中组织蛋白酶K的表达及其功能初探
研究组织蛋白酶K(cathepsin K, CTSK)在肥胖症患者脂肪组织中的表达及其在脂肪细胞分化中所起的作用.采用半定量RT-PCR及Western-blot分析显示肥胖组脂肪组织CTSK水平显著高于对照组,其表达随脂肪细胞分化成熟而逐渐增加.脂肪组织CTSK水平是肥胖症和脂质生成的一个较为敏感的标志物.
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组织蛋白酶K抑制剂Odanacatib的研究进展
组织蛋白酶K是一种在破骨细胞高表达的溶酶体蛋白酶,在骨胶原的降解过程中发挥关键作用.临床前研究证实,组织蛋白酶K抑制剂可以逆转去卵巢动物的骨量流失,恢复其骨强度.Odanacatib是一种高度选择性的组织蛋白酶K抑制剂,几乎不产生硬斑病样皮肤病变.一项为期3年、对绝经后骨量减少或骨质疏松症的临床研究发现,较之安慰剂组,Odanacatib治疗组的骨密度明显升高,治疗效果与目前广泛应用的双膦酸盐等抗吸收药物相当,除此之外还具有不抑制骨形成的优点.
关键词： 组织蛋白酶k Odanacatib 骨质疏松症 抑制剂 -
组织蛋白酶K在骨关节炎软骨中的表达及作用
目的 检测组织蛋白酶k(Cathepsin-k)在人骨关节炎软骨中的表达和分布,探讨组织蛋白酶k表达与骨性关节炎软骨退变之间的关系.方法 收集正常组、早期及中晚期组软骨标本.免疫组化方法及逆转录PCR方法检测组织蛋白酶k在软骨中的表达及分布.结果 组织蛋白酶k在OA软骨基质破坏区域周围巢聚软骨细胞表达明显增高,而正常软骨细胞仅有少量表达.早期及中晚期骨关节炎组软骨中组织蛋白酶K较正常组明显升高,差异具有显著性意义(P＜0.05);在mRNA表达水平上,中晚期组较早期组有明显增高,差异具有显著性意义(P＜0.05).结论 组织蛋白酶k与骨关节炎软骨退变关系密切,特别在早期发病中有重要作用.
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健骨颗粒含药血清对体外破骨细胞CAⅡ、CK、MMP-9mRNA表达的影响
目的 通过观察补肾健脾中药健骨颗粒含药血清对体外破骨细胞CA Ⅱ、CK、MMP-9mRNA表达的影响,进一步揭示健骨颗粒有效防治绝经后骨质疏松症的作用机制.方法 用M-CSF和RANKL诱导破骨前体细胞RAW264.7分化为成熟破骨细胞,alamarBLue法检测破骨细胞血清干预的佳浓度,于破骨细胞培养第7天开始干预,分别用25％浓度的健骨颗粒含药血清和25％浓度的生理盐水血清干预,培养48小时后抽提总RNA,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、实时荧光定量SYBRGREEN法检测CA Ⅱ、CK、MMP-9mRNA表达,并取骨片行甲苯胺蓝染色,计算分析骨陷窝数和骨吸收面积,同时运用氧化显色法检测破骨细胞培养液中TRAP含量,ELISA法检测骨磨片培养液中CTx含量.结果 健骨颗粒含药血清组破骨细胞CA Ⅱ、CK、MMP-9mRNA表达水平明显低于生理盐水血清组(P＜0.05),含药血清组骨磨片的骨陷窝数和骨吸收面积以及TRAP和CTx含量均低于生理盐水血清组(P＜0.05).结论 健骨颗粒能有效抑制破骨细胞CA Ⅱ、CK、MMP-9mRNA表达,降低破骨细胞功能活性,抑制破骨细胞对骨基质的分解,从而抑制骨吸收.
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血清抗酒石酸酸性磷酸酶-5b和组织蛋白酶K随年龄及绝经变化的分析
目的 调查西南地区不同年龄组健康女性抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRACP-5b)、组织蛋白酶K(CTSK)的总体趋势和分布情况,并确定绝经状态对二者的影响.方法 共研究了2125名女性[包括绝经前( n=1557)和绝经后( n=568)妇女,年龄分别为20~79岁].所有纳入研究的女性均在标准化条件下采集静脉血样,并采用 ELISA法测定血清中 TRACP-5b和CTSK含量,通过双能X射线吸收测定法测定腰椎(L1-L4)和股骨颈的骨密度(BMD)值.结果 随着年龄的增加,TRACP-5b、CTSK发生适度变化,均逐渐增加,并且在60岁以后TRACP-5b和CTSK水平均保持稳定.与绝经前妇女相比,绝经后妇女的血清TRACP-5b、CTSK、完整PTH均显著增加(P＜0. 05),而Mg水平均显著降低(P ＜0. 05).与绝经前相比,不同绝经年限妇女的TRACP-5b、CTSK水平均显著增加(P ＜0. 05).逐步多元线性回归分析发现,年龄、BMI、FSH、LH和PTH是TRACP-5b的影响因素,CTSK的影响因素包括年龄、BMI、FSH、LH和PTH.结论 建立的TRACP-5b、CTSK参考区间值有助于在很长时期内评估该西南地区妇女骨转换情况.
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补肾壮骨方对去卵巢大鼠骨结构和骨代谢作用的研究
目的 研究补肾壮骨方对骨质疏松大鼠骨结构和骨代谢的影响及其可能的作用机制.方法 用SD雌性大鼠复制去卵巢骨质疏松模型,然后分别灌服补肾壮骨方水提液高剂量(1.4 g/kg)和低剂量(0.7 g/kg)12周.用生化法测定血清钙(S-Ca)、血清磷(S-P)、尿钙(U-Ca∕Cr),尿磷(U-P/Cr)以及血清中高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)的含量;Elisa法测定Ⅰ型胶原氨基端前肽(procollagenⅠN-terminal propeptide,PINP)、Ⅰ型胶原羧基端肽(collagenⅠcarboxyl terminal peptide,CTX-I)、尿脱氧吡啶啉(deoxypyridine,DPD)、骨钙素(osteocalcin,OCN)的含量;用放免法测定血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性;用双能X线(DEXA)法、Viva CT和万能试验机测定骨密度、骨微结构和骨生物力学特性;用Western blot法测定骨组织蛋白酶(cathepsin)K表达.结果 补肾壮骨方水提液能升高血清中的钙、磷、HDL-C和PINP的含量,降低血清中TC、TG、LDL、ALP、OCN和CTX-I及尿液中的钙、磷、DPD的含量.同时,补肾壮骨方水提液可以升高去卵巢大鼠股骨的骨密度,改善骨微结构,增加骨强度,降低胫骨Cathepsin K的表达水平.结论 补肾壮骨方水提液能够抑制去卵巢大鼠的骨量丢失和骨强度下降,改善去卵巢大鼠的骨代谢,其作用机制可能与抑制Cathepsin K的表达有关.
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MITF在破骨细胞中的作用研究进展
MITF（ microphthalmia-associated transcription factor ，MITF）是小眼畸形相关转录因子，它在破骨细胞中的作用成为近几年骨科领域的研究热点。不断有研究证实，MITF调节破骨细胞中众多功能相关基因的转录，包括抗酒石酸酸性磷酸酶（ tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP），组织蛋白酶K（Cathepsin K），破骨细胞相关受体（osteoclast-associated receptor，OSCAR），氯离子通道-7（chloride channel-7，Clcn7），骨硬化相关跨膜蛋白-1（osteopetrosis-associated transmembrane protein 1，Ostm1）和E-钙粘蛋白（E-cadherin）等。无论在MITFmi/mi突变的小鼠模型还是来源于MITFmi/mi突变的小鼠体外培养的破骨样细胞中，我们都能检测到上述与破骨细胞众多功能相关基因的表达都会受到明显抑制，导致破骨细胞功能异常，小鼠患有严重的骨硬化病。因为小鼠和人类的MITF基因序列具有很高的同源性，所以理解MITF调控系统对小鼠破骨细胞的作用也将有助于我们阐明妇女绝经后的骨质疏松症、骨硬化病或者发生在多发性骨髓瘤患者身上的溶骨性骨质破坏和高钙血症等人类疾病的分子作用机制。现就MITF在破骨细胞中的作用做一综述。
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骨转换生化标志物的研究新进展
骨转换生化标志物是在骨骼重建过程中释放于血液、尿液中的或其他分泌物,是能够被检测出来的一些活性物质,其具有稳定性好,特异性强,敏感性高等优点.虽然骨转换生化标志物不能作为诊断骨质疏松症的金标准,但是联合骨密度,我们可以更早地了解骨转换的动态,在骨转换平衡状态的评估、骨代谢疾病的鉴别诊断、抗骨质疏松治疗疗效监测等方面有重要作用.目前,一些传统的骨转换生化标志物(BALP、OC、PINP、TRACP、DPD、CTX)已经成熟运用于临床和科研中,新发现的骨转换生化标志物(BSP、POSTN、SO、Cat K、OCIL等)在骨质疏松症和骨代谢疾病诊疗方面也有一定的应用,其灵敏性、特异性、稳定性仍需要进一步研究确认.本文从传统的骨转换生化标志物和新发现的骨转换生化标志物的研究进展及其在临床上的应用进行了简单的综述.
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骨碎补总黄酮防治绝经后骨质疏松症的实验研究
目的 探讨骨碎补总黄酮防治骨质疏松的机理,为补肾中药有效成分治疗骨质疏松症提供实验依据.方法 选取3月龄雌性SD大鼠72只,随机分为6组:给药组切除双侧卵巢给予骨碎补总黄酮灌胃,分为:高剂量组,中剂量组,低剂量组；对照组,切除双侧卵巢给予雌激素灌胃；假手术组,开腹后切除一小块卵巢周围脂肪给予常规喂饲；空白组不做处理常规喂饲.分别在第0、3、6个月处死每次每组4只.取左胫骨近端干骺端标本,运用荧光定量PCR方法测定Cathepsin K mRNA表达量,运用三点弯曲法测胫骨干大弯曲载荷,采用SPSS软件进行数据统计分析.结果 给药组与对照组胫骨干骺端Cathepsin K mRNA表达量相比,有统计学意义(P＜0.05).给药组与假手术,空白组均有显著性差异(P＜0.01)；胫骨干大弯曲载荷显示:给药组与对照组有统计学意义(P＜0.05),给药组与假手术,空白组均有显著性差异(P＜0.01).结论 骨碎补总黄酮可以降低胫骨干骺端Cathepsin K mRNA的表达量,提高胫骨干大弯曲载荷.此可能为骨碎补总黄酮治疗骨质疏松症的重要机制.
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大鼠正畸牙移动压力侧牙槽骨中cath K mRNA表达的研究
目的 研究组织蛋白酶K(cathepsin K,cath K) mRNA在大鼠正畸牙移动压力侧牙槽骨中的表达变化及时间分布特点,探讨正畸牙移动中牙周改建的分子生物学机制.方法 选用80只6周龄SD雄性大鼠建立正畸牙移动模型,分别在加力后2d、5d、7d、10d和14d处死动物各16只,HE染色观察牙周组织改建的变化,TRAP染色计数压力侧破骨细胞数量;实时定量PCR(real-time quantitative PCR)检测cath K mRNA表达变化及时间分布特点.结果 cath K mRNA表达随加力时间的增加而增加,在加力后的第7天开始下降.这与牙周组织形态学的变化以及TRAP染色阳性破骨细胞数目的变化规律相一致.结论 在生物机械力的诱导下,cath K参与了正畸牙移动骨改建过程中有机基质的降解,cath K mRNA随正畸加力时间的增加出现规律性变化.
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大鼠牙移动性根吸收组织内组织蛋白酶K及白细胞介素6 mRNA的表达
目的检测正畸牙齿移动引起根吸收组织中组织蛋白酶K(CK)及白细胞介素6(IL-6)的分子表达水平及其分布,探讨根吸收过程的分子机制.方法选用Wistar大鼠建立根吸收的动物模型,应用原位杂交技术观察CK和IL-6在根吸收组织中的定位表达,应用t检验对比二者在根吸收组织与正常牙周组织中表达的差异.结果CK mRNA表达于破牙和破骨细胞内,而IL-6m RNA主要表达于成纤维细胞、成骨细胞、骨细胞及成牙骨质细胞内.二者在牙根吸收组织中的表达均明显高于正常组织(P＜0.01).结论CK表达于根吸收组织中的破牙细胞,作为一种重要的蛋白质分解酶参与有机基质的降解;IL-6作为多功能细胞因子,在根吸收活动中起着重要的调控作用.
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墨旱莲组分中组织蛋白酶K非活性位点抑制剂研究
组织蛋白酶K (CTSK)是抗骨质疏松药物的关键靶标.CTSK活性位点抑制剂能抑制胶原蛋白降解活性,同时抑制CTSK降解其他蛋白的水解活性,存在较大的不良反应,CTSK非活性位点(exosite)抑制剂具有抑制骨胶原降解活性且不影响活性位点(active site)的生物活性.本研究通过毕赤酵母表达系统表达出重组CTSK,进一步通过N端正丁基琼脂糖凝胶柱和SP-琼脂糖凝胶柱分离,得到高纯度有活性的重组CTSK.利用所得CTSK考察筛选了中药墨旱莲不同提取物及化学成分对CTSK的胶原降解活性和对CTSK与Z-FR-MCA底物结合的抑制作用,明确了墨旱莲的正丁醇部位为理想的潜在非活性位点活性部位,从中提取的墨旱莲皂苷Ⅸ为潜在的非活性位点抑制剂.
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8-异戊烯基柑橘素抑制骨髓细胞向破骨细胞分化及骨吸收活性
研究8-异戊烯基柑橘素(8-prenylnaringenin,8-PNG)对骨髓细胞向破骨细胞分化及骨吸收活性的影响.从出生24 h内的青紫兰兔四肢骨髓中分离培养破骨细胞,加入8-PNG(1×10-7、1×10-6和1×10-5 mol·L-1),以1×10-7 mol·L-117β-雌二醇(17β-estradiol,E2)作为阳性对照.培养5天后进行TRAP染色和TRAP活性检测,7天后进行甲苯胺蓝染色和骨吸收陷窝数量与面积的分析.分别于加药后2、4、8、12、24、36及48 h进行Annexin V染色,观察破骨细胞凋亡情况；于12、24和36 h提取总RNA,用real-time RT-PCR法检测TRAP (tartrateresistant acid phosphatase)和CTSK (cathepsin K)的基因表达水平.结果显示,8-PNG(1×10-6和1×10-5 mol·L-1)组的TRAP染色阳性细胞即破骨细胞数量明显低于空白对照组(P＜0.01),但只有8-PNG (1×10-5 mol·L-1)组显著低于E2组(P＜ 0.05); TRAP活性的变化呈相同趋势;骨陷窝数和面积的计量结果亦呈相似变化趋势；E2组使破骨细胞的凋亡高峰大大提前,且凋亡数量多,其次为8-PNG(1×10-5mol·L-1)组,8-PNG(1×10-7 mol·L-1)组与空白对照组比较无差异.8-PNG(1×10-7、1×10-6和1×10-5 mol·L-1)可显著抑制TRAP和CTSK的基因表达,且呈剂量依赖性.结果表明,8-PNG能抑制骨髓细胞向破骨细胞分化,并能抑制破骨细胞的骨吸收活性,其机制与诱导破骨细胞凋亡和抑制骨吸收关键酶的基因表达与活性有关.
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姜黄素对博来霉素诱导肺纤维化C57BL/6小鼠cathepsin K表达的影响
目的 探讨姜黄素抗C57BL/6小鼠肺纤维化与组织蛋白酶K(cathepsin K)表达的相关性.方法 博来霉素气管注射造小鼠肺纤维化模型,随机分组:对照组(气管内注入0.1 mL生理盐水),模型组(气管内注入0.025 U博来霉素),姜黄素组(气管内注入0.025 U博来霉素)；造模第2天,对照组和模型组给予0.5％羧甲基纤维素钠生理盐水灌胃,姜黄素组给予200 ng/( kg· d)姜黄素(0.5％羧甲基纤维素钠助溶)灌胃,分别于造模后7、14、28 d取材.采用HE及Mallory染色观察肺组织病理学变化；应用免疫组化检测cathepsin K蛋白的表达,经图像分析各组之间的差异.结果 HE及Mallory染色结果显示姜黄素组、模型组与对照组比较都有不同程度的炎症及纤维化病灶,姜黄素组与模型组比较炎症及纤维化程度减轻；姜黄素组、模型组与对照组比较cathepsin K 表达都有不同程度增加；姜黄素组与模型组比较cathepsin K蛋白表达显著增加,其中14 d,P＜0.01;7 d和28 d,P＜0.05.结论 姜黄素可能是通过增加cathepsin K的表达从而降解胶原而实现抗纤维化作用.
