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线粒体DNA拷贝数对卵母细胞受精结局的影响
目的 研究线粒体DNA拷贝数对卵母细胞受精结局的影响,为提高卵子质量,改善体外受精结局提供新思路.方法 应用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测不同受精结局的卵母细胞线粒体DNA(mtDNA)拷贝数,并对各组结果作比较分析. 结果 A组52枚未受精卵的平均mtDNA拷贝数为(80,547±37,314) copies/μl,B组46枚发生原核阻滞的正常受精合子平均mtDNA拷贝数为(104,311±43,074) copies/μl,C组61枚单原核(1PN)或三原核(3PN)胚胎平均mtDNA拷贝数为(192,681±51,394) copies/μl.拷贝数A组显著小于B、C两组(P＜0.01),B组显著小于C组(P＜0.05).C组中碎片率＞30％的较差胚胎(C1组)和碎片率＜5％、发育速度正常的良好胚胎(C2组)两个亚组,两组的平均mtDNA拷贝数分别为(146,836±36,585)copies/μl和(297,268±102,369) copies/μl,两组比较结果有显著性差异(P=0.000). 结论 线粒体DNA拷贝数可作为衡量卵母细胞和胚胎质量的重要指标,线粒体缺乏可能是部分体外受精失败的原因.
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冷冻保存对人类精子线粒体DNA的影响
目的 探讨常规精液冷冻技术对人类精子线粒体DNA的影响. 方法 收集符合精子库捐精条件的正式志愿者精液样品,将每份样品分为2份:1份进行精液冷冻复苏处理,为实验组;1份新鲜精液,为对照组.采用Markler计数板联合CASA法评估冷冻复苏前后精子活力;两组精液均采用实时荧光定量PCR和长链PCR技术,分别检测精子线粒体DNA的拷贝数和完整性. 结果 共收集22份精液标本,纳入志愿者年龄为(27.8±3.0)岁,禁欲天数(6.1±0.9)d;精液体积(5.0士1.5)ml,精子浓度(75.8±15.8)×106/ml,前向运动精子百分比为(68±6)％,总活动精子复苏率为(72±8)％.冷冻保存后,精子活力显著降低:前向运动精子百分比减少[(49.0±6.5)％ vs.(68.0±6.1)％,P＜0.05),平均路径速率(VAP)[(35.8±6.8)vs.(46.8±9.5),P＜0.05]、直线速率(VSL)[(27.3±3.3)vs.(35.1±8.3),P＜0.05]和曲线速率(VCL)[(57.6士6.9)vs.(91.8士10.2),P＜0.05]较前下降.与新鲜精液相比,冷冻复苏后精子的线粒体DNA拷贝数显著增加[(10.12士8.41)vs.(5.66士5.53),P＜0.05],完整性比较无统计学差异[(29.69±15.04)vs.(32.78±16.0),P=0.077].结论 在正式捐精志愿者人群内,常规精液冷冻技术降低精子活力,增加人类精子mtDNA的拷贝数,但未显著改变mtDNA的完整性.
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锰对不同月龄大鼠脑黑质纹状体线粒体DNA"4834"缺失的影响
线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)约16 kb,占细胞总DNA的0.1%～0.5%,负责编码线粒体氧化磷酸化中4种复合酶的13个亚基.人的mtDNA长度约为16 569 bp[1],大鼠的mtDNA约为16 300 bp[2].mtDNA4977缺失在mtDNA的突变中为常见,又叫"常见缺失(common deletion,CD)",是一段在mtDNA 13 447～13 459和8 470～8 482[3]核苷酸位点的顺式重复序列.与人类常见的mtDNA4977缺失相对应,大鼠比较常见的mtDNA缺失是mtDNA4834缺失;它的缺失也严重影响了线粒体呼吸链酶复合体的功能.本实验应用PCR方法对不同月龄大鼠mtDNA4834缺失进行比较研究,同时观察锰的影响.
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线粒体DNA突变与大鼠乙醇性肝纤维化的关系
目的 对线粒体DNA ATP酶6,8基因(mtDNA ATPase 6,8gene)突变与乙醇性肝损伤发生发展之间的关系进行研究,从一个新的角度对乙醇性肝病(ALD)的发病机制进行探讨.方法 应用乙醇加橄榄油灌胃的方式建立大鼠乙醇性肝损伤动物模型并设对照组(等量生理盐水),成模后进行肝脏组织学观察,PCR扩增各组线粒体DNA ATPase 6,8基因并进行序列测定.以生物发光法分别测定各组肝组织中ATP含量,判定ATPase 6,8基因突变对肝细胞内ATP能量合成的影响.结果 模型组大鼠肝细胞线粒体出现形态学的改变;线粒体DNA ATPase 6亚基基因发现两处点突变;对照组未检出突变.模型组大鼠肝细胞内ATP含量明显降低(P＜0.05).结论 持续过量的乙醇摄人可造成肝细胞线粒体形态和mtDNA ATPase基因突变,这可能是乙醇性肝损伤的重要发病机制.
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hOGGl基因在Cr(Ⅵ)诱导线粒体DNA氧化损伤中的作用
目的 探讨hOGG1基因在Cr(Ⅵ)诱导线粒体DNA氧化损伤中的修复作用.方法 取不同浓度的Cr(Ⅵ)(0、2、8和32μmol/L)处理L-02肝细胞24h,分别测定细胞内活性氧簇(ROS)与hOGG1 mRNA表达水平和线粒体内8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)与hOGG1基因表达的人类8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶蛋白(hOGG1蛋白)水平.结果 8μmol/L和32μmol/L剂量组与对照组比较,细胞内ROS平均水平及线粒体内8-OhdG平均水平均明显增加(P＜0.05),而hOGGl基因mRNA水平和线粒体内hOGG1蛋白水平,与对照组比较,2μmol/L剂量组两者水平均上升(P＜0.05),32 μmol/L剂量组两者水平均降低(P＜0.05).结论 Cr(Ⅵ)可诱导细胞内ROS水平增加,引起线粒体DNA氧化损伤,而hOGGl基因表达水平的改变,影响了线粒体DNA的修复能力.hOGGl基因在Cr(Ⅵ)诱导线粒体DNA氧化损伤中起到了重要的作用.
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与Leber遗传性视神经病相关的突变位点测定
目的:了解Leber遗传性视神经病变的遗传机制.方法:采集1个只有先证者和1个舅舅发病的家系人员的血液,分离外周血单个核细胞,抽提线粒体基因组,PCR检测线粒体基因组常见突变位点.对线粒体进行全基因组测序.结果:PCR突变位点检测发现先证者、发病的舅舅、外婆、母亲以及弟弟存在G3460A.线粒体基因组测序发现先证者和发病的舅舅存在G3460A和G9804A,G9804A还存在于另一正常的舅舅,并发现了39个共同的非热点突变.结论:G3460A合并G9804A位点突变与Leber遗传性视神经病变相关.
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三七总皂苷抗衰老的实验研究
目的:从肝细胞线粒体DNA(mtDNA)、细胞因子的角度,探讨三七总皂苷(PNS)延缓衰老的可行性和可能的作用机制.方法:将实验大鼠随机分为青年对照组、衰老模型组、三七总皂苷组,每组12只.三七总皂苷组予三七总皂苷混悬液,余两组均喂普通饲料.检测实验肝细胞mtDNA的相对含量、血清SOD活性、MDA含量、血清白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)含量.结果:三七总皂苷能够降低衰老状态下大鼠肝细胞mtDNA相对含量及血清MDA含量,提高血清SOD活性,与衰老模型组比较,有显著性差异(P＜0.05);同时还能够增加衰老状态下大鼠血清IL-2含量,降低IL-6含量,与衰老模型组比较,有显著性差异(P＜0.05).结论:三七总皂苷具有减轻D-半乳糖诱导亚急性衰老大鼠模型的氧化损伤,保护肝细胞mtDNA,提高机体的免疫功能作用.
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电针对暂时性脑缺血大鼠线粒体功能损伤的保护作用
目的:对电针抗氧化应激参与缺血再灌注脑功能损伤的保护机制作进一步探讨.方法:采用大脑中动脉栓塞法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)建立大鼠脑缺血再灌注模型.Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠分成4组:模型组(MCAO)、模型+电针组(MCAO+EA)、假手术组(Sham)和假手术+电针组(Sham+EA).电针穴位取"水沟"和"百会".以比色法测定线粒体细胞色素C氧化酶的活性,以凝胶电泳法检测线粒体DNA的损伤.结果:MCAO组线粒体细胞色素C氧化酶活性比Sham组显著性降低;MCAO+EA组给予电针处理后,酶活性虽然仍低于Sham组,但比MCAO组明显升高,而电针对Sham组没有明显的影响.凝胶电泳显示MCAO组核心区形成DNA梯形条带,半影区存在一定程度的DNA链断裂性损伤;电针可以减轻半影区DNA的损伤程度,而对核心区DNA损伤无明显改善.结论:缺血早期给予电针治疗对缺血再灌注脑损伤具有良好的保护作用,其可能通过减轻半影区线粒体DNA的氧化性损伤,调整线粒体呼吸链关键酶功能,缓解了脑细胞的氧化应激,从而保护脑梗塞区部分受损细胞的功能.
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补肾健脾养血活血方对老年小鼠肾线粒体DNA缺失突变的影响
目的:研究补肾健脾养血活血方对老年Balb/c小鼠肾线粒体DNA缺失突变的影响.方法:老年Balb/c小鼠随机分为老年空白组和老年给药组,分别给予生理盐水和补肾健脾养血活血方4个月.采用聚合酶链反应(PCR)技术和光密度扫描检测两组线粒体DNA的缺失突变情况.结果;与老年空白组比较,补肾健脾养血活血方能显著减少老年Balb/c小鼠肾mtDNA的缺失(P＜0.001).结论:补肾健脾养血活血方可以抑制老年小鼠mtDNA的缺失突变,提示补肾健脾养血活血法组方能减少mtDNA的氧化损伤,对mtDNA有保护作用,从而从分子水平提供了本方延缓衰老的可能机制.
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康欣口服液对老年小鼠肝线粒体DNA缺失的影响
目前认为线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)缺失突变随增龄积累是导致衰老的重要因素之一.哺乳动物的mtDNA是一种双链环状分子,大约由16.5kb左右的碱基对组成,包含37种基因,分别编码12s和16srRNA,22种tRNA及13种氧化磷酸化的酶复合体亚基.由于mtDNA裸露于产生高氧自由基的线粒体内膜下,损伤修复系统有限,故易受氧自由基的侵袭而被氧化损伤,从而产生缺失突变.康欣口服液是补肾健脾养血活血法延缓衰老的代表方,大量的研究表明该方具有改善衰老症状积分,抗自由基损害,免疫调节,调节脂代谢,改善内分泌水平,调节神经生理学功能等延缓衰老的作用[1,2].本研究采用聚合酶链技术,观察康欣口服液对老年小鼠肝线粒体DNA缺失的影响,以期从分子水平探讨康欣口服液延缓衰老的机理.
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基于线粒体DNA探析体质学说对冠心病发病机制的影响
线粒体DNA突变是导致心血管疾病的致病基础之一,对冠心病的发生、发展有着一定的影响.现代研究显示冠心病患者的体质具有一定的特性,但是,线粒体DNA与罹患冠心病患者体质之间的相关性研究较之为少.文章结合现代研究结果,从线粒体DNA的遗传方式、地理区域以及环境因素等不同角度探析了线粒体DNA与冠心病患者体质之间的相关性,结果显示线粒体DNA对冠心病患者的体质有着一定的影响.
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标本配穴法电针对慢性心肌缺血大鼠心肌线粒体结构及线粒体DNA相关调控因子表达的影响
目的:以线粒体DNA为切入点,观察标本配穴法电针对慢性心肌缺血模型大鼠心肌线粒体结构及线粒体相关DNA调控因子PGC-1α、NRF-1和mtTFA表达的影响,探讨其防治慢性心肌缺血的可能作用机制.方法:将Wistar雄性大鼠随机分为正常组、模型组、电针组,每组各10只.每日以异丙肾上腺素(5mL/kg)皮下注射法复制模,连续7d.电针组在每日造模前,取双“内关”、双“足三里”和“关元”穴电针处理10min,疏密波,2-100Hz,1mA,1次/d,连续21d.运用透射电镜观察心肌线粒体结构变化,采用Western blot和Real-time PCR技术检测大鼠心肌组织PGC-1α、NRF-1和mtTFA的表达水平.结果:与正常组比较,模型组线粒体结构破坏明显,大部分线粒体出现肿胀变形,甚至空泡化;而与模型组比较,电针组线粒体结构损伤程度明显减轻.模型组PGC-1α、NRF-1和mtTFA的表达水平均明显低于正常组(P＜0.01);而经过“标本配穴”电针干预后PGC-1α、NRF-1和mtTFA的表达水平明显回升,与模型组之间比较具有显著性差异(P＜0.05).结论:“标本配穴”法电针可能是通过调节线粒体DNA调控因子PGC-1α、NRF-1和mtTFA的途径防治慢性心肌缺血.
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康欣口服液对老年小鼠脑线粒体DNA缺失突变影响的实验研究
目的:研究康欣口服液对Balb/c小鼠脑线粒体DNA(mtDNA)缺失突变的影响.方法:近交系Balb/c小鼠,分为青年组(6周),中年组(6个月),老年组(14个月)各10只,提取小鼠脑组织的mtDNA,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增缺失型的mtDNA片段,以证实老年组小鼠脑组织中存在mtDNA缺失.近交系Balb/c老年小鼠分别灌胃给予生理盐水(老年空白对照组),康欣口服液(老年康欣口服液组),连续四个月后处死,提取脑组织的mtDNA,PCR技术分别扩增野生型和缺失型的mtDNA片段,运用凝胶成像仪进行光密度扫描,比较两组缺失型mtDNA/野生型mtDNA的光密度比值.结果:近交系老年Balb/c小鼠脑mtDNA中存在明显的片段缺失,而在中年组与青年组中未检测到相同片段的缺失.与老年空白对照组相比,康欣口服液能显著降低老年Balb/c小鼠mtDNA的缺失率(P<0.001).结论:mtDNA的缺失突变随年龄而积累,康欣口服液可以抑制老年小鼠脑mtDNA的缺失.
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参麦注射液对大鼠脑出血后迟发性神经细胞损伤的保护作用
目的:观察参麦注射液对大鼠脑出血后迟发性神经细胞损伤的保护作用.方法:采用Rosenberg法复制大鼠脑出血模型,观察脑出血后大鼠海马CA1区神经细胞病理形态结构、神经细胞线粒体DNA缺失、C-myc基因、PDGF-A基因表达及参麦注射液的防治作用.结果:参麦注射液减少大鼠脑出血后海马CA1区锥体细胞凋亡数目,抑制血肿周围脑组织线粒体DNA片段缺失,参麦注射液对出血早期C-myc mRNA的表达无明显影响,但可使PDGF-A mRNA表达明显下调并时限延长.结论:参麦注射液可能通过调节PDGF表达对脑出血后迟发性神经细胞损伤修复有保护作用.
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中药材鹿鞭的分子鉴定研究
目的:建立中药材鹿鞭的分子分类学鉴定试剂盒.方法:根据对不同产地梅花鹿、马鹿、白唇鹿、水鹿线粒体DNA进行PCR扩增和序列测定,并与常见伪充药材来源动物线粒体DNA同位置序列比较,找到该4个鹿种的特征片段,经过实际检验,筛选出合适片段作为鹿的种属特异性PCR引物.结果:该引物与相关试剂组成试剂盒后,可用于中药材鹿鞭与常见伪充药材牛鞭、驴鞭等的鉴别.结论:用分子分类学方法鉴别中药材鹿鞭,具有科学、稳定、准确、简便等特点,值得推广.
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鸡内金的分子鉴定研究
目的:建立一种简便、实用、准确的鸡内金药材DNA分子标记鉴定方法,从而为建立鸡内金真伪鉴别方法奠定基础.方法:从Genbank数据库下载家鸡及3种常见伪内金源动物的mtDNA细胞色素b基因序列,经同位置序列比较,遵循引物设计原则选择一个差异点较多的片段,设计PCR引物(引物1,2),并使用该引物分别扩增家鸡、3种伪内金源动物,4种非伪内金源动物的DNA.结果:所设计的引物只扩增家鸡DNA,而不扩增其他动物DNA.结论:该引物具有特异性,可用于鸡内金药材的鉴定.
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松花粉对衰老小鼠肾脏线粒体DNA缺失突变的影响
目的:研究松花粉对衰老小鼠肾脏线粒体DNA(mtDNA)缺失突变的影响.方法:取昆明种衰老小鼠随机分为松花粉处理组和老年对照组,同时随机选取1组为青年对照组.松花粉处理组每天给予750 mg·kg-1的松花粉灌胃；青年对照组与老年对照组以等体积的0.9％氯化钠注射液灌胃.连续60d后,采用聚合酶链反应(PCR)技术和光密度扫描检测3组mtDNA的缺失突变情况；测定小鼠肾脏组织中SOD活性、MDA含量.结果:老年对照组小鼠肾脏mtDNA含量及mtDNA缺失明显增多(P＜0.05)；与老年对照组比较,松花粉组能显著减少衰老小鼠肾脏mtDNA的缺失(P＜0.05).松花粉能明显增加衰老小鼠肾脏组织中SOD活性及减少衰老小鼠肾脏MDA含量(P＜0.05).结论:松花粉可以抑制衰老小鼠肾脏mtDNA的缺失突变,提示松花粉能减少mtDNA的氧化损伤,对mtDNA有保护作用,从而从分子水平提供了松花粉延缓衰老的可能机制.
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五子衍宗丸对男性老年肾虚者外周血白细胞线粒体DNA缺失及线粒体呼吸链酶复合体活力的影响
目的:研究五子衍宗丸对男性老年肾虚者外周血白细胞线粒体DNA缺失、线粒体呼吸链酶复合体活力的影响.方法:38例男性老年肾虚者采用单盲法,随机分为五子衍宗丸治疗组和安慰剂对照组,服药3个月.分别用聚合酶链反应(PCR)和酶动力学方法检测治疗前后外周血白细胞线粒体DNA缺失及线粒体呼吸链酶复合体的活力.结果:五子衍宗丸可提高男性老年肾虚者外周血白细胞线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅳ活力,减少线粒体DNA缺失(P＜0.05,P＜0.01).结论:五子衍宗丸对男性老年肾虚者白细胞线粒体DNA氧化损伤有保护作用.
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五子衍宗丸及其拆方对老年大鼠心脑线粒体DNA缺失、线粒体呼吸链酶复合体及ATP合成的影响
目的：研究五子衍宗丸及其拆方对线粒体DNA缺失、线粒体呼吸链酶复合体及三磷酸腺苷(ATP)合成的影响。方法：用聚合酶链反应(PCR)、酶动力学和生物发光技术进行检测。结果：五子衍宗丸及其拆方的枸杞子、菟丝子可减少老年大鼠脑组织线粒体DNA缺失(P＜0.01)，提高脑线粒体呼吸链复合酶Ⅰ、Ⅳ活力和ATP的合成(P＜0.05，P＜0.01)；枸杞子、菟丝子还可减少老年大鼠心线粒体DNA缺失(P＜0.05，P＜0.01)。结论：五子衍宗丸、枸杞子、菟丝子对老年大鼠线粒体DNA的氧化损伤有保护作用。
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线粒体DNA损伤与细胞凋亡
细胞核DNA(nuclear DNA,nDNA)损伤后诱导细胞凋亡的信号转导途径已经逐渐清晰,而线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)损伤与细胞凋亡之间的关系尚有待进一步明确.目前已有研究结果表明:mtDNA断裂、缺失或功能缺陷能够显著影响细胞凋亡发生率;线粒体缺失细胞(p0细胞)同其亲代细胞相比,对多种凋亡诱导因素的反应存在显著差异;ROS的产生并非mtDNA损伤诱导凋亡的必要条件,mtDNA损伤断裂本身可能启动了凋亡的级联反应.但mtDNA的损伤,在细胞凋亡的信号转导途径具体扮演何种角色,还有待深入研究.
