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上海市松江地区急性上呼吸道感染患儿呼吸道病毒感染研究
目的 初步探明上海松江地区儿童流感样病例(ILI)的病毒病原谱,分析其流行特征,为儿童呼吸道感染预防和控制提供科学依据.方法 采集上海松江区某中心医院2014年1月-2015年12月就诊于儿科发热门诊0～14岁患儿的鼻咽拭子2 121份,使用Seegene公司生产的呼吸道病毒检测试剂盒,采用巢式实时荧光PCR方法检测甲型流感病毒(Flu A)、乙型流感病毒(Flu B)、肠道病毒(HEV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、腺病毒(ADV)、博卡病毒(HBoV)、冠状病毒(HcoV)和偏肺病毒(hMPV).结果 2 121份急性呼吸道感染患儿鼻咽拭子中呼吸道病毒阳性率为82.04％(1 740/2 121),病毒构成比从高到低依次为肠道病毒(HEV)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)以及各型季节性流感病毒(Flu).季节性流感呈冬春季和夏季高发;除季节性流感外的其他呼吸道病毒呈夏季和秋季高发,7个月～6岁年龄段为主要易感人群,双重或三重感染多见.结论 肠道病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、季节性流感病毒是松江地区儿童急性呼吸道感染的主要病毒病原,季节性流感和其他呼吸道病毒呈“互补”流行态势.季节性流感优势毒株为pdm2009 H1N1、A(H3N2)、B型、A(H3N2)、pdm2009 H1N1交替流行.
关键词： 急性上呼吸道感染 流感样病例(ILI) 多重PCR 病毒 病原谱 -
登革病毒悬液芯片分型检测方法的建立
目的 建立一种基于悬液芯片的登革病毒(dengue virus,DV)检测方法,可对四种血清型登革病毒进行快速检测和鉴定.方法 依据GenBank上4种病毒的基因序列信息,设计并合成相关引物及探针序列.抽提病毒RNA,经反转录后对目的基因进行PCR扩增,产物与核酸探针微球组杂交后于Bio-PlexTM 200系统检测荧光信号值.结果 DV1的悬液芯片检测敏感性约9 DNA拷贝,DV2、DV3、DV4的悬液芯片检测敏感性约90 DNA拷贝.进而将本方法用于检测15份临床标本,其检测结果与分型荧光RT-PCR一致.结论 建立了可同时检测四种血清型登革病毒的悬液芯片检测方法,为快速筛查和鉴定登革病毒提供了新的手段.
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来自腹泻合并急性肾衰病人疫区的99株E.coliO157:H7的鉴定结果分析
目的调查研究河南省2000年3月17日-7月6日发生的腹泻合并急性肾衰病人的致病菌.方法采集病人、外环境、家畜和家禽标本620份,采用免疫磁珠集菌法、CHROMAGAR-O157:H7显色培养基分离及营养肉汤增菌、rfbO157、rfbO111引物多重PCR扩增等方法进行病原菌的检测.结果分离出99份E.coli O157:H7菌株,其中rfbO157、志贺氏样毒素2(stx2)、溶血素(hlyA)、肠上皮细胞纤毛消除素(eaeA)基因和vero细胞毒性试验均阳性的有56株,其它基因组合7株,36株无毒力基因.结论99株E.coli O157:H7在CHROMAGAR-O157:H7显色培养基生长形态、颜色,生化反应及毒力基因表现等方面出现多样化,对于今后在制定对该菌的诊断标准、传染源的控制及细菌毒力学等方面的研究提供了依据.
关键词： E.coli O157:H7 免疫磁珠 多重PCR 毒力基因 -
多重PCR方法鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌
目的 建立一种快速检测和鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法.方法 根据六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的毒力基因eae、stx1、stx2、elt、estIa、estIb、aggR、ipaH、afaD及16S rRNA基因rrs建立多重PCR反应体系,优化引物浓度、PCR反应条件等,评价该方法的特异性和灵敏度,并用该方法鉴定本实验室保存的174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌,将结果与单重PCR、本实验室已建立的鉴定五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法结果进行对比.结果 10对PCR引物均可特异性扩增相应基因片段.该反应体系对174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌的鉴定结果与单重PCR检测结果一致,本研究的多重PCR检测下限可达4.56×101CFU/反应(1.14×104CFU/ml).结论 本研究采用毒力基因及内参照基因建立的多重PCR方法可在一个反应体系中鉴定和区分致泻性大肠埃希菌和志贺菌,为临床快速检测、疾病预防控制实验室筛查、腹泻的暴发溯源等提供了方便快捷的技术支持.
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一起副溶血性弧菌引起食物中毒实验室溯源检测
目的 分析一起食物中毒中分离的副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)的血清群分布、毒力基因携带情况及分子分型特征,为溯源提供依据.方法 血清凝集试验检测菌株血清型别,多重PCR方法检测Vp三种毒力基因tdh(耐热直接溶血素),trh(相对耐热直接溶血素)与tlh(不耐热溶血素)的携带情况.肠道细菌重复基因间共同序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence,ERIC)PCR分型技术分析不同来源菌株基因型特征.结果 24株分离株中主要血清群为O3:K6(33.3％),均携带tlh 基因、均不携带trh基因.66.7％ (16/24)的菌株携带tdh基因,O3:K6血清群菌株均携带tdh基因.ERIC PCR分型分为3个克隆群:E1群包括4株O1,2株O2,O4、O5各1株,E2群包括3株O1,2株O5,O2、O4、O10各1株；E3群包括8株O3.结论 该起食物中毒是由多种型别Vp引起.主要血清群为O3:K6,在食品与患者中都分离出该血清群的菌株,经ERIC分型,这些菌株来自同一个克隆群.除O3血清群外,从食品、加工存放食品的器具及患者中分离出其他不同血清群Vp,经ERIC分型,不同血清群分为2大克隆群,提示此次食物中毒的传染源可能与食品、加工存放食品器具污染Vp相关.
关键词： 副溶血性弧菌 多重PCR 毒力基因 重复基因间共同序列PCR分型技术 -
基于多重PCR的副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因检测方法的建立与评价
目的 基于多重聚合酶链反应(PCR)建立一种快速方便的检测副溶血弧菌“大流行菌群”及其毒力基因的方法.方法 结合副溶血弧菌“大流行菌群”的群特异鉴定方法GS-PCR,与副溶血弧菌致病相关的耐热直接溶血素基因(tdh)和耐热直接溶血素相关溶血素基因(trh)序列设计引物,建立并优化多重PCR检测方法.用已知的大流行菌株和非大流行临床分离株,对其进行特异性、灵敏度等性能的评价.并对224株食品分离株和3株临床分离株副溶血弧菌进行了再鉴定.结果 副溶血弧菌“大流行菌群”有群特异PCR标识基因和tdh扩增条带.而其他细菌扩增结果呈阴性.检测灵敏度可达到105 CFU/ml.对实验室保存的224株食品分离株和3株临床分离株进行再鉴定表明,其中5株为副溶血弧菌“大流行菌群”,其中3株为tdh阳性、trh阴性,2株tdh、trh均阴性.结论 本研究所建立的多重PCR方法特异性好、灵敏度高.为副溶血弧菌“大流行菌群”及其毒力基因的快速大规模检测提供良好的技术支持.
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弥散黏附性大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立及其在感染性腹泻患者中的流行情况
目的 建立一种快速检测弥散黏附性大肠埃希菌(DAEC)的普通多重PCR方法,了解DAEC在腹泻患者中的流行情况.方法 根据DAEC黏附基因afaB、afaC、afaD、daaE及16S rRNA基因rrs,建立4重PCR反应体系,对PCR引物、反应体系和反应条件进行优化,评价敏感性和特异性,并应用于389份腹泻患者粪便标本的筛查.结果 4重PCR反应可以特异性扩增DAEC菌株afaB/C、afaD、daaE基因片段,除2株肠集聚性大肠埃希菌(EAEC)外,检测引物对其他致泻性大肠埃希菌及常见肠道病原菌均无特异性扩增,此多重PCR方法的检测下限可达3.20×101CFU/反应(8.01×103CFU/ml).利用本研究建立的多重PCR方法对腹泻患者粪便标本进行检测,发现DAEC菌株分离率为6.2％(24/389).结论 本研究建立的多重PCR方法可用于DAEC菌株的快速鉴别,也可用于人粪便标本DAEC的初步筛查.
关键词： 致泻性大肠埃希菌 弥散黏附性大肠埃希菌 多重PCR 黏附基因 -
多重PCR与传统方法检测空肠弯曲菌的比较研究
目的 应用多重PCR法和传统检测方法对禽类样品进行空肠弯曲菌的检测,比较两种方法在检测结果准确性、效率、实用性上的差异与优缺点.方法 分别采用基于空肠弯曲菌hipO、mapA、23S基因多重PCR法和传统检测方法(GB/T 4789.9-2003)对来自南京市5个大型农贸市场的290份禽类样品进行同步检测,并对两种方法的检出率、灵敏度、检测周期进行比较.结果 传统检测方法的检出率为16.6%,灵敏度为45CFU;多重聚合酶链反应(PCR)的检出率为37.9%,灵敏度为15cfu.结论 多重PCR方法在检出率、灵敏度与检测周期等指标上均优于传统空肠弯曲菌的监测方法.
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三种食源性致病菌多重PCR检测技术建立及应用研究
目的 建立多重PCR方法同时检测水产品中沙门菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特菌.方法 分别以沙门菌invA基因、副溶血性弧菌toxR基因和单核细胞增生性李斯特菌iap基因为靶基因,建立并优化了同时检测水产品中这3种致病菌的多重PCR体系,扩增产物分别为495bp(invA)、368 bp(toxR)和660 bp(iap).结果 建立的多重PCR方法可以简便、快速、灵敏地实现水产品中沙门菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特菌的同时检测,人工污染水产品检测限为10cfu/ml.结论 为无公害水产品食源性致病菌的快速检测提供了理想手段,有良好的应用前景.
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食源性金黄色葡萄球菌溶血素基因的多重PCR检测和聚类分析
目的 建立多重PCR方法检测金黄色葡萄球菌α-溶血素、β-溶血素、h-溶血素基因以及16S rDNA,了解食源性金黄色葡萄球菌中3种溶血素基因的分布情况和溶血表型,并对菌株进行聚类分析.方法 建立多重PCR方法检测148株食源性金黄色葡萄球菌的hla、hlb和hemolysin基因,并研究其分布情况,同时用血平板法检验其溶血表型,对数据进行汇总分析.结果 148株菌中131株检出hla基因(88.51％),90株菌检出hlb基因(60.81％),28株菌检出hemolysin基因(18.92％)；表型溶血的有131株(88.51％),不溶血的有17株(11.49％)；以溶血素基因型和溶血表型为聚类因素,将148株菌以100％相似度为界分为A～L共12个型,其中以A型为主,有58株(39.19％),B型37株(25.00％),C型18株(12.16％).结论 该四重PCR方法特异性高,快速简便,能满足高通量菌株筛选的要求；食源性金黄色葡萄球菌普遍携带hla基因,聚类分析以A型和B型为主.
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2009-2010年上海市儿童呼吸道病毒病原谱的建立和分析
目的 应用多重PCR检测方法对上海市儿童呼吸道病毒感染进行检测,获得疾病谱分析其流行规律.方法 2009年1月到2010年3月上海市儿童医院因呼吸道感染住院病人下呼吸道标本519份,利用多重PCR技术进行12种常见呼吸道病毒的检测.结果 在591例标本中病毒阳性率是58％ (301/519).其中呼吸道感染患儿中呼吸道合胞病毒B(RSVB)占首位,为37.5％( 113/301),其次是鼻病毒(HRVA/B),为17.3％ (52/301),比例低的是副流感病毒2(PIV2),比例仅为0.7％ (2/301).人偏肺病毒(HMPV)的比例为6％ (18/113).结论 RSVB HRVA/B和PIV3以及Adv是上海市儿童呼吸道疾病感染的主要病原,混合感染以HRVA/B联合其他病毒为主.
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四种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立
目的 建立一种多重PCR检测方法同时检测食品中沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌.方法 参考沙门菌侵袭蛋白A(invA)基因序列,志贺菌侵袭性质粒抗原(ipaH)基因序列,金黄色葡萄球菌引物设计参考耐热核酸酶(nuc)基因序列,单增李斯特菌引物设计参考溶血素蛋白(hly)基因序列设计引物,通过多重PCR对4种食源性致病菌的目的基因进行扩增,并对反应体系进行优化.结果 对15株目标菌和17株非目标菌的检测未出现假阳性和假阴性结果,产物分子量与预期一致;4种菌的检测灵敏度分别至少达到10pg/μ1;对产物的测序分析表明所得序列与目的基因序列吻合;对319份样品的检测结果显示,其中4份生鲜乳中检出金黄色葡萄球菌,1份生猪肉中检出沙门菌.结论 该方法具有良好的检测特异性,可供食源性致病菌的快速检测.
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沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157∶H7的多重PCR快速检测体系的初步探讨
目的建立能在12小时内同时快速检测沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157∶H7的多重PCR体系.方法碱性蛋白胨水(BPW)非选择性增菌6h;100℃10min制备DNA模板;根据大肠杆菌O157∶H7的uidA基因、志贺菌的ipaH基因及沙门菌的invA基因序列设计各菌引物,进行PCR扩增及电泳检测.同时优化反应体系,测定体系灵敏度和特异性.结果该多重PCR体系能在12h内同时检测3种目的菌;灵敏度为10～30cfu/ml;通过对23株目的菌和15株非目的菌检测,提示该体系特异性高.结论初步探讨出能在12h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157∶H7的多重PCR体系.
关键词： 多重PCR 沙门菌 志贺菌 大肠杆菌O157∶H7 -
阪崎肠杆菌和沙门菌多重PCR检测方法的建立
目的 建立阪崎肠杆菌和沙门菌的多重PCR检测方法.方法 针对阪崎肠杆菌外膜蛋白A(ompA)基因和沙门菌属侵袭性抗原保守基因(invA)基因设计引物,建立其多重PCR检测方法,并对反应条件进行优化.结果 两对引物分别能扩增出469bp和284bp的目的 条带,结果具有高度特异性,反应条件优化后,两菌可同时检出的浓度限度为106cfu/ml.结论 该方法敏感、特异,为快速检测阪崎肠杆菌、沙门菌提供了新的有效手段.
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多重PCR快速检测食品中肠出血性大肠杆菌
本研究建立了一种快速检测食品中肠出血性大肠杆菌(EHEC)的多重PCR方法.将样品增菌后,采用快速裂解吸附法制备模板,用多重PCR同时检测EHEC的三种毒力基因eaeA、hlyAB、slt1/2,相应扩增片段依次为1109、302、228bp.检测了60株大肠杆菌和其它菌种.结果12株大肠杆菌O157∶H7、1株大肠杆菌O26∶H11和1株大肠杆菌O111∶H8同时检出上述三种基因,2株EAEC检出了eaeA基因,1株VTEC检出了slt1/2基因,其余43株大肠杆菌和非大肠杆菌未检出上述基因.检测食品中EHEC时,从样品增菌培养到整个检测过程结束不超过8小时,方法的检出限≤1.6 cfu/g(ml).检测的126份食品样品中,3份检出了EHEC(包括牛肉、猪肉和生菜各1份).实验结果表明该法是一种特异性强、敏感性高、省时、省力的EHEC检测方法.
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40株肠球菌应用两种仪器鉴定结果的比较研究
目的 比较VITEK-32与VITEK 2 compact两种仪器对肠球菌鉴定的准确性.方法 分别应用VITEK-32与VITEK 2 compact 对40株临床标本分离的肠球菌同时鉴定,用多重PCR技术对鉴定结果有差异的菌株进行种的检测并对产物测序.结果 40株肠球菌中,32株用两种仪器鉴定结果完全相同,86株鉴定结果不一致.8株菌的PCR产物测序结果与GenBank中的屎肠球菌比较有97%～98%同源性,与VITEK2 compact鉴定结果完全相同.结论 VITEK 2 compact鉴定屎肠球菌的准确性优于VITEK-32.
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8种重大烈性传染病病毒液相芯片检测方法的建立
目的 建立基于多重PCR技术结合液相芯片技术同时检测汉坦病毒(HTV)、裂谷热病毒(RVFV)、黄热病毒(YFV)、西尼罗病毒(WNV)、克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)、拉沙热[下同]病毒(LFV)、埃博拉病毒(EBV)和马尔堡病毒(MBV)的方法.方法 建立8种病毒同时扩增的多重PCR反应体系,分别用各种病毒特异的核酸探针偶联不同编码的微球,将获得的PCR产物与偶联核酸探针的微球混合物进行杂交,建立液相芯片检测方法,并对建立的液相芯片检测方法进行灵敏度及特异性检测评价.结果 建立的8种重大烈性传染病病毒的液相芯片筛查方法具有较高的特异性和敏感性,能对8种病毒进行特异的检测.灵敏性实验结果表明,RVFV为10ng/PCR、WNV为1 ng/PCR、EBV为10ng/PCR、CCHFV为10 pg/PCR、MBV为1 ng/PCR、HTV为100 pg/PCR、LFV为1ng/PCR、YFV为10 pg/PCR.结论 本研究建立的病毒液相芯片筛查方法能快速、敏感、特异地同时检测8种重大烈性传染病病毒,对口岸入境人员是否携带重大烈性传染病病毒的快速筛查具有广阔的应用前景.
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两种出血热病毒新型液相芯片检测体系的建立
目的 建立两种出血热生物恐怖病毒(马尔堡病毒、埃博拉病毒)的新型液相芯片检测方法.方法针对马尔堡病毒、扎伊尔埃博拉病毒的特异性基因序列设计2对引物和相应的TSPE引物.经多重PCR扩增之后、加入连有TAG的TSPE引物特异性识别靶目标,标记有生物素的dCTP加入到延伸序列中,TAG与微球上的anti-TAG互补,SAPE与生物素反应,SAPE发射荧光信号,信号由液相芯片仪器检测.结果液相芯片检测体系能够正确的鉴定和检测两种出血热病毒,特异性强、灵敏度高,可用于病毒的高通量筛查.结论建立了多重PCR基因液相芯片快速检测两种出血热病毒的新方法.
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基于新型悬浮芯片的13种/型经呼吸道感染病毒高通量检测方法
目的 基于目标特异性引物延伸(TSPE)技术的新型基因悬浮芯片,建立高通量、快速、准确、可同时检测多种呼吸道病原的方法.方法 针对流感病毒A、B型,副流感病毒1、3型,冠状病毒SARS-CoV、CoV-NL63、呼吸道合胞病毒A、B型,腺病毒B、E型,鼻病毒、人偏肺病毒、肠道病毒共13种/型经呼吸道感染病毒的特异性基因序列,设计13对引物和相应的特异性探针,经多重PCR扩增及TSPE反应,生物素标记对应基因片段,标记的片段与相应微球结合,悬浮芯片扫描仪检测.结果 悬浮芯片检测体系能正确检测13种/型经呼吸道传播的病毒及其亚型,各探针间无交叉反应,特异性好、灵敏度高.结论 建立了高通量、快速、准确的可同时检测多种呼吸道病原的技术平台,为突发呼吸道传染病的鉴定和检测提供技术储备,有利于及时应对传染病疫情.
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多重-巢式PCR检测食品中单增李斯特菌研究
[目的] 建立多重-巢式PCR联合检测体系快速检测食品中的单增李斯特菌.[方法] 针对单增李斯特菌中多个稳定的特异性基因(hlyA、plcB、prfA、iap),设计并筛选出6对引物用于多重PCR、2对引物用于巢式PCR,组成多重-巢式PCR联合检测单增李斯特菌,并对珠海地区6类冷冻冷藏食品中单增李斯特菌的带菌情况进行了初步调查.[结果] 建立的多重-巢式PCR联合检测体系特异性良好,多重PCR的灵敏度达到1×102cfu/ml,巢式PCR的灵敏度达到1×101cfu/ml.在检测的3439份样品中,单增李斯特菌阳性率达22.39%.[结论] 该检测体系具有快速可靠、灵敏准确及特异性好的特点,有效缩短了检验周期,从传统的14d缩短到2d.对珠海地区6类冷冻冷藏食品中单增李斯特菌的带菌情况有了一定了解.
