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2017年珠海市暴发流行麻疹病毒遗传进化研究
目的 分析2017年广东省珠海市麻疹暴发流行期间麻疹病毒基因组序列和可能的传播来源. 方法 分段扩增2017年珠海市的第1株和后1株麻疹病毒毒株全基因组并测序,通过末端重叠序列拼接组成病毒全基因组序列并上传至GenBank.参考已公布的麻疹病毒全基因组序列,对病毒进行进化分析.结合流行病学调查,推测病毒的可能来源及传播途径.通过核苷酸序列推导病毒氨基酸序列,比对疫苗株Shanghai191,分析病毒氨基酸变异的意义. 结果 拼接后的麻疹病毒MVs/Zhuhai.CHN/10.17/2[H1](GenBank序列号:MG972194)基因组全长15894个核苷酸,编码6个结构蛋白和2个非结构蛋白.序列进化分析表明,病毒属麻疹病毒H1型.遗传距离上,与2007年分离自浙江的KJ755987.1的核苷酸同源性高,达99%(15783/15894).病毒N、P、V、C、M、F、H、L蛋白氨基酸序列与疫苗株Shanghai191的一致性分别为96.6%(507/525)、98.2%(498/507)、97.7%(292/299)、96.8%(180/186)、99.1%(332/335)、96.6%(534/553)、98.5%(08/617)和99.3%(2168/2183).结论 2017年珠海市麻疹病毒可能由浙江省的感染者传播并导致珠海本地暴发流行.病毒N、P、L和V蛋白的氨基酸变异可能使其在复制和转录功能、致病力、诱导宿主T细胞免疫功能及细胞体液免疫平衡方面与疫苗株Shanghai191出现差异.
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2007和2008年10-12月腹泻患儿诺如病毒分子的检测
目的:分析2007年和2008年10～12月昆明地区部分婴幼儿腹泻散发病例中诺如病毒(Norovirus,NoV)感染情况.方法:收集2007年10～12月及2008年10～12月在昆明医学院第一附属医院儿科住院的腹泻患儿的粪便标本96份,其中2007年有46份,2008年有50份.应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增标本中诺如病毒核酸,并随机挑选2007年和2008年各一份RT-PCR阳性标本的PCR产物进行克隆测序,测序结果应用DNAassist、Clustal-w和MEGA 4.0软件进行序列分析.结果:96份标本共12份检出NoV阳性,阳性检出率为12.5%,其中2007年有7份NoV阳性,阳性检出率为15.2%,2008年有5份NoV阳性,阳性检出率为10.0%.用DNAassist、Clustal-w和MEGA 4.0软件进行序列分析.该两株病毒的组内核苷酸同源性为97.3%,与GenBank上GⅠ组:Norwalk68,SouthamptonVirus,BS5,WUG1,Chiba Virus的同源相似性在82.5-95.7%之间,而与GⅡ组Farmington Hills,B4S5,MD145 Maryand virus,Lordsdale Virus,Mc37,Saitama U1,Hawaii,Snow MountainVirus,SaitamaU4的全基因组序列进行比较,同源性在51.9-62.5%之间.结论:2007年和2008年10～12月昆明地区部分婴幼儿腹泻散发病例中均存在诺如病毒的感染,且所检测的两份标本为同一型,同属于GⅠ型.
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海洋放线菌乙酰CoA连接酶的克隆
克隆稀有海洋放线乙酰CoA连接酶合成基因的基因片段.根据Salinispora arenicola CNS-205的核苷酸序列保守区设计两对乙酰CoA连接酶特异性引物,以其总DNA为模板,采用PCR的方法扩增得到了包含乙酰CoA连接酶的完整的基因片段,并将该片段成功插入到克隆载体pUC-18中.将重组质粒进行酶切验证并在检测机构中验证测序结果正确,成功地获得了稀有海洋放线菌Salinispora arenicola的乙酰CoA连接酶合成基因的基因片段,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.
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ENAH单核苷酸多态性检测及其与胃癌发生发展的关系
为了研究胃癌发生发展与ENAH 基因SNP之间的关系,采用PCR方法分别特异扩增ENAH 基因2号外显子rs113271908(T>C)和rs75986582(G>T)在内片段,PCR产物用直接测序法来分析结果.用PCR-直接测序法检测了50例正常血样和50例胃癌癌旁正常粘膜组织样本,结果rs113271908和rsrs75986582分别只存在TT和GG一种基因型,在对照组和病例组中没有差异,因此认为它们与胃癌的易感性没有相关性.
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高通量测序技术在口岸传染病检测中的应用前景
本文对高通量测序技术及其在口岸传染病监测的应用前景进行了概述,提出国境口岸在应对突发新发传染病疫情时可以将传统的分子生物学检测技术与高通量测序技术相结合,实现对未知病原体的快速筛查和鉴别、对已知未分型病原体毒力与耐药基因等分子信息的精准分析.高通量测序技术可提高未知病原体的检测能力,提升国境口岸传染病防控水平.
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新一代高通量测序技术在卫生检验检疫的应用
众多分子诊断方法中,DNA序列测定和分析无疑是权威的金标准.传统的Sanger测序技术虽已成熟,但其速度和成本的限制满足不了大规模测序的要求.新一代高通量测序技术是对传统测序技术的革命性变革可以一次完成数十万到数百万条DNA分子的序列测定,具有分析结果准确、快速、高灵敏度和高自动化的特点.本文概述新一代测序平台技术原理、操作步骤及应用,并展望了新技术在出人境卫生检验检疫应用前景.
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用Cytb基因序列分析鉴定肉制品掺假
目的 采用Cytb基因进行肉制品真伪鉴定的尝试性探索.方法 随机采集21份肉制品样品,首先采用CTAB法方法提取样品DNA,基于Cytb基因的通用引物对21份样品DNA进行PCR扩增,把扩增产物进行测序,然后采用DNAMAN软件进行序列的比对分析.结果 CTAB方法适合肉制品的DNA提取.10份牛肉样品中9份与标注吻合,1份检测出是猪肉;2份羊肉样品中1份与标注吻合,1份检测是猪肉;2份猪肉样品中1份与标注吻合,1份检测是鸡肉;1份鸡肉样品与标注吻合;6份牦牛肉样品中2份与标注吻合,4份检测是水牛肉.结论 用Cytb基因序列分析比对方法适合肉制品的真伪鉴定,市场上内制品存在掺假问题.
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武威地区丙型肝炎基因分型情况分析
目的:了解武威地区丙型肝炎基因分型特征,为HCV感染者的个体化治疗提供科学依据.方法:实时荧光定量RT-PCR检测70例抗-HCV阳性血清标本,并对血清标本PCR扩增基因片段,测定核苷酸序列进行基因分型.结果:70例标本中HCV1b型38例,占54%;HCV2a型21例,占30%;HCV1b/2a混合型9例,占13%;HCV2b型2例,占3%.结论:武威地区HCV基因型主要为1b型,其次为2a型,同时存在1b/2a混合型和2b型,与相邻城市HCV基因型分布比较有一致和差异.
关键词： 丙型肝炎病毒 荧光定量RT-PCR 测序 基因分型 -
中国首例输入性中东呼吸综合征冠状病毒结构基因与附属基因的序列分析
针对中国首例实验室确诊输入性MERS-CoV感染病例,采用鼻咽拭子样品进行核酸提取、基因扩增与测序,获得MERS-CoV_ ChinaGD01结构蛋白与附属蛋白编码基因,包括S基因、E基因、M基因、N基因、ORF3、ORF4a、ORF4b、ORF5和ORF8b基因序列.根据S基因进化分析发现中国输入性病例中MERS-CoV虽有少数位点变异,但仍与近年沙特流行株相近,属于MERS-CoV亚型5,N、E、M等结构基因核苷酸变异较少.附属蛋白进化分析表明:ORF3、ORF4a、ORF4b、ORF5均有一定的核苷酸替换,而ORF8b相对保守.总之,中国首例输入性MERS-CoV与已发表序列相比总体表现为保守,但在部分基因序列上有一定的变异.这是中国首例输入性MERS-CoV的第一次基因分析结果报道,可为该MERS-CoV感染特点的进一步研究及相关疾病的防控提供参考.
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分子克隆化禽网状内皮组织增生症病毒传染性及其前病毒全基因组序列研究
利用脂质体转染技术,将含有SNV株禽网状内皮组织增生症病毒 (REV)前病毒全基因组cDNA克隆质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF).用对REV的单克隆抗体和抗REV env-gp90的鼠血清作间接免疫荧光反应,在原始的转染细胞及随后传代的细胞中均显示病毒特异性抗原.而且,在连续传代细胞中的阳性率明显升高.用REV特异性引物对进一步传代后的细胞基因组作PCR,也检测出REV基因组.这些结果均表明所得到的分子克隆化病毒具有传染性,因而也进一步证明所用的质粒克隆包含有具感染性的全病毒基因组.对该全基因组cDNA克隆进行酶切所获得的数个亚克隆进行测序,并将序列进行拼接,完成了REV全基因组序列.REV的这个传染性克隆将有助于进一步研究REV的分子生物学特性.
关键词： 禽网状内皮组织增生症病毒 传染性克隆 测序 -
北京、上海严重急性呼吸道感染儿童中肠道病毒D68的检出与基因特征分析
为了解肠病毒D68(EV-D68)在北京、上海地区严重急性呼吸道感染(SARI)儿童中的流行情况和分子特征.本研究采集2008～2010年北京儿童医院SARI儿童呼吸道样品259份,2013～2014年上海复旦大学附属儿科医院SARI儿童呼吸道样品441份,采用套式RT-PCR结合测序方法检测筛选EV-D68阳性样品,设计EV-D68全基因组通用引物,对EV-D68阳性样品进行全基因组扩增,收集NCBI核酸数据库中目前所有的EV-D68全基因组序列进行序列分析,比较EV-D68中国和美国流行株的差异.结果发现:北京地区检测EV-D68阳性样品1例,阳性率为0.4％,上海地区检测EV-D68阳性样品4例,阳性率为0.9％.结合目前中国已上传的所有EV-D68相关序列,分析表明:目前中国地区流行的EV-D68主要属于Clade A2或Clade B2亚型,不同于美国的Clade A1、Clade B1、Clade B4和Clade B5亚型,另外EV-D68部分基因进化分析时出现树形结构冲突现象;上述结果表明目前EV-D68在北京、上海地区的SARI儿童群体中的感染率较低(5/700;＜1％);中国与美国流行的EV-D68毒株属于不同的分支,差异较大,部分序列分析表明EV-D68病毒可能存在组内重组现象.
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鸡贫血病毒衣壳蛋白基因克隆、测序和比较
在1979年日本首次报道鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)以后,相继在各养禽业发达的国家分离到了CAV[1].我国于1992年哈尔滨兽医研究所在哈尔滨市郊分离到CAV[2],并在其它多个省份用血清学方法检测到该病毒[3].
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成人急性B淋巴细胞白血病全基因组miRNA表达谱及其染色体分布
目的 研究成人急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的miRNA表达谱及其基因在染色体上的分布特征.方法应用Illumina测序技术对15例成人B-ALL患者与10例非恶性血液病对照者骨髓样本的miRNA 表达丰度进行对比分析,确定其表达差异及其基因在染色体上的分布情况,并通过q-PCR对部分测序结果进行验证.结果 两组样本间差异表达的miRNA共291种,168种miRNA在B-ALL组呈表达上调,123种miRNA呈表达下调.两组miRNA基因在染色体上的分布趋于一致,但其表达丰度的分布却有明显的差异:B-ALL组主要分布于1、2、5和9号染色体,而对照组则主要分布于3、7、9、17和X号染色体.结论 多种在成人B-ALL骨髓样本中呈异常表达的miRNA,可能在B-ALL发生发展过程中起一定的调控作用
关键词： 急性B淋巴细胞白血病 微小RNA 测序 表达谱 -
Rh血型弱D和DEL表型的基因突变分析
目的 研究Rh血型弱D和DEL表型的基因突变基础.方法 用间接抗人球蛋白方法(IAT)和吸收放散的血清学方法鉴定弱D表型和DEL表型,然后用RHD基因特异的聚合酶链反应-序列特异性(PCR-SSP)和序列分析方法鉴定Rh血型弱D和DEL表型RHD基因的外显子中可能存在的变异.结果 Rh血型弱D表型个体的第6外显子有845G＞A突变,Rh DEL表型个体的第9外显子有1227G＞A突变.结论 所应用的RHD基因测序方法可以用于弱D和DEL表型分子基础的研究,并为发现新的D变异表型和新的RHD等位基因奠定基础.
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EGF对hAMSCs基因表达谱影响及生物信息学分析
目的 探讨表皮生长因子(EGF)对人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)基因表达谱影响及分子机制.方法 采用基因表达谱测序(Illumina RNA-Seq)技术和生物信息学分析方法,对100 ng/mL EGF干预前后的hAMSCs基因表达测序比对,确定hAMSCs基因表达谱,RT-PCR检测进行验证.结果 筛选出差异表达基因104个(FDR≤0.001和|log2 Ratio|≥1),其中上调差异表达基因56个,下调差异表达基因48个；GO生物学过程富集分析26个生物学过程具有显著性差异(P≤0.05)；KEGG信号通路富集分析细胞因子与细胞因子相互作用信号通路具有显著性差异(Q≤0.05),RT-PCR检测验证与基因表达谱结果一致.结论 EGF干预hAMSCs引起基因表达谱的变化,显著差异表达的基因和信号通路可能在hAMSCs增殖和迁移及促进创伤修复过程中具有重要作用.
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广西仫佬族线粒体DNA高变Ⅰ区多态性分析
目的 探讨广西仫佬族人群线粒体DNA高变Ⅰ区的多态性特征,了解仫佬族群体的母系遗传结构.方法 收集91例仫佬族无关男性个体的外周血样本,目标序列用引物L15947和R16488进行PCR扩增,用ABI3730测序仪正反向测序;计算多态性位点、核苷酸多态性、平均配对差异数目等多态性指标,以及仫佬族与各民族之间的遗传距离,ME法构建遗传进化树.结果 与修正后的剑桥标准序列(rC RS)比对,91例样本的线粒体高变Ⅰ区序列共界定了74种单倍型,核苷酸多态性为0.0188±0.010,平均核苷酸差异为6.618 ±3.154;遗传距离显示仫佬族与南方各少数民族及南方汉族的亲缘关系较近,与北方汉族的亲缘关系较远,进化树中仫佬族与南方少数民族聚为一类.结论 仫佬族在母系遗传上属于典型的南方侗傣族群,可能经历过群体扩张或选择效应;高变Ⅰ区序列具有较高的多态性,可用于法医个体识别、民族起源等方面的研究.
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白纹伊蚊唾液抗血小板凝集因子Apyrase基因片段的克隆测序
抗血小板凝集因子Apyrase是吸血昆虫唾液的重要功能因子,能水解被吸血宿主血液中血小板释放的ATP、ADP而抑制血小板凝集,以利吸血过程的顺利进行.本研究针对我国的白纹伊蚊,用兼并引物PCR法扩增了抗血小板凝集因子Apyrase的基因片断,并克隆入T载体进行了测序,经Clastal比较发现与埃及伊蚊相应序列有很高的同源性,为进一步的研究打下基础 .
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牛东方泰勒虫P32主要表面蛋白基因的克隆与分析
通过PCR技术从感染吉林株东方泰勒虫的病牛血液中扩增出868 bp的表面蛋白P32基因,经测序比较分析发现与韩国株核苷酸和氨基酸的同源性分别为99%和98%.和我国延边株核苷酸和氨基酸的同源性分别为99%和98%.将所得的吉林株东方泰勒虫P32蛋白基因序列提交GenBank,基因注册号为EU047751.
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埃及伊蚊钠通道基因克隆与序列分析
电f依赖性钠离子通道是许多神经毒性药物的作用靶标.本研究采用RT-PCR技术,利用简并引物从埃及伊蚊中扩增的钠通道基因片段为4609bp,编码1 536个氨基酸,经Clustal软件分析发现与黑尾果蝇钠通道基因(para)和家蝇钠通道基因(Vsscl)有很高的相似性(80%,78%).
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巢式PCR扩增恶性疟原虫DHFR基因直接测试序列的意义
目的 巢式PCR方法扩增恶性疟原虫DHFR基因直接进行DNA序列测序.方法 在巢式PCR程序中,设置2次退火(退火45 ℃45 s;退火65 ℃ 1 min),产生足量的DNA模板,进行其序列测试.结果 共测试2组样本,dhfr基因序列全长218样本为647 bp,217样本为692 bp,其中218样本在170、193、341位点发生变异.结论 该方法省时,节约材料,可满足现场快速凋查恶性疟原虫耐药基因的要求.
