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细胞外基质降解酶类与胚泡着床的关系
胚泡着床是妊娠建立的第一步，须经过胚泡的定位、粘着和穿透三个阶段。近年的研究表明，滋养细胞侵入子宫内膜的方式与恶性细胞相似，一些与细胞外基质(extracellular matrix, ECM)降解有关的酶类参与了此过程。 子宫内膜基质由胶原蛋白分子构成网架，主要成分是中性粘多糖和酸性粘多糖，内有大量星形或梭形的基质细胞。在胚胎着床的过程中，子宫内膜首先发生蜕膜化反应，内膜胶原纤维部分降解，排列分散而疏松；内膜间质的组织液增多，呈暂时性水肿。胚泡的合体滋养层细胞分泌一系列蛋白酶类，降解内膜的ECM，使胚胎能够进入子宫内膜，完成着床。
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人子宫内膜体外构建的实验研究
目的探讨体外构建人子宫内膜的新方法.方法将采用筛网分离法获得的原代人子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞依次接种到自制的液态胶原材料上共培养,形成子宫内膜组织,并与二维条件下正常培养的子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞进行比较.采用组织学和免疫组织化学方法观察所构建的子宫内膜的组织学特征,以及两种细胞在不同培养条件下的生长和分布情况.结果分离获得的子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞的纯度分别达到95%和90%.在Ⅰ型液态胶原形成的凝胶内,子宫内膜基质细胞排列紧密,腺上皮细胞呈腺体样结构.结论两种细胞与Ⅰ型液态胶原凝胶复合后构建的子宫内膜具有正常子宫内膜组织的结构.
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2-05 小鼠多终点试验检测美他多辛的雌激素样作用
目的美他多辛(metadoxine,MTDX)是一种治疗酒精中毒性肝病的新药,化学名为吡哆素L-2-吡咯烷酮～5-羧酸酯.在毒理学安全性评价中发现该药可引起大鼠精子减少,交配率和受孕率下降.该试验的目的是探讨其雄性生殖毒性机制是否包括雌激素样作用.方法性成熟NIH雌性小鼠,体重20～25g,卵巢摘除后观察1周,剔除去势不全的小鼠.1周后将小鼠随机分成5组,每组10只.分别灌胃给予MTDX 0、640、1 500和4 000 mg/kg及雌二醇0.2 mg/kg(阳性对照),每天1次,连续5 d.每天阴道涂片观察动情周期.第6天处死,观察子宫/体重比、子宫积液、子宫上皮细胞高度和子宫基质细胞层厚度等指标.结果 MTIDX各剂量组小鼠在5 d中均未出现明显的动情周期,未发现子宫水肿和积液,子宫/体重比、子宫上皮细胞高度和基质细胞层厚度与对照组比较,差异均无显著性.结论在本试验条件下,MTDX在小鼠体内不具有雌激素样作用.
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吗啡对子宫内膜基质细胞增殖及ERmRNA表达的影响
目的研究吗啡对雌激素诱导的体外培养的人子宫内膜基质细胞的增殖作用及其ERmRNA表达的影响. 方法体外分离培养人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,并通过免疫细胞化学的方法进行鉴定;将基质细胞给予17-β雌三醇或/和吗啡及纳洛酮干预,观察细胞的生长增殖情况;通过RT-PCR 的方法半定量分析吗啡对基质细胞的雌激素受体ERmRNA表达的影响. 结果第一代传代的基质细胞各组接种密度间比较,差异无显著性(P＞0.05).接种用药第1、3、5、7、天进行细胞计数,细胞数较对照组增加,E+Mor组细胞数较E2组降低,差异有显著性(P ＜0.01).E+ M+N组与E2组比较,差异无显著性(P＞0.05);ER 与内参照β-actin 分别在469 bp和348 bp处出现特征性条带.雌激素组、吗啡组与对照组比较,差异有显著性 (P＜0.05),E+Mor组与对照组比较,差异无显著性(P ＞0.05).吗啡作用24 h呈剂量依赖性抑制基质细胞ERmRNA的表达,3组吗啡的终浓度分别为1×10-6 mol/L、1×10-5 mol/L、1×10-4 mol/L,经Spearman等级相关检验,r=-0.946,差异有显著性(P＜0.01). 结论外源性阿片类药物吗啡可以直接抑制雌激素对人子宫内膜基质细胞的促增殖作用,其机制可能是影响了雌激素受体mRNA的表达.
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红曲对大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化的影响
目的:研究中药红曲对骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化的影响.方法:取SD大鼠60只,随机分为空白对照组,红曲低、中、高剂量组,普拉固组和倍美力组,分别予以蒸馏水、红曲水提液、普拉同水溶液、倍美力水溶液胃灌,10天后,制备含药血清;将从4-5周SD大鼠取材制备的骨髓基质细胞培养于含药血清培养液中,应用MTT法、对硝基苯磷酸盐法及茜素红染色等方法观察红曲对骨髓基质细胞向成骨细胞分化、增殖、碱性磷酸酶表达及矿化结节形成的影响.结果:含红曲血清明显增加了骨髓基质细胞向成骨细胞分化、增殖、碱性磷酸酶的表达水平及矿化结节的形成(P<0.05或P<0.01).结论:体外成功培养了骨髓基质细胞和成骨细胞;证实了含红曲血清可以呈剂量依赖性地促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化、增殖、矿化.
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补髓生血颗粒剂对慢性再障患者骨髓基质细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1的影响
目的探讨补髓生血颗粒剂对慢性再障患者(CAA)的作用机制.方法将慢性再障患者随机分为补髓生血颗粒剂组和再障生血片对照组,采用免疫荧光法检测慢性再障患者治疗前后骨髓基质细胞(BMSC)血管间粘附分子(VCAM-1)、细胞间粘附分子(ICAM-1)抗原表达水平.结果两组患者治疗前粘附分子水平ICAM-1、VCAM-1明显低于正常对照组(P＜0.001),治疗后两组患者ICAM-1、VCAM-1抗原水平都有不同程度的升高,并且在提高VCAM-1方面补髓生血颗粒剂组优于再障生血片对照组.阳虚型比阴虚型恢复好.结论慢性再障患者骨髓基质细胞ICAM-1、VCAM-1抗原表达水平异常,补髓生血颗粒剂可提高粘附分子ICAM-1、VCAM-1的表达,从而促进骨髓造血.进一步证实"阳虚易治,阴虚难调"的理论.
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人子宫内膜基质细胞和腺体细胞的分离培养及鉴定
目的 人子宫内膜分离培养并得到纯度较高的内膜基质细胞和腺体细胞。 方法 采用二次滤网过滤法进行分离并通过光镜观察和免疫细胞化学染色对其进行鉴别。 结果 基质细胞在接种后0.5h开始贴壁，可见梭形和多角形两种形态的细胞。免疫细胞化学染色显示这两种细胞均具有波形蛋白免疫反应性，反应率可达95%以上，而细胞角蛋白无免疫反应性，提示它们为来源于内膜基质的基质细胞。大部分腺体细胞在接种24h后贴壁，培养后4d左右腺体细胞呈旋涡状排列，单个细胞为多角形，核大而圆。腺细胞呈细胞角蛋白免疫反应性，反应率在90%以上。 结论 采用二次滤网过滤法可成功地分离人子宫内膜基质细胞和腺体细胞。
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新型CKLF1对家兔红系造血祖细胞增殖分化的影响
目的探讨新型趋化因子CKLF1对家兔骨髓单个核细胞形成红系集落的影响,并初步探讨其作用机制. 方法采用尼龙毛去除骨髓基质细胞法、甲基纤维素半固体培养法检测新型趋化因子CKLF1对家兔红系形成的影响. 结果新型趋化因子CKLF1具有促进家兔骨髓单个核细胞形成红系克隆的作用,并且该作用与CKLF1的浓度呈正相关;去除骨髓基质细胞后,CKLF1对红系克隆的形成无明显影响;另外,CKLF1刺激制备的基质细胞上清也具有促进红系克隆形成的作用. 结论新型趋化因子CKLF1可能是通过调控骨髓基质细胞而间接促进红系克隆的形成.
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造血微环境与血液肿瘤耐药
造血微环境是一个复杂的系统,它是由基质细胞(主要包括成纤维细胞、脂肪细胞、内皮细胞、巨噬细胞等)、基质细胞分泌的细胞因子及细胞外基质(纤维连接蛋白等糖蛋白)组成.造血微环境是造血细胞定居、增殖、分泌和发育的场所.在血液肿瘤发生、发展的过程中,不仅会有造血细胞的恶变.造血微环境也会出现异常.本文就造血微环境与血液系统肿瘤耐药的关系作一综述.
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肿瘤微环境与非霍奇金淋巴瘤
对非霍奇金淋巴瘤而言,缺乏合适的肿瘤微环境,使人们难以在连续的细胞培养中或异种移植动物身上种植出肿瘤细胞.现今已有诸多研究阐明微环境对淋巴瘤细胞生长和生存的重要性:非霍奇金淋巴瘤细胞,包括淋巴瘤干细胞生活在特定的微环境中,该环境中各种非恶性辅助细胞及细胞因子对淋巴瘤的形成与发展有积极的推动作用和预后意义.阻断淋巴瘤细胞和微环境间的相互作用可能成为治疗非霍奇金淋巴瘤的新策略.本文将对肿瘤微环境与非霍奇金淋巴瘤的研究进展进行综述,包括淋巴瘤微环境的细胞种类,间充质干细胞和基质细胞,T细胞亚群的辅助作用,巨噬细胞及树突状细胞,细胞因子和免疫监测等.
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造血微环境和骨髓增生异常综合征
骨髓增生异常综合征(MDS)是一种骨髓衰竭性疾病.骨髓微环境主要包括骨髓基质细胞、生长因子和细胞因子.支持造血的骨髓基质细胞包括间充质干细胞、成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞等,而脂肪细胞发挥抑制造血作用.近期研究发现,骨髓微环境的异常参与了MDS的发病和疾病进展.本文就MDS骨髓微环境异常作一综述.
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人胚AGM区造血干/祖细胞的分离及其在含AGM区基质细胞体系中的培养
本研究分离人胚主动脉-性腺-中肾(AGM)区遣血干/祖细胞(HSPC)并在含人AGM区基质细胞的培养体系中进行培养,以了解人AGM区基质细胞对HSPC的作用.以免疫组织化学方法检测人胎龄28-45天胚胎AGM区细胞CD34、Flk-1、VEGF的表达;分离AGM来源的HSPC,通过直接接种和经Transwell非直接接触两种方法接种于含人AGM区基质细胞系(hAGMS3和hAGMS4)饲养层的培养体系,观察HSPC生长情况和卵石区形成细胞(cobblestone area-forming cells,CAFC)并计数卵石区(cobblastone area,CA);用间接免疫荧光方法检测培养体系中悬浮细胞和CAFC的CD34、Flk-1表达;收获细胞进行半固体造血集落培养以检测两种培养方法对AGM-HSPC的集落形成能力影响.结果表明:人AGM区造血细胞表达CD34和Flk-1.两种接种方法均显示有CFC形成.直接接触培养能形成CD34和Flk-1双阳性的CAFC,集落总数明显高于非接触培养(hAGMS3体系:1 647±194 vs 389±31,P＜0.05;hAGMS4体系:1 586±75 vs 432±35,P＜0.05).结论:1人胚AGM区含有CD34+Flk-1+的HSC.2首次建立含人胚AGM基质细胞的AGM-HSPC培养体系,直接接触培养和非直接接触培养均能促进AGM-HSC的生长,AGM基质细胞与HSC直接接触发挥重要作用.
关键词： 永久造血 主动脉-性腺-中肾区 造血干细胞 基质细胞 卵石区形成细胞 -
小鼠胚胎AGM区永生化MSC样基质细胞的分离及其生物学特征
为了探讨小鼠胚胎主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区基质微环境对胚胎造血的作用,分离鉴定小鼠背主动脉(dorsal aorta,DA)来源间充质干细胞样基质细胞(mesenchymal stem cell like stromal cells,MSC like stromal cells)并研究其生长特性、表面标志和间质分化能力.取E11.5小鼠胚胎,分离获得DA区细胞,转染质粒pSV3neo-SV40,筛选具有G418抗性的阳性细胞,挑取成纤维样细胞,传代培养并检测其增殖能力,应用流式细胞术检测相关表面标志,诱导其向脂肪、成骨和成软骨细胞分化.结果表明:筛选获得的20个细胞克隆多为成纤维样细胞.mDAF3和mDAF18可在体外传代50代以上,稳定表达G418抗性,细胞倍增时间约为24小时,具有向成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞分化的能力,流式细胞术检测结果显示其表达CD29、CD44、CD105、Sca-1,弱表达CD34,CD45和CD31.结论:永生化的mDAF3和mDAF18具有MSC的表型特征和分化功能,提示小鼠胚胎DA区可能存在MSC,小鼠胚胎DA区MSC样基质细胞可为研究基质微环境对胚胎造血发育的调控作用提供支持细胞.
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人胚胎造血的AGM区基质细胞基因表达谱分析
为了筛选在主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞中差异表达的基因,以药物流产的孕30-35天的人胚胎AGM区来源基质细胞为"实验方",以源自意外而致流产的孕4-5月的水囊引产的胎儿肝组织的基质细胞为"驱动方",建立了在人AGM区基质细胞中差异表达基因的消减杂交文库.进一步用基因芯片技术对所建立的抑制消减杂交文库进行筛选,并挑选其中明显差异表达的18个克隆进行序列测定和同源性分析.结果表明: 在所构建的AGM抑制消减杂交文库中,经过PCR鉴定有特异性扩增带且扩增带分子量在200-700 bp的克隆有211个,阳性率高达76.4%.经过基因芯片筛选,挑选出ratio值大于5的克隆共18个进行序列测定显示,在测序的18个明显差异表达的阳性克隆中,4个为未知基因,14个为已知基因,其中这些已知基因分别参与了细胞迁移、分化、生长、细胞周期、信号转导及血管发生等细胞重要生命过程. 这些基因大多数在胚胎分化造血发育中的作用尚未见报道. 结论筛选AGM区基质细胞中差异表达的基因为进一步研究胚胎造血发育的分化调控的分子机理提供了必要的理论基础.
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BMP-4在人AGM区基质细胞的表达
本研究旨在观察BMP-4在人胚胎主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞的表达,为建立含AGM区基质细胞的诱导胚胎干细胞造血分化培养体系提供理论和实验依据.体外传代培养人胚胎AGM区基质细胞(hAGM S1-S5)及取自同期胚胎的躯干成纤维细胞(hFT),采用RT-PCR方法在mRNA水平分析BMP-4在hAGM S1-S5的表达情况,并应用ELISA方法测定BMP-4在hAGM S1-S5细胞培养上清液中的分泌水平,同时以hFT细胞作为对照.结果表明:体外培养中的hAGM S1-S5细胞形态学表现主要为成纤维间质细胞样,少量呈内皮样,是早期胚胎AGM区来源的异质细胞群.hAGM S1-S5细胞均表达BMP-4 mRNA,hFT不表达BMP-4 mRNA.hAGMS1-S5细胞培养上清液中可测得分泌的BMP-4,其分泌水平(pg/ml)分别为55.98±11.20、61.16±9.39、76.26±11.31、86.38±18.34、85.39±21.22,与hFT对照组(16.76±7.04 pg/ml)相比有显著性差异(p＜0.05),hAGM S1-S5组间比较BMP-4水平无显著性差异(p＞0.05).结论:体外培养中的人AGM区基质细胞表达BMP-4,与AGM区基质细胞支持造血干细胞原始发生的功能相关.
关键词： BMP-4 主动脉-性腺-中肾区 基质细胞 -
基质细胞对体外扩增造血细胞造血重建活性的促进作用
本研究探讨骨髓单个核细胞(BMMNC)在不同的培养条件下扩增后是否具有造血重建的活性.在小鼠BMMNC液体培养体系中,分别在含有几种细胞因子组合和(或)基质细胞层存在的条件下进行体外扩增,然后将不同条件下扩增的细胞经尾静脉回输至经致死量照射的小鼠体内,动态观察小鼠的骨髓有核细胞数及各种祖细胞集落数,以观察其造血重建的效果.结果表明:单纯细胞因子介导BMMNC体外扩增后并不能增进这些细胞的造血重建功能,但含有骨髓基质细胞底层的体外扩增,无论是否加入细胞因子,均有明显的促进移植受体造血功能重建的作用.结论:骨髓基质细胞支持下体外扩增的造血细胞具有促进移植受者造血重建的功能,证实了在维持体外扩增造血细胞的移植活性中,基质细胞具有非常重要的作用.
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人AGM区基质细胞对脐血LTC-IC的支持作用
为探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐血长期培养启动细胞(LTC-IC)的造血支持作用,建立了人AGM区基质细胞与脐血CD34+细胞体外长期共培养体系.采用免疫磁珠方法分离人脐血CD34+细胞,接种于已制备好人AGM区基质细胞(hAGMS1-S5)饲养层的24孔板中共培养,同时设无饲养层组作为对照,分别于共培养5、6、7、8周时收获细胞行造血细胞集落培养,并采用极限稀释法(LDA)检测与人AGM区基质细胞共培养后的脐血CD34+细胞的LTC-IC含量.结果表明,无饲养层的对照组培养5周后不再产生造血细胞集落,而以hAGMS1-S5作为饲养层,共培养5周后造血细胞仍具有集落形成能力.hAGMS1-S5维持LTC-IC的作用组间比较有显著性差异(P＜0.05),其中以hAGMS3与S4组支持作用强.LDA检测结果显示,hAGMS3和S4维持LTC-IC的能力无显著性差异(P＞0.05);与hAGMS3和S4共培养14天后脐血CD34+细胞中的LTC-IC扩增,分别是达到(176±46)%、(187±52)%,S3和S4两组间比较无显著性差异(P＞0.05).结论:人AGM区基质细胞S1-S5对脐血LTC-IC具有维持作用,特别是hAGMS3和S4两株细胞对脐血LTC-IC具有更好的维持及扩增作用.
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体外培养的人AGM区基质细胞表达多种造血生长因子
本研究检测人胚胎主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞表达的造血生长因子,为探讨AGM区基质细胞在胚胎造血发生中的作用及其造血支持作用提供基础资料.采用RT-PCR方法在mRNA水平分析IL-6、SCF、Flt3-L、OSM、IL-3、TPO、M-CSF、LIF等因子在人AGM区基质细胞(hAGMS1-S5)的表达情况,应用ELISA法测定IL-6、SCF、Flt3-L在hAGMS1-S5细胞培养上清液中的分泌水平,并将脐血CD34+细胞与hAGMS1-S5饲养层细胞共培养14天后行造血细胞集落培养以进一步检测人AGM区基质细胞的造血支持作用.结果表明:hAGMS1-S5均表达IL-6、SCF、Flt3-L、OSM等造血生长因子mRNA,不表达IL-3、TPO、M-CSF、LIF等因子mRNA.在hAGMS1-S5细胞培养上清液中可测得分泌的SCF、Flt3-L、IL-5等因子,hAGMS1-S5组间比较各因子水平无显著性差异(P＞0.05).集落培养结果表明,hAGMS1-S5对CFU-GM、BFU-E、CFU-Mix均有不同程度的扩增作用,hAGMS1-S5的造血支持作用组间比较亦显示有显著性差异(P＜0.05),其中hAGMS3、S4优于S1、S2及S5.结论:人AGM区基质细胞表达SCF、Flt3-L、IL-5、OSM等多种造血生长因子,这可能与AGM区基质细胞支持造血细胞原始发生和体外维持造血干细胞功能相关.
关键词： 主动脉-性腺-中肾区 基质细胞 造血生长因子 -
重组人血小板生成素对体外培养基质细胞的影响
本研究观察rhTPO有无促进骨髓纤维化的作用.用改良Dexter 培养法进行体外不同浓度rhTPO作用下的基质细胞培养,在培养的不同时间用MTT法检测细胞增殖活性,用光学显微镜和扫描电子显微镜观察细胞形态变化,用细胞化学方法观察细胞ALP、PAS、AS-D NCE及纤维染色的变化,用免疫组织化学方法检测纤维连接蛋白,及层黏蛋白和Ⅳ型胶原的变化,用流式细胞术检测细胞表面抗原.结果表明:rhTPO可刺激基质细胞增殖,且随浓度增加而增高;细胞增殖活性随浓度增加而增强,但不随作用时间延长而增加;培养第3天,各组细胞明显贴壁,细胞呈椭圆形,第7天可见散在分布的梭形细胞,第12-14天,细胞排列呈一定的方向性,似漩涡状,细胞为长梭形,70%-80%的瓶底被细胞覆盖.第16-18天细胞覆盖达90%以上,细胞形态均为螺旋状排列的长梭形,类似成纤维细胞形态,瑞氏-姬姆萨染色显微镜下观察主要为成纤维细胞,还有极小部分巨噬细胞,内皮细胞和脂肪细胞,对照组与实验组之间无明显差异.培养14-42天的贴壁细胞,PAS显示为阳性,ALP染色和氯醋酸AS-D萘酚酯酶染色显示为弱阳性,对照组与实验组之间无明显差异;用Masson氏三色和Gomori染色法染色,胶原纤维和网状纤维显示均为阴性;纤维连接蛋白,层黏蛋白和Ⅳ型胶原染色在对照组与实验组均显示为阳性,但实验组阳性均似稍强,这种阳性并没有随着培养时间的延长而增强;在扫描电镜下观察到随着培养时间延长,细胞表面的绒毛、纤维从无到有,细胞从单层到多层,并逐渐出现新生成的纤维细胞,但对照组与实验各组之间未见明显差异;rhTPO 对CD34、CD45、CD105、CD106、CD166的表达无明显影响.结论:rhTPO不影响基质细胞的组织化学特性,纤维染色和扫描电镜观察也未发现有促进纤维生成的现象,但能增强基质细胞表达纤维连接蛋白,层黏蛋白和Ⅳ型胶原.因此,仍然有必要对临床多次使用rhTPO的病人进行长期跟踪随访.
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含人AGM区基质细胞对小鼠胚胎干细胞诱导体外分化为造血干/祖细胞的作用
为探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对小鼠胚胎千细胞(embryonic stem cells,ESC)体外诱导分化为造血干细胞(HSC)的影响及其作用机制,将小鼠E14 ESC诱导为拟胚体(EB),收获的EB细胞以Tran-swell非接触共培养体系分别在人AGM区、胎肝(FL)或骨髓(BM)基质细胞饲养层上进一步诱导分化,分为EB对照、AGM诱导、FL诱导、BM诱导、AGM + FL诱导和AGM + BM诱导共6组.分别收获各组EB来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+ c-Kit+细胞含量,并进行各系造血细胞集落形成单位(CFU)分析.结果显示:经不同基质细胞饲养层诱导后EB来源细胞中Sca-1+ c-Kit+细胞比例均较诱导前明显升高(p<0.01),AGM+FL诱导组为(21.96±2.54)%,显著优于其它诱导组(p<0.01),AGM+BM诱导组阳性细胞比例亦较单纯BM诱导组明显增加(p<0.O1);EB对照组造血集落产率明显低于其它诱导组,AGM+FL、AGM+BM诱导组集落产率较高,尤以AGM+FL诱导组佳(p<0.01).结论:人AGM区基质细胞有助于维持一定的原始HSC数目及高增殖潜能,在AGM区基质细胞诱导基础上可明显提高FL或BM基质细胞对ESC源性原始HSC的进一步扩增作用.
关键词： 主动脉-性腺-中肾区 基质细胞 胚胎干细胞 造血干细胞
