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与Leber遗传性视神经病相关的突变位点测定
目的:了解Leber遗传性视神经病变的遗传机制.方法:采集1个只有先证者和1个舅舅发病的家系人员的血液,分离外周血单个核细胞,抽提线粒体基因组,PCR检测线粒体基因组常见突变位点.对线粒体进行全基因组测序.结果:PCR突变位点检测发现先证者、发病的舅舅、外婆、母亲以及弟弟存在G3460A.线粒体基因组测序发现先证者和发病的舅舅存在G3460A和G9804A,G9804A还存在于另一正常的舅舅,并发现了39个共同的非热点突变.结论:G3460A合并G9804A位点突变与Leber遗传性视神经病变相关.
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六味地黄汤对佐剂性关节炎大鼠脾脏细胞表达细胞因子的影响
目的：观察六味地黄汤(LW)对佐剂性关节炎(AA )大鼠脾脏辅助T细胞(Th)的作用，并与免疫抑制剂环磷酰胺(Cy)、环孢素A(CsA)进行比较。 方法：运用定量PCR技术，检测AA大鼠脾脏T淋巴细胞因子IFN-γ， IL-2，IL-4和IL-10 的mRNA的表达水平。结果：AA大鼠脾淋巴细 胞IL-2 mRNA表达水平与对照组相比有增高趋势；IFN-γ，IL-4和IL-10 mRNA的表达水 平 则明显降低。口服LW对AA大鼠脾细胞的表达水平则具有明显提高作用，与Cy和CsA相比具有 明显不同的特点。结论：LW可能对AA大鼠脾脏表达的细胞因子水平 有调节作用，提示LW可纠正Th1/Th2亚群功能的平衡紊乱。
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HLA-Ⅰ、Ⅱ类基因与HBV感染预后相关性研究
近年来HLA等位基因与HBV相关性研究,相继有所报道[1],但因被研究人群种族、检测方法、实验设计方面的差异,研究结论也有所不同,因而HLA与乙型肝炎的相关性,目前尚无定论.我们随机选取HBV感染后不同临床类型患者,采用序列特异性引物-多聚酶链式反应(SSP-PCR)方法,进行了HLA-Ⅰ,Ⅱ类基因与HBV感染预后相关性研究,现将结果报道如下.
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不同胎龄新生儿免疫球蛋白重链基因CDR3序列特征
目的分析和比较不同胎龄新生儿免疫球蛋白重链（IgH）基因CDR3序列特征，探讨新生儿成熟度对CDR3序列多样性的影响。方法从10例胎龄25～30周的极不成熟儿、12例胎龄31～36周的不成熟儿和11例胎龄37～41周的成熟儿脐血B细胞中抽提模板DNA，使用巢式PCR技术扩增IgH基因、然后对扩增物进行克隆和CDR3序列测定。结果①在极不成熟儿、不成熟儿和成熟儿，CDR3长度分别为29.4±7.8、32.4±9.2和40.8±10.7bp，其中的N区-D基因片段-N区（NDN）长度分别为13.5±5.6、16.1±7.8和22.0±8.5bp。②极不成熟儿和不成熟儿优先使用DP73和DP75，成熟儿优先使用VH5、DP73和DP75；随着胎龄的增加，DP73和DP75的使用率下降，而VH5的使用率上升。③对于D基因片段的使用，极不成熟儿主要是DN、DQ52和DXP，不成熟儿和成熟儿主要是DXP、DLR和DN。④所有新生儿中，JH4的使用率高，其次是JH6，但随着胎龄增加，JH4和JH6的使用率下降。⑤极不成熟儿、不成熟儿和成熟儿中，分别63.3%、68.8%和92.0%的克隆有开放性阅读框，其长度为303bp，编码101个氨基酸残基。结论新生儿的早期生长发育阶段，IgH基因的VH-D-JH重排机制已处于活化状态，但其多样性有限；新生儿体液免疫系统的发育是一个渐进的过程，具有不同成熟度的新生儿CDR3重排基因既有异型性又有相似性
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血管紧张素ⅡⅠ型受体基因A1166C位点基因多态性与肝硬化的关系
目的:建立多聚酶链式反应-限制性片段长度多态分析(PCR-RFLP)法检测血管紧张素ⅡⅠ型受体基因(AT1R)A1166C位点的多态性.方法:对50例血清抗HBs阳性的健康对照者及46例HBV感染后肝硬化患者的血管紧张素ⅡⅠ型受体基因A1166C位点基因多态性的多态性进行分析.根据血管紧张素ⅡⅠ型受体基因设计引物,在A1166C位设计DdeⅠ酶切位点,根据PCR产物酶切结果判断该位点为A或C.结果:两株纯合子与AT1R序列同源性在99%以上,并在A1166C位点出现预期变异;肝炎和肝硬化两组间A1166C位点无论是基因型还是等位基因均无显著性差异(P＞0.05).结论:PCR-RFLP的方法可用于AT1R基因A1166C位点基因多态性的检测,该位点的变异尚未显示其与肝纤维化有关.
关键词： 多聚酶链式反应 限制性片段长度多态性分析 纤维化 血管紧张素Ⅱ 血管紧张素Ⅱ受体 -
转化生长因子β1启动子区C-509T位点基因多态性与肝纤维化关系
目的:建立多聚酶链式反应-限制性片段长度多态分析(PCR-RFLP)法检测转化生长因子β1(TGF-β1)启动子区C-509T位点的变异并探讨其在肝纤维化中的作用.方法:根据TGF-β1启动子区基因设计引物,在C-509T位设计Bsu36 Ⅰ酶切位点,根据PCR产物酶切结果判断该位点为C或T.观察对象为慢性乙型肝炎患者50例,乙型肝炎后肝硬化患者46例.结果:测序显示本文两株纯合子与TGF-β1启动子区序列同源性在99%以上,并在C-509T位点出现预期变异;乙型肝炎和乙型肝炎后肝硬化两组都是以CT基因型为主,但是肝硬化组CC基因型(28.3%)高于TT基因型(19.6%),而肝炎组TT基因型(22%)高于CC基因型(4%),几组之间有显著性差异(P＜0.01).结论:本文建立的方法可用于TGF-β1启动子区C-509T位点基因多态性的检测,该位点CC基因型可能与肝纤维化有关.
关键词： 多聚酶链式反应 限制性片段长度多态性分析 纤维化 转化生长因子β1 -
血管紧张素Ⅰ转换酶基因多态性与2型糖尿病合并脑梗塞的关系
肾素-血管紧张素(R-A)系统与多种心血管疾病发病有关，血管紧张素转换酶(ACE)可将血管紧张素I转换成血管紧张素Ⅱ，后者是强烈缩血管物质，对血管调节具有重要作用。已发现机体ACE水平受遗传控制[1]，人ACE基因位于染色体17q23上，其中第16内含子内存在一个287bp的插入／缺失(insertion/dletion，I／D)多态性[2]，该基因多态性与糖尿病肾病、心肌梗塞、高血压病等有关联[3]。我们用多聚酶链式反应(PCR)法检测出该多态性，并探讨了其与血清ACE水平及中国汉族人2型糖尿病及其合并脑梗塞的关系，现报告如下。材料与方法一、研究对象1.无脑血管并发症的2型糖尿病组(DM组)60例，年龄62.4±4.7岁，男27例，女33例，病史6～21年，为我院1995～1998年门诊及住院患者。按WHO标准诊断，并排除冠心病、高血压病、脑血管疾病，3周内均未服用过ACEI治疗。2.2型糖尿病合并脑梗塞组(CI组)54例，年龄64.7± 5.1岁，男28例，女26例，糖尿病病史1～22年，脑梗塞病史1～9年，患者来源同上。按WHO标准及头颅CT和(或)MRI扫描确诊为糖尿病合并脑梗塞患者，无高血压病病史，其中27例为多发性腔隙性脑梗塞，均未用ACEI治疗。3.正常对照组66例，年龄63.6±6.2岁，男34例，女32例，经检查均排除糖尿病、高血压病、冠心病及脑血管病，且均无糖尿病家族史。以上各组受检者均为无血缘关系的汉族人。二、实验室方法1.PCR检测ACE基因多态性：用标准酚／氯仿法由周围血白细胞内提取基因组DNA，以聚合酶链锁反应(PCR)扩增对象基因组DNA中ACE基因第16内含子插入／缺失(I／D)的多态性[4]。2.血清ACE水平测定：采用紫外分光光度法检测，由海军总医院提供试剂盒。灵敏度为0.18U／L，批内CV值5.2％，批间CV值6.7％，单位U／L。3.统计方法：计算各组基因型频率及等位基因频率，经计算确认其符合Hardy-Weinberg平衡，组间频数比较用x2检验，组间、组内均数比较采用t检验及q检验，相关分析采用Spearman等级相关，相关疾病的基因型风险率以比数比(oddsratio，OR)及95％可信区(95％CI)表示，用SPSS软件进行数据处理。
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全血中细菌DNA检测方法的建立及初步应用
目的:采用PCR方法定性检测血中细菌DNA,快速诊断菌血症的存在.方法:提取全血DNA(包括细菌DNA),用PCR方法定性检测血中细菌16sRNA和大肠杆菌β-半乳糖苷酶DNA.结果:PCR方法可以检测出血中细菌DNA,PCR产物随着细菌DNA模板量的增加而增多;采用溶血处理全血可以增加细菌DNA检出的灵敏度,全血可冷冻保存;在肝缺血-再灌流大鼠和免疫抑制大鼠血中检出不等量的细菌DNA;部分脓毒症/发热病人血中可检测到细菌DNA的存在.结论:PCR方法检测全血细菌DNA具有简便、快速、灵敏和经济的优点,可用于实验研究及临床菌血症的诊断.
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皮肤鳞状细胞癌组织中人乳头瘤病毒型别的检测
目的：分析皮肤鳞状细胞癌患者感染人乳头瘤病毒（HPV）的现状和分布规律，探讨HPV感染与皮肤鳞状细胞癌发生的关系。方法应用多聚酶链式反应（PCR）技术对300例组织病理学诊断为皮肤鳞状细胞癌的组织标本进行HPV DNA检测，主要检测型别为HPV6、11、16、18、31、33。结果300例皮肤鳞状细胞癌患者中，HPV阳性188例，HPV感染率为62.67%；男性HPV感染率为66.33%，女性HPV感染率为55.78%，性别差异无统计学意义（P＞0.05）。高分化（Ⅰ～Ⅱ级）HPV感染率为67.86%，低分化（Ⅲ～Ⅳ级）HPV感染率为47.37%，两组之间差异有统计学意义（P＜0.01）。头面部、颈部、四肢、躯干以及生殖器和腹股沟部HPV感染率分别为70.23%、65.79%、43.33%、28.00%和68.42%。共检出高危型（HPV16和HPV33）感染51例，低危型（HPV6）感染49例，均为单一型别感染。结论 HPV感染型别检测对皮肤鳞状细胞癌的防治有重要意义。
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壮族与汉族载脂蛋白E基因频率的比较
人类血浆载脂蛋白E(ApoE)基因对脂蛋白代谢的调控具有重要意义.ApoE具有3种等位基因(e2,e3,e4)和6种基因型(e2/2,e2/3,e2/4,e3/3,e3/4,e4/4)[1,2].其基因型的分布在不同种族群体中差异显著[2].我们应用限制酶切变异型基因检测法,利用多聚酶链式反应技术结合限制酶切片段长度多态性,首次对壮族人群ApoE基因频率进行研究,并将之与汉族人群进行比较.
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PCR-ELISA检测腺病毒DNA方法学研究
目的:建立一种敏感、特异的PCR-ELISA腺病毒(adenovirus ,Adv)DNA检测方法.方法:应用PCR-ELISA技术检测病人咽拭子中Adv-DNA.结果:PCR-ELISA检测灵敏度特异性和比PCR琼脂糖凝胶电泳法高.结论:实验数据表明腺病毒是呼吸道感染的重要病原体.PCR-ELISA技术在迅速检测临床标本的腺病毒感染非常实用.
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建立简便HBV、DNA、PCR-ELISA检测方法
目的:建立一种敏感、特异的乙型肝炎病毒(HBV)DNA检测方法.方法:应用PCR扩增技术和核酸杂交技术结合酶促显色技术(即PCR-ELISA技术)来检测血清中的HBV DNA.结果:应用PCR-ELISA技术能够检出许多PCR琼脂糖凝胶电泳所检测不到的HBV DNA,大大地提高了检出率,而且,特异性强.结论:PCR-ELISA方法灵敏度高,特异强,检测结果数据化,不受主观因素的影响.
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介绍两种鼠疫动物脏器PCR扩增模板的制备方法
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR技术,是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术,此法操作简单,可在短时间内在试管中获得数百万个特异DNA序列的拷贝,但模板的制备是PCR技术的重要环节,目前模板处理方法很多,有煮沸法、酚:氯仿:异戊醇抽提法、Nal-玻璃粉吸附法等,现在我们重点介绍煮沸法和美国CDC DNA提取法.
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原位反转录PCR技术及其应用的研究进展
多聚酶链式反应(ploymease chains reaction,PCR)是80年代以来广泛应用的体外液相基因扩增技术,具有高度特异性和敏感性,能对正常和许多疾病的靶序列进行分子水平的分析.但PCR需要对细胞或组织加以破碎以分离核酸,因此不能将扩增的结果直接在组织中定位,即难以确定靶序列所在的细胞和组织类型,这是PCR技术的一个明显的局限性.
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多聚酶链式反应与酶联免疫吸附试验诊断肺炎支原体的比较
肺炎支原体(MP)是引发急性呼吸道感染和不典型肺炎的病原体。诊断肺炎支原体感染主要依靠实验室检查。我们应用多聚酶链式反应(PCR)技术和酶联免疫吸附试验(ELISA)法对临床115例呼吸道感染的患者进行了MP-DNA和抗MP-IgM的检测，并将两种方法对诊断肺炎支原体感染的临床应用进行了比较研究，现报道如下。1 资料与方法1.1 检测对象
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乳腺癌端粒酶活性与PCNA表达关系
目的 探讨端粒酶活性与增殖细胞核抗原(PCNA)表达之间的关系及联合检测对乳腺癌术后治疗方案制定和预测预后的意义.方法 采用端粒重复序列扩增聚合酶链反应-酶联免疫吸附测定法(TRAP-PCR-ELISA)和免疫组织化学链霉素生物蛋白过氧化物酶(S-P)法对80例乳腺癌组织、36例乳腺癌相应癌旁组织和10例乳腺良性病变的端粒酶活性及增殖细胞核抗原进行检测.结果 (1)80例乳腺癌患者癌组织标本、36例乳腺癌相应癌旁组织标本中端粒酶表达阳性率分别为65.0%和8.3%,差异有统计学意义(P＜0.01);10例乳腺良性病变组织标本中未检测出端粒酶活性;腋窝淋巴结有无转移与端粒酶阳性表达率差异无统计学意义(P＞0.05).(2)80例乳腺癌组织中PCNA的阳性表达率为63.75%;乳腺癌有淋巴结转移组PCNA阳性表达率显著高于无淋巴结转移组(P＜0.01),且呈正相关(P＜0.01),即淋巴结转移程度越低,PCNA阳性表达率亦越低.(3)端粒酶活性与PCNA表达具有一致性(P＜0.01),且呈正相关(P＜0.01),一致率为86.25%.结论 端粒酶活性与PCNA表达具有一致性,端粒酶活性与PCNA联合检测,可为乳腺癌术后治疗方案的制定和预测预后提供辅助依据.
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分子分型技术用于流脑疫情的同源性分析
目的 应用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)技术和脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)技术对大连市2014年4月同一工地两起流脑疫情得到的脑膜炎奈瑟氏菌株进行分子分型图谱分析,了解各菌株之间的亲缘关系.方法 对病例的脑脊液标本进行脑膜炎奈瑟菌PCR分群,对另一病例和所有密切接触者分离菌株进行多位点序列分型(MLST)试验和脉冲场凝胶电泳(PFGE)鉴定实验.结果 疑似病例标本PCR结果为脑膜炎奈瑟氏菌A群阳性,另一病例和所有密切接触者分离到的菌株PFGE图谱基本相同,表明来自同一克隆系.多位点序列分析结果为ST7.结论 两起疫情分离到的菌株型别之间具有高度的同源性,该病原菌类型为ST7的A群脑膜炎奈瑟氏菌.
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荧光定量PCR检测传染性单核细胞增多症EB病毒的评价
目的 研究荧光定量PCR检测传染性单核细胞增多症(以下简称传单)EB病毒(EBV)DNA量的意义,了解EBV DNA拷贝量与病情程度的相关性.方法 采用荧光定量PCR检测2004年6月至2006年6月在湖南省人民医院儿科住院的68例传单患儿外周血单个核细胞(PBMCs)EBV DNA量,根据病情将患儿分为单器官系统组和多器官系统组,比较两组EBV DNA量.结果 (1)传单患儿EBV DNA阳性率为86.8%,拷贝量均值为13200拷贝/mL.(2)EBV DNA量在单器官系统组和多系统组差异有统计学意义(P＜0.05).传单患儿器官损害越多,EBV DNA拷贝量越高.结论 PBMCs荧光定量PCR检测EBV DNA量是有助传单诊断、治疗的较好手段.监测EBV DNA量对及早评估病情、及早治疗有一定指导意叉.
关键词： EB病毒 传染性单核细胞增多症 多聚酶链式反应 -
丝状真菌顶头孢霉染色体DNA的提取
目的探索提取头孢菌素C产生菌顶头孢霉基因组DNA的方法.方法采用氯化苄法、液氮研磨法和酶裂解法.结果较其他两种方法比,氯化苄法提取效果好.当提取液pH值为9.0～10.0、EDTA浓度为120 mmol·L-1时,所得的顶头孢霉染色体DNA的质量和数量均较理想,每克(湿重)顶头孢霉菌丝体能得到96μg的染色体DNA.常规琼脂糖凝胶电泳分析,其DNA片断大于23 kb.结论该分离方法获得的染色体DNA质量较高,可进行限制性内切酶酶解并适合后续特定基因的PCR扩增反应.
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利用电转化和三亲杂交方法高效转化根癌农杆菌
目的探索根癌农杆菌的高效转化方法.方法考察质粒经电击转化法转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)的影响因素,并优化其转化条件;研究采用三亲杂交方法,将带有vgb基因簇的重组质粒pYG308导入A. tumefaciens LBA4404;经PCR扩增反应进行验证.结果外加电场强度和脉冲时间是决定电转化效率的关键因素,两者适当组合才可获得高转化效率;采用对数期中期的细菌和提高细菌浓度均可提高转化效率.用三亲杂交方法转化A.tumefaciens LBA4404,可得到较高的转化效率.所获抗性转化子的质粒DNA酶切图谱正确.结论 带有双元载体(含vgb基因)的根癌农杆菌构建成功.
