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以结核分枝杆菌mRNA为靶点的检测方法与意义的评价
结核病是结核分枝杆菌引起的传染性疾病,目前仍然是全球范围严重感染性疾病之一.至今,人们对结核分枝杆菌及结核病的很多方面都还处在科研探索的过程中.现代科学技术的发展为研究结核分枝杆菌的生物学特性以及结核病的快速诊断和治疗都带来广阔的发展前景.自从20世纪80年代核酸体外扩增技术应用于结核分枝杆菌的检测以来,进入以PCR为代表的分子生物学技术检测结核分枝杆菌的新阶段,人们不断对其进行着研究和探索,近几年新出现的以结核分枝杆菌mRNA为靶点的体外扩增检测具有一定意义上的开发和应用价值.
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康莱特对肿瘤浸润淋巴细胞的体外扩增及抗肿瘤作用的研究
目的:观察康莱特(KLT)对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的体外扩增及抗肿瘤免疫作用,为扩大该药的临床应用范围提供依据.方法:从癌症患者恶性胸水中分离获取TIL和自体瘤细胞,观察KLT对TIL体外长期存活、扩增及抗肿瘤作用的影响.结果:①KLT可使TIL体外长期存活(＞17d).②KLT可使TIL在10d内持续扩增并在11～15d保持较高水平.TIL在完全培养液内则在1周内死亡.③扩增后的TIL在体内外的抗肿瘤活性均明显增强,作用类似重组白细胞介素2(rIL-2).结论:KLT可明显促进TIL的体外扩增及抗肿瘤作用,可作为TIL的中药促进剂来替代rIL-2.
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恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞高效体外扩增的方法
探讨从恶性肿瘤患者外周血单个核细胞(PBMCs)中高效扩增淋巴细胞的方法,取3例恶性肿瘤患者的PBMCs,每例患者重复3次,在GMP实验室体系下,经淋巴细胞刺激因子体外诱导扩增淋巴细胞和观察扩增情况,应用流式细胞仪分析扩增前后总CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+淋巴细胞、CD3 CD16+56+(NK细胞)、CD3+CD16+56+(NKT细胞)以及CD4+和CD8+T细胞比值的变化,分析培养前后各淋巴细胞亚群的扩增情况和重复性,同时观察淋巴细胞体外扩增培养后回输患者的生物安全性.结果表明,CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD16+56+细胞比例较培养前明显增加(P＜0.01),而CD3+CD4+、CD3 CD16+56+细胞比例、CD4+和CD8+T细胞比值则明显的降低(P＜0.01).CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD16+56+细胞增殖倍数的中位数分别为487.9、832.5和2540.6;而CD3+CD4+和CD3 CD16+56+则分别为159.6和155.5.细胞体外扩增培养前后亚型和扩增倍数的重复性较差,在本研究中只有CD3+T细胞在体外培养前后、CD3+CD16+56+细胞在培养后的CV值在10%以内.培养扩增后淋巴细胞细菌、真菌、支原体、外来病毒及内毒素检查后无阳性发现,所有患者细胞回输治疗后无明显的毒副反应.在本研究体系下体外诱导扩增培养肿瘤患者自体外周血NK细胞及致敏淋巴细胞效率较高,细胞毒性细胞比例增高较大,具有良好的生物安全性,为恶性肿瘤患者应用NK细胞进行过继免疫治疗提供了一种简单有效的扩增NK细胞的方法.
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添加细胞因子优化人外周血γδ T细胞的体外扩增培养体系
目的从添加细胞因子角度,优化用于肿瘤过继免疫治疗的γδ T细胞体外扩增培养方案. 方法在固相化抗TCR γδ抗体加IL-2扩增人外周血γδ T细胞的体系基础上,添加其他的γ链受体家族细胞因子,包括IL-7、IL-15或IL-21,单独或联合使用、长期使用或短时添加,通过流式细胞术检测γδ T细胞纯度、细胞增殖及细胞毒活性相关分子的表达,计算γδ T细胞扩增效率;乳酸脱氢酶法检测γδ T细胞对人Burkitt`s淋巴瘤细胞系Daudi的细胞毒活性.结果单独使用IL-7或IL-21不能有效扩增γδ T细胞,但单独使用IL-15可以使γδ T细胞纯度、扩增效率及细胞毒活性均达到与单独使用IL-2相当的水平;IL-2与 IL-15联合使用,可促进γδ T细胞表达CD69,从而显著提高其扩增效率(P<0.05);而IL-2与 IL-21联合使用,可通过促进γδ T细胞颗粒酶A的表达,增强其对Daudi细胞的细胞毒活性(P<0.001);IL-2、IL-15和IL-21联合使用可以显著提高γδ T细胞的细胞毒活性,但是会影响其扩增效率;而仅在效应前短时间添加IL-21,同样可以有效增强γδ T细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性(P<0.05).结论在用固相化TCR γδ抗体加IL-2体外扩增培养γδ T细胞体系中,使用IL-15,而在回输效应前短时间添加IL-21,显著提高γδ T细胞扩增效率及对肿瘤细胞的细胞毒活性,此为目前优化的γδ T细胞体外扩增培养方案.
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转FL、GM-CSF基因的人骨髓基质细胞促进脐血CD34+细胞体外扩增
研究转FL、GM-CSF基因的基质细胞对脐血CD34+细胞的扩增效应.将转FL、GM-CSF基因的入骨髓基质细胞系与脐血CD34+细胞共培养,观察细胞总数、CD34+细胞数、CFU-GM的变化情况.培养到第4周时,第(4)组(SCF+IL-3+IL-6+GM-CSF+FL)和第(8)组(HFCL/hGM-CSF+HFCL/hFL+SCF+IL-3+IL-6)的细胞总数增加到大,分别扩增了717±24.47和709±63.63,第1周,第(5)组(HFCL+SCF+IL-3+IL-6)扩增了10.5±2.08倍,较第(8)组减少(P＜0.05).第1周时,CD34+细胞总数第(4)组和第(8)组分别扩增了8.44倍和11.5倍(P＜0.05),CD34+细胞百分率第(7)组(FCL/hFL+SCF+IL-3+II,-6)为50.2%,第(6)组(HFCL/hGM-CSF+SCF+IL-3+IL-6)为28.95%(P＜0.01).第2周,各组CFU-GM增加显著,以第(4)组和第(8)组增加为明显,以后随扩增时间延长,造血细胞集落数、集落体积逐渐减少.表明转FL、GM-CSF基因的基质细胞,能有效的协同其他细胞因子对脐血CD34+细胞产生明显的扩增作用,能显著改变基质细胞造血功能.
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人脐血造血干细胞体外扩增方法初探
目的 建立人造血干细胞(HSC)体外大量扩增的佳培养模型.方法 采用模拟骨髓微环境的成骨细胞共培养法、条件培养基及模拟微重力效应三维培养等方法进行人脐带血来源HSC体外扩增.结果 在用含15%的条件培养基与成骨细胞共培养条件下,HSC的扩增倍数高,第7天和第14天扩增倍数分别为6.46和14.82倍.在此条件下进行集落形成实验对扩增后造血干细胞多能性的功能检测发现,粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)及红系集落形成单位(BFU-E)数目也多.结论 以成骨细胞作为饲养层细胞,添加15%的条件培养基不仅能使HSC在体外大量增殖,并且具有维持HSC自我更新和多向分化潜能.
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体外培养中间充质干细胞的异质性
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)具有易于取材、体外扩增能力强、低免疫原性和免疫调节作用等特点,已成为细胞/基因治疗和组织工程的重要种子细胞.作为一种细胞药物,MSC已经完成Ⅲ期临床试验,用于难治性移植物抗宿主病的处理.然而,截至目前,人们对体外扩增MSC的本质并不清楚.体外培养的MSC都是真正意义上的干细胞么?如否,为什么扩增的MSC仍具有多向分化性呢?MSC群体的不均一性的意义是什么?本文将围绕体外扩增MSC的异质性,对上述问题进行简要的阐述.
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调节性T细胞体外扩增和免疫治疗研究进展
CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg)在建立和维持免疫耐受方面发挥重要作用.若干实验模型已证明它可以控制自身免疫性疾病,维持同种异体移植耐受并预防过敏性疾病.限制其临床应用的原因与它明确的细胞表型和外周血中有限的数量有关,即占CI4+T细胞的百分比不超过5％-10％.近年来,利用多色流式细胞仪和免疫吸收柱技术的Treg分选方法提供了克服这些障碍的途径,并开启了Treg临床应用的大门.本综述突出Treg的特点,描述细胞分选和体外扩增技术的当前信息,并概述近几年开展的过继转移实验和免疫治疗临床试验.可以预见,Treg的过继转移将会称为一种很有前途的免疫抑制治疗.
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巨核系祖细胞的体外扩增及应用研究
如何缩短造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSC)移植术后血小板减少的时间,促进血小板恢复,减少出血,是目前造血干细胞移植面临的难题.在巨核细胞系的发育过程中,有多种细胞因子,如血小板生成素(TPO)、巨核细胞生长发育因子(megokaryocyte growth and development factor, MGDF)、白介素(interleukin, IL)-1、IL-3、IL-6、IL-11、血小板源性生长因子(PDGF)、5-羟色胺(serotonin, 5-HT)等发挥了重要作用.近年来巨核祖细胞(MKPC)的体外培养、扩增等研究取得了较大进展,发现通过体外有效扩增巨核祖细胞并移植给患者,可以加快血小板恢复,因此其在HSC移植中有十分重要的意义及良好的应用前景.本文将重点就各种细胞因子对巨核系造血作用和MKPC体外扩增及临床应用进行综述.单独以TPO培养扩增,结果产生的CD41+CD61+细胞比例增高,但细胞总数较低.当加入IL-1β, IL-3, IL-6, Flt-3L时,结果显示CFU- MK扩增400倍,CD34+细胞扩增5-22倍.在包括TPO、IL-1β、IL-3、IL-6和Flt-3L的各种细胞因子组合条件下,加入PDGF的扩增效果好,且PDGF促进各种细胞包括CD34+、CD41+CD61+、CFU-MK的扩增.PDGF对脐血巨核祖细胞数量的扩增起一定作用,且对脐血MK的成熟没有影响.反映PDGF作用于MKPC的增殖.PDGF可能是促进MKPC体外扩增的合适细胞因子.动物实验显示体外扩增产物在NOD/SCID小鼠中植活并分化.在临床可行性研究中,进行自体PBPC移植的10名癌症患者(8名乳癌和2名非霍奇金氏淋巴瘤患者),修回未处理过的PBPC的同时输注了体外扩增的MKPC(1-21×105/kg CD61+细胞).8名患者修回同一供者的异基因血小板输注,4名输注高数量培养后MKPC的患者中有2名不需要输注血小板,而回顾性对照组14名患者均需输注血小板.总之,巨核祖细胞能在体外扩增并安全输注予自体移植受者.
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脐血CD34+细胞体外诱导扩增红系细胞的探索
本研究利用脐血CD34+细胞在体外大量扩增红系细胞为解决血源短缺、杜绝输血传染、克服稀有血型患者疑难配血等问题提供一种有益的途径.利用添加SCF、IL-3、EPO等细胞因子的无血清培养液扩增脐血来源的CD34+细胞,并通过间充质干细胞的支持培养来诱导其向红系细胞扩增和分化.结果表明,经过23天培养以后,本方法可以使细胞的扩增倍数达到2.52×105,其中95%以上都是红系细胞,粒单系细胞和巨核细胞所占比例都在1%以内.无间充质干细胞的培养体系在细胞扩增数量及红系细胞所占比例方面都明显逊于有间充质干细胞支持的培养体系.结论:利用细胞因子和间充质干细胞可以在体外大量扩增红系细胞,其中间充质干细胞对红系细胞增殖和分化起重要的促进作用.
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不同细胞因子组合对人脐血单个核细胞体外扩增及CD49d和CXCR4表达的影响
为了探讨不同的细胞因子组合对脐血单个核细胞体外的扩增作用及扩增后CD49d和CXCR4的变化,将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7天,在0天,7天检测有核细胞数,CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD49d+的细胞数和集落形成单位(CFU)数.根据不同细胞因子组合实验分组为:对照组;SF组(SCF+FL);SFT组(SCF+FL+TPO)和SFT6组(SCF+FL+TPO+IL6).结果表明,和对照组相比,SF组合仅能低水平支持脐血造血细胞扩增,加入TPO后即SCF/FL/TPO组合能有效的扩增脐血细胞,但SFT和SFT6两组之间差异却无明显发生(P＞0.05);SF,SFT和SFT6 3组的细胞因子组合均可提高脐血CD34+细胞CD49d,CXCR4的表达,但3组之间差异无显著性(P＞O.05).结论:SF组合可协同扩增人造血细胞,但协同作用较弱;TPO在脐血造血干/祖细胞体外扩增中起重要调节作用,而IL-6作用不显著;SCF/FL/TPO 3种因子组合不仅可促进脐血造血祖细胞的扩增,而且可上调脐血造血细胞CD49d,CXCR4表达.
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体外扩增的脐血单个核细胞植入NOD/SCID小鼠的研究
为了探讨在无血清、无基质培养条件下SCF、FL和TPO 3种因子组合体外扩增的脐血单个核细胞(MNC)的佳移植时机及植入潜能,将SCF,FL和TPO 3种因子组合体外扩增的脐血单个核细胞培养14天,在0、7、10和14天检测有核细胞数(TNC),CD34+细胞数,CD34+CXCR4+细胞数,CD34+CD49d+的细胞数及集落形成单位(CFU)数,并将SCF+FL+TPO 3种因子组合的无血清无基质条件下扩增培养7天前后的脐血单个核细胞移植给经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠,6周后用流式细胞术,PCR法检测存活小鼠体内的人源性细胞.结果表明,经过14天的培养,脐血细胞得到了有效的扩增,TNC数,CD34+细胞数,CD34+CD49d+的细胞数于7天达高峰,其后开始下降,而CFU数,CD34+CXCR4+细胞数于第10天达高峰.在移植6周后,扩增脐血移植组的NOD/SCID小鼠的存活率和人源性CD45+细胞的检出率分别为56.25%和(1.39±0.63)%,高于新鲜脐血移植组31.25%和(0.73±0.16)%,亦高于生理盐水移植组(0和0),差异有显著性(p＜0.05),扩增脐血移植组有6只NOD/SCID小鼠骨髓细胞中可检测到人特异ALU序列的表达.结论:体外培养7-10天可能是收获细胞的佳时机;SCF+FL+TPO 3种因子组合扩增7天的脐血单个核细胞能够植入NOD/SCID小鼠,其植入水平优于未扩增的脐血;上调脐血造血细胞上CXCR4,CD49d的表达可能会增加脐血造血细胞的植入能力.
关键词： 脐血 单个核细胞 体外扩增 NOD/SCID小鼠 -
草分支杆菌F.U.36混悬注射液对人脐血树突状细胞体外扩增的影响
为了探讨草分支杆菌F.U.36混悬注射液(乌体林斯,U)对人脐血来源树突状细胞(DC)体外扩增有无影响,应用Ficoll-Hypaque法分离人脐血单个核细胞(CB-MNC),对照组以RPMI 1640培养液诱导培养CB-MNC,实验组分为Utilin"s"组(仅加入Utilin"s"PRMI 1640),GTI组(GM-CSF,TNF-α,IL-4)和GTIU组(GM-CSF,TNF-α,IL-4和Utilin"s").在光学显微镜下观察DC生长情况.至培养第10天,应用流式细胞仪检测各组细胞免疫表型,并将细胞涂片行瑞氏-姬姆萨染液染色,在油镜下观察摄片.结果显示:3个实验组均得到一定数量的典型DC;Utilin"s"组CD1a+、HLA-DR+细胞比例高于对照组;GTIU组HLA-DR+细胞比例升高明显,高于GTI组.结论:草分支杆菌F.U.36混悬注射液不仅能促进脐血DC体外扩增,还能协同rhGM-CSF、rhTNF-α、rhIL-4促进DC成熟.
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脐血体外同时诱导扩增T,NK和CD34+细胞
体外研究表明,人脐血含有比骨髓细胞更原始更早期的造血干细胞群.移植后所引起的GVHD发生率及程度都比骨髓及外周血要低,但其相应的GVL效应也较低,容易复发.单份脐血所含有的造血细胞量仅可以满足一定体重以下的儿童患者需求,对需移植的大部分成人患者则要进行体外扩增.脐血体外扩增后进行干细胞移植是一种新的设想和尝试,移植物中免疫细胞的组成和功能是决定干细胞移植能否成功重建造血与免疫、以及平衡GVHD和GVL的重要因素.为了研究脐血体外同时诱导扩增T、NK和CD34+细胞的可能性,本实验无菌采集健康正常足月产新生儿脐血,并分离出单个核细胞,在不同的细胞因子组合作用下用IMDM培养液培养14天.在培养0、3、7、14天时收集细胞,用FCM分析扩增前后脐血干/祖细胞及T、NK免疫细胞含量.结果表明,与无细胞因子的对照组相比,所有细胞因子SCF,IL-3,IL-6,IL-7,IL-2组合组别均能显著扩增脐血中的单个核细胞.所有细胞因子组合组别均能显著增加脐血中的CD34+细胞比例,使其含量从新鲜脐血中的1.6%升高到高D组的11.9%.第7天时CD34+细胞平均增加10至50倍不等.新鲜脐血中CD3+T细胞平均为(18.7±4.3)%,在无细胞因子的对照组中CD3+T细胞下降明显,而在含细胞因子的组别中CD3+T有不同程度的增加,扩增高的组别中CD3+T细胞是新鲜脐血的2倍.在新鲜脐血中含(3.6±1.9)%CD56+细胞.CD56+细胞数量仅在含细胞因子IL-2的组别中有显著增加,其它组则无明显变化.结论:脐血中T细胞、NK细胞在一定细胞因子组合下,可与干/祖细胞同时在体外被扩增和诱导分化.
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动员人外周血巨核祖细胞体外扩增的研究
本研究探讨多种细胞因子(TPO、SCF、FL、IL-1、IL-3、IL-6)组合的几种培养体系对人外周血CD34+细胞体外诱导扩增生成巨核细胞的作用,研究人外周血来源的巨核细胞体外扩增的佳细胞因子组合及培养时间.用Ficoll-Hapaque分离法分离动员的外周血(MPB)单个核细胞,免疫磁珠法分离纯化CD34+细胞,并将其在含胎牛血清的液体培养体系中、各组细胞因子诱导下培养15天.在不同时间点采用血细胞计数板进行细胞计数,采用流式细胞术检测培养体系中CD41+细胞的含量;同时采用甲基纤维素半固体培养法进行巨核细胞集落培养,测定巨核细胞集落形成单位(CFU-MK)的数量.结果表明:经过15天的培养,在MPB来源的CD34+细胞体外诱导并扩增巨核祖细胞体系中,以TPO/FL/IL-6/IL-3组合的扩增效果好,明显高于其它3组,CD41+细胞第5天、10天分别扩增了93.97±17.27倍、131.23±18.26倍.第15天CD41+细胞含量及CD41+细胞数迅速下降.CFU-MK产率(/1×103个细胞)第5天、10天分别为83.33±10.02个、120.67±13.01个,明显高于其余3组.结论:以TPO/FL/IL-6/IL-3因子组合为体外诱导扩增巨核祖细胞的佳组合,动员外周血的巨核祖细胞体外诱导扩增以培养第10天为宜.本实验建立了动员人外周血来源的巨核祖细胞体外扩增体系.
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间充质干细胞对脐血CD34+细胞扩增及其细胞特性变化的影响
本研究探讨脐带间充质干细胞(MSC)对CD34+ 细胞(HSPC)体外扩增的支持作用及对CD34+ 细胞表面标志、归巢黏附分子、集落形成能力等干细胞特征变化的影响.用免疫磁珠法从新鲜分离的脐血单个核细胞分离CD34+ 造血干祖细胞(HSPC);用MSC饲养层(feeder)制备经137 Cs 照射的间充质干细胞饲养细胞(MSC feeder cells).将CD34+ 细胞接种在不同的培养体系中,实验分为3组:HSPC+CK组为培养液中加入细胞因子组合(SCF、FL和TPO),HSPC+MSC组为CD34+ 细胞接种在MSC feeder 上,HSPC+MSC+CK组同时加入细胞因子组合及MSC饲养细胞.培养后4、7、10、14天计数有核细胞总数(MNC),计算细胞扩增情况;用流式细胞术检测不同处理组间CD34+ 细胞及亚群免疫表型、归巢黏附分子和集落形成能力.结果表明:在2周的培养时间里,3组MNC和CD34+ 细胞均明显增加,MNC扩增数依次HSPC+MSC+CK组＞HSPC+CK组＞HSPC+MSC组.体外扩增10天内HSPC+MSC+CK组MNC得到大量的扩增,同时CD34+细胞的扩增亦较高.培养4天3组细胞CD34+比例较0天有明显下降(P＜0.01);扩增后CD34+ 细胞比例:HSPC+MSC组＞HSPC+MSC+CK组＞HSPC+CK组(P＜0.01);各组CD34+细胞亚型细胞比例有所不同,HSPC+CK组4天时CD34+ CD38-细胞有一过性升高(62.71%),之后迅速降低,7天时为0.05%;HSPC+MSC组7天时CD34+ CD38-细胞比例为18.92%,与HSPC+CK组比较差异有统计学意义(P＜0.05).从集落形成分析结果看出:MSC、细胞因子混合组扩增后细胞集落形成能力在不同时间点均维持在较高水平.结论:脐血CD34+细胞在体外短期培养(＜7天)下,MSC和细胞因子联合应用能同时使CD34+细胞得到明显的扩增并维持造血干祖细胞的生物学特征.
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脐带血血浆分离培养脐带间充质干细胞及体外扩增人脐血CD34+细胞的研究
目的:探讨以脐带血血浆替代胎牛血清体外分离培养脐带间充质干细胞(UCMSC)的可行性,并观察其作为滋养层细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的支持作用.方法:收集符合广州脐血库供者合格筛选标准的脐带血,在脐带血干细胞制备过程中去除的血浆,经病原学及微生物检测合格,多份混合用于细胞培养.采用酶消化法从健康足月分娩新生儿的脐带组织分离获得UCMSC,将其分为3组.培养第1和第2组以DMEM/F12为基础培养液,分别添加胎牛血清(FBS)和混合脐带血血浆(UCP),第3组为商品化无血清培养液(StemPro(R) MSC SFM CTSTM).经培养扩增后,采用流式细胞仪检测细胞免疫表型,并进行MSC成骨、成脂分化鉴定.取冻存复苏后的3组细胞,标记为UCMSCFBS、UCMSCUCP及UCMSCSFM,分别建立滋养层.应用免疫磁珠分选系统(MACS)分选人脐带血CD34+细胞,在添加造血因子组合(StemSpan(R)CC100)的CD34+无血清培养液(StemPro-34 SFM)中培养,并根据滋养层的不同,分为4组:A组CD34+细胞(CD34+ cells)为空白对照组;B组为FBS滋养层组(UCMSCFBS+ CD34+ cells),C组为UCP滋养层组(UCMSCUCP+ CD34+ cells),D组为SF滋养层组(UCMSCSFM+ CD34+cells).于培养第0天和第7天计数各组的有核细胞数(NC)、流式细胞仪检测CD34+比例,并进行造血祖细胞集落培养,评估扩增效率.结果:在3种培养体系下的UCMSC均呈现典型的梭形漩涡状生长,MSC表面标记的表达谱系基本无差异,均具有向成脂、成骨分化的能力,但在UCP培养条件下细胞的扩增能力显著高于其他2组(P＜0.05).经过7d与脐带血CD34+细胞的共培养,虽然4组的CD34+细胞比例均下降,但NC及CD34+细胞数均得到显著扩增,其中UCMSCUCP滋养层组和UCMSCSFM滋养层组均大于UCMSCFBS滋养层组和空白对照组(P＜0.05).与第0天的集落形成能力比较,UCMSCUCP滋养层组与UCMSCSFM滋养层组的集落扩增倍数无差异,但前者的扩增倍数高于UCMSCFBS及空白对照组.结论:UCP可作为一种较为理想的无动物源性的血清补充物,用于UCMSC的分离培养并维持其生长、增殖、分化,是临床级MSC大量扩增培养体系较为安全的选择.
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直接转染HOXB4基因和转染HOXB4基因的脐带间充质干细胞体外扩增人脐血CD34+细胞的研究
本研究探讨直接转染HOXB4基因和转染HOXB4基因的人脐带间充质干细胞体外扩增人脐血CD34+细胞中有核细胞数、CD34+细胞比例与扩增倍数、细胞周期及集落形成能力的异同.将人脐带间充质干细胞(HUC-MSC)分为2组,1组利用慢病毒载体将HOXB4基因转染至HUCMSC并建立滋养层(HOXB4-HUCMSC),另1组建立未转染的滋养层(HUCMSC).应用免疫磁珠分选系统(MACS)分选出人脐血CD34+细胞,在含细胞因子的培养液中培养48 h后分5组,其中对照组2组:A组CD34+细胞(CD34+ cells)为空白对照组,B组空病毒转染CD34+细胞(GFP-CD34+ cells)为阴性对照组;实验组共3组:直接转染HOXB4基因组(HOXB4-CD34+ cells)为C组;HUCMSC滋养层组(HUCMSC+ CD34+ cells)为D组;HOXB4-HUCMSC滋养层组(HOXB4-HUCMSC+ CD34+cells)为E组.于培养第6、10、14 d计数有核细胞数(NC),第10 d比较不同处理条件对CD34+细胞比例、细胞周期与集落形成能力的影响.结果表明,利用慢病毒载体可将HOXB4基因转染至HUCMSC并检测到表达,成功建立了HUCMSC与HOXB4-HUCMSC滋养层.经过14 d体外培养,5组有核细胞均得到显著扩增,比较表明,其效果依次为HOXB4-HUCMSC滋养层组＞直接转染HOXB4基因组＞HUCMSC滋养层组＞2对照组(P＜0.05).在体外扩增第10 d,5组有核细胞CD34+比例均大幅下降,经计算实验组CD34+细胞扩增倍数较第0d显著增高,经比较显示,CD34+细胞比例与扩增倍数高低依次为直接转HOXB4基因组＞HOXB4-HUCMSC滋养层组＞HUCM-SC滋养层组＞两对照组(P＜0.05);流式细胞仪分析细胞周期表明,实验组的S+G2/M期比例较对照组高,其中HOXB4-HUCMSC滋养层组比例高,为41.57％,高于直接转染HOXB4基因的37.87％与HUCMSC的滋养层组的28.65％ (P ＜0.05).HOXB4-HUCMSC滋养层组与直接转HOXB4基因组的集落形成能力无差别,但均高于HUCMSC滋养层组与对照组.结论:HOXB4-HUCMSC滋养层可显著扩增CD34+细胞并可保持其于细胞活性,与直接转染HOXB4基因的CD34+细胞可能产生的潜在致病性基因插入和致突变性风险相比较,HOXB4-HUCMSC滋养层对CD34+细胞的体外扩增相对更安全,有潜在的应用价值.
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脐带血来源的间充质干细胞对CD34+细胞增殖的支持作用及其机制
目的:探讨脐带血来源的间充质干细胞体外支持造血干细胞扩增的能力及所涉及的可能机制.方法:将来源于脐血的造血干细胞与间充质干细胞共培养14 d,然后计数造血干细胞数与集落形成单位.ELISA方法检测间充质干细胞培养上清中含有的细胞因子.结果:与间充质干细胞共培养的造血干细胞增殖率明显高于单独培养的造血干细胞(P＜0.05).此外,在培养体系中添加外源性细胞因子可明显提高造血干细胞增殖率(P＜0.05).间充质干细胞能分泌多种细胞因子,包括GM-CSF、IL-7、IL-8、IL-11、SCF和SDF-lα.结论:脐带血间充质干细胞作为细胞滋养层可用于体外扩增造血干细胞,间充质干细胞分泌的细胞因子可能介导MSC对HSC增殖的支持作用.
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基质细胞对体外扩增造血细胞造血重建活性的促进作用
本研究探讨骨髓单个核细胞(BMMNC)在不同的培养条件下扩增后是否具有造血重建的活性.在小鼠BMMNC液体培养体系中,分别在含有几种细胞因子组合和(或)基质细胞层存在的条件下进行体外扩增,然后将不同条件下扩增的细胞经尾静脉回输至经致死量照射的小鼠体内,动态观察小鼠的骨髓有核细胞数及各种祖细胞集落数,以观察其造血重建的效果.结果表明:单纯细胞因子介导BMMNC体外扩增后并不能增进这些细胞的造血重建功能,但含有骨髓基质细胞底层的体外扩增,无论是否加入细胞因子,均有明显的促进移植受体造血功能重建的作用.结论:骨髓基质细胞支持下体外扩增的造血细胞具有促进移植受者造血重建的功能,证实了在维持体外扩增造血细胞的移植活性中,基质细胞具有非常重要的作用.
