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产前诊断技术的研究进展
产前诊断是优生优育和预防缺陷儿出生的重要手段.它是在遗传咨询的基础上,应用现代生物学、生物化学、免疫遗传学、细胞遗传学、分子遗传学等技术,通过母体检查或对胚胎(胎儿)直接检测,了解胎儿在子宫内的生长发育状况,诊断胎儿是否有遗传缺陷及先天畸形.本文就各种产前诊断方法、新技术、存在的不足与困难、以及发展前景综述如下.
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乳腺癌易感基因BRCA1/BRCA2突变的植入前遗传学诊断研究进展
植入前遗传学诊断(PGD)是阻断遗传性疾病垂直传播的一种稳定而有效的孕前检查技术.近年来,随着这一技术的广泛应用,PGD指征正逐步扩展到遗传性癌症相关基因的植入前基因筛查.人类乳腺癌易感基因(BRRCA1/2)是目前已知的乳腺癌高外显率易感基因,且BRCA1/2基因突变与家族性乳腺癌发病关系为密切.目前,针对遗传性乳腺癌的个性化PGD已经证实可行.该综述回顾了乳腺癌易感基因植入前遗传学诊断技术的研究进展,为临床实践植入前遗传学诊断方案制定提供一定的思路.
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G6PD缺乏症单细胞SNaPshot基因诊断方法的建立
目的 建立有效可行的葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症单细胞基因诊断技术. 方法 获取正常人及G6PD基因突变杂合子的单个淋巴细胞,采用多重巢式PCR结合多重SNaPshot技术对G6PD基因突变高发的四个外显子上的12个突变位点进行基因诊断. 结果 共检测了58个正常和108个杂合子单淋巴细胞,扩增效率为90.97％,等位基因脱扣率为8.08％. 结论 所建立的多重巢式PCR结合SNaPshot技术可在单细胞水平上快速、准确地检测12个G6PD基因突变位点,可望在临床上实现G6PD缺乏症的植入前遗传学诊断.
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应用全基因组扩增技术对α地中海贫血进行植入前遗传学诊断的效果分析
目的 研究α地中海贫血患者囊胚活检后先进行全基因组扩增后再应用荧光PCR进行诊断的效果. 方法 回顾分析本中心2015年1月至2016年11月α地中海贫血PGD周期资料,共139个周期,对比分析卵裂球活检后直接应用荧光PCR进行诊断(诊断方法一)与囊胚活检后先进行全基因组扩增后再应用荧光PCR进行诊断(诊断方法二)的结果. 结果 两组在女方年龄、获卵数、正常受精数均无统计学差异(P＞0.05),但方法二(7.61±3.05)的平均活检个数显著小于方法-(9.48±3.66) (P＜0.05).两种方法的正常胚胎率(35.22％ vs.25.87％)、杂合子胚胎率(30.11％ vs.50.19％)、异常胚胎率(30.11％ vs.23.94％)、诊断失败率(16.21％ vs.2.81％)有统计学差异(P＜0.05),临床妊娠率(50.00％ vs.52.17％)无统计学差异(P＞0.05). 结论 囊胚活检后先进行全基因组扩增后再应用荧光PCR进行诊断的效果明显好于卵裂球活检后直接应用荧光PCR进行诊断.
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植入前遗传学诊断中心与其它中心合作模式的初步探讨
目的 研究植入前遗传学诊断(PGD)中心接收外送标本进行诊断模式的可行性. 方法 回顾性对比分析外接标本与本中心同期地中海贫血PGD周期的诊断结果. 结果 外接标本与本中心的a地中海贫血和β地中海贫血患者的胚胎实验室指标无统计学差异(P＞0.05).外接标本a地中海贫血患者的正常胚胎率、杂合子胚胎率、异常胚胎率、诊断失败率分别为27.92％、35.10％、36.98％、16.93％,本中心α地中海贫血患者的正常胚胎率、杂合子胚胎率、异常胚胎率、诊断失败率分别为27.10％、38.01％、34.89％、14.63％,两组间比较无显著性差异(P＞0.05);外接标本p地中海贫血患者的正常胚胎率、杂合子胚胎率、异常胚胎率、诊断失败率分别为30.48％、44.28％、25.24％、9.87％,本中心p地中海贫血患者的正常胚胎率、杂合子胚胎率、异常胚胎率、诊断失败率分别为25.71％、46.43％、27.86％、7.28％,两组间比较亦无显著性差异(P＞0.05). 结论 外接标本经过当地生殖中心的处理,运输至我中心检测不会显著影响诊断结果,PGD诊断中心接收外送标本进行合作的模式是可行的.
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联合SNaPshot和单倍型分析技术建立G6PD缺乏症单细胞基因诊断体系
目的 建立可有效监测污染和等位基因脱扣(allele dropout,ADO)的可靠的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症单细胞基因诊断体系. 方法 获取正常G6PD基因型个体及G6PD基因突变杂合子的单个淋巴细胞,在全基因组扩增(whole genome amplification,WGA)的基础上,应用多重SNaPshot技术检测25个已报道的中国人群G6PD基因突变位点,同时联合针对Xq28上6个短串联重复序列(short tandem repeat,STR)位点的单倍型分析技术辅助分析结果. 结果 共检测60个正常和96个杂合子单淋巴细胞,WGA扩增效率为94.23％,成功扩增的WGA产物在后续基因检测的总扩增效率和总ADO率分别为89.37％和13.74％;8个基因位点的扩增效率和ADO率均有统计学差异(P总＜0.05);发生G6PD基因ADO的15例G6PD杂合子单淋巴细胞中,均未同时出现6个STR位点全部扩增失败或ADO现象;所有样本的STR位点检测结果除目的片段的信号峰外,均未出现其他峰信号. 结论 联合SNaPshot和单倍体分型技术所建立的单细胞G6PD基因诊断体系,在G6PD基因分型的同时,还可提示是否存在污染或ADO,大程度保证诊断结果的可靠性,减少误诊率,可望取代传统的性别选择,实现真正意义上的G6PD缺乏症植入前遗传学诊断.
关键词： 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 植入前遗传学诊断 全基因组扩增 单倍型分析 等位基因脱扣 -
胚胎自我修复
人类早期胚胎存在较高比例的染色体异常现象[1].近年来,随着检测技术的不断进步,人们对胚胎染色体异常的认识也在逐步加深.2005年先后有报道[2,3],染色体异常的早期胚胎可发生部分或全部胚胎细胞的自我修复,但自我修复率及其相关机制尚未明确.以下就这方面的研究进展进行综述.
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高通量基因测序植入前胚胎遗传学诊断和筛查技术规范(试行)
高通量基因测序技术的迅猛发展,极大地拓宽了人类胚胎植入前遗传学诊断/筛查(PGD/PGS)的适用范畴,提高了PGD/PGS的准确性.为了更规范地使用高通量基因测序技术进行PGD/PGS,中华医学会生殖医学分会制定此规范,以明确开展本项技术的基本条件、组织管理、临床流程与质量控制等方面的基本要求.
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FISH技术在诊断唐氏综合征及植入前遗传学诊断中的临床应用
目的:探讨优化现有荧光原位杂交(FISH)技术用于产前诊断唐氏综合征及其单细胞植人前遗传学诊断(PGD)的临床应用价值.方法:应用21号和X染色体特异性荧光素标记的双色混合探针对正常人体标本和25例唐氏综合征患儿外周血以及10例血清筛查阳性孕妇羊水进行FISH分析,同步进行羊水细胞培养,行常规细胞染色体核型分析,并以核型分析结果为金标准,建立一套稳定的FISH方法.在常规体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术方法基础上,用该方法分别对13例未受精卵、卵裂球进行唐氏综合征遗传学诊断.结果:正常羊水间期细胞和拟诊唐氏综合征羊水间期细胞经FISH分析,结果与染色体核型分析的结果一致,符合率100%.结论:建立的FISH方法具有快速、简便、准确性高、特异性强的特点,是快速进行产前唐氏综合征筛查及扩大PGD技术应用的简易可靠技术,有很好的临床应用价值.
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单细胞五重巢式PCR检测DMD基因
目的:探索建立单细胞多重巢式PCR检测杜氏肌营养不良症(DMD)基因外显子17、19、44、45、48的技术,及应用于植入前遗传学诊断(PGD)的前景.方法:获取正常男性单个淋巴细胞和无DMD家族史的单个胚胎细胞,行DMD基因外显子17、19、44、45、48的五重巢式PCR,分析扩增成功率、假阳性率和假阴性率.结果:20个单个淋巴细胞5个外显子扩增成功率为97%(97/100)、假阳性率为4%(1/25)、假阴性率为0%(0/25),20个单个胚胎细胞5个外显子扩增成功率为80%(80/100)、假阳性率为0%(0/25).结论:本文建立的单细胞DMD基因外显子17、19、44、45、48的五重巢式PCR技术具有较高扩增成功率和特异性,应用于DMD的PGD具有现实的可能性.
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早期鼠胚简化双针取样法
为建立早期胚胎活检的动物模型,以安全高效地开展人类的植入前遗传学诊断,应用显微操作技术,对发育到8细胞期的小鼠胚胎进行了透明带溶洞吸取单个卵裂球的研究.结果表明:简化组的胚胎活检时间显著缩短,而胚胎完整率及单个卵裂球的完整率与传统组无明显差别.对照和两实验组胚胎在体外培养过程中均出现不同程度的胚胎发育延迟现象.活检后胚胎桑椹胚的发育率较对照组显著降低,但三组胚胎的出生率和生后三周仔鼠的体重无显著性差别,提示简化组的胚胎活检是安全而高效的,因而为开展人类的早期胚胎活检提供了方法学的参考.
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Array-CGH技术在胚胎植入前遗传学诊断中的应用进展
微阵列比较基因组杂交（aCGH）作为一种新兴的高通量检测技术，给分子生物学及医学研究带来了巨大变化，因其检测范围覆盖全基因组、高效率、操作简便等特点，在人类遗传疾病诊断，肿瘤基因组学，系统生物学研究及产前诊断中已有了广泛应用。植入前遗传学诊断（PGD）是辅助生殖技术的重要组成部分，随着分子遗传学技术的发展，其应用范围也不断拓宽。基于aCGH技术在PGD中对胚胎全染色体组非整倍体及结构异常的筛查，PGD/植入前遗传学筛查（PGS）胚胎植入率和临床妊娠率均有显著提高，本文就aCGH技术在胚胎植入前遗传学诊断中的应用进行综述。
关键词： 微阵列比较基因组杂交 植入前遗传学诊断 辅助生殖技术 -
反复种植失败患者经植入前遗传学筛查获妊娠的研究
目的：通过微阵列比较基因组杂交技术进行胚胎植入前遗传学筛查（PGS）使反复种植失败夫妇获得后代。方法1例继发性不孕、慢性输卵管炎患者经常规体外受精和胚胎移植（IVF-ET）治疗3个周期均未获妊娠。夫妇双方检查染色体核型正常。本周期对卵母细胞质内单精子注射（ICSI）受精后第5天（D5）或第6天（D6），选择适宜活检的囊胚进行活检，每个囊胚取出3～5个胚胎滋养层细胞。经细胞裂解及全基因组扩增后，对扩增产物进行荧光标记，与微阵列比较基因组芯片进行杂交（aCGH），并对杂交后的芯片进行扫描和结果分析。终选择整倍体的平衡胚胎进行移植。结果经控制性促排卵后获卵24个，成熟24个，ICSI后正常受精14个，有13个正常受精卵发生卵裂，D5接受胚胎活检的囊胚有2个，D6接受活检的囊胚有2个。活检后胚胎均行玻璃化冷冻超低温保存。aCGH检查显示平衡的整倍体胚胎共2个，其中1枚为D5胚胎，另1枚为D6胚胎。活检后3个月行胚胎解冻移植，移植1枚D6胚胎。移植后第14天患者尿人体绒毛膜促性腺激素（HCG）示阳性，移植后第35天经阴道超声见1个孕囊并可见胚芽及原始心管搏动，为单胎妊娠。结论反复种植失败患者可通过植入前遗传学筛查获得临床妊娠。
关键词： 植入前遗传学筛查 植入前遗传学诊断 微阵列比较基因组杂交 反复种植失败 -
植入前遗传学诊断和筛查的新进展
植入前遗传学检测发展早期受技术局限性以及伦理等问题影响，发展缓慢。近年来，随着人类胚胎学和人类基因组学的快速发展，一系列诸如囊胚活检，玻璃化冻存，芯片检测技术以及第二代测序等高新技术的应用，很大程度上解决了早期限制其应用的各种问题，为其应用和推广打开了崭新的局面，但同时又带来新的问题。本文从胚胎学家的视角回顾了植入前遗传学检测的历史，发展过程中涉及的关键因素以及新技术应用可能带来的影响及局限性。
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优化现有荧光原位杂交技术用于产前诊断唐氏综合征及其单细胞植入前遗传学诊断的临床应用
目的：深入探讨优化现有荧光原位杂交技术用于产前诊断唐氏综合征及其单细胞植入前遗传学诊断的临床效果。方法借助21号和X染色体特异性荧光标记的双色混合探针对20例唐氏综合征患儿外周血、10例血清筛查阳性孕妇羊水和正常人体标本进行优化现有荧光原位杂交技术（FISH）分析。结果拟诊唐氏综合征羊水间期细胞和正常羊水间期细胞经FISH分析，结果与染色体核型分析一致。结论 FISH具有操作方便、快速、准确性高的优势，可将其作用于临床上关于产前唐氏综合征筛查及单细胞植入前遗传学诊断，具有较高的临床价值。
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男性不育与现代辅助生殖技术
辅助生殖技术概述辅助生殖技术是指运用医学技术和方法对配子、合子、胚胎进行人工操作,以达到受孕目的的技术.辅助生殖技术包括人工授精、体外受精-胚胎移植及各种衍生技术.1890年,人工授精首次被应用于临床.直至1907年,辅助生殖技术临床研究与基础研究工作才逐步深入开展起来.1978年,世界第一例体外受精婴儿Louise Brown在英国奥姆德总医院诞生,从此开启了辅助生殖技术新时代.时隔10年,我国大陆第一例试管婴儿诞生.目前,配子移植技术、显微镜下透明带钻孔技术、透明带部分切除、透明带下受精和单精子卵细胞浆内注射、配子和胚胎冻融技术、植入前遗传学诊断等技术也逐渐成熟并广泛应用于临床.
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胚胎植入前遗传学诊断的新进展
胚胎植入前的遗传学检测包括植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)和植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening,PGS).PGD已在临床辅助生殖中应用20余年,其主要适应证为单基因疾病和遗传性染色体异常.PGS则是应用与PGD相同的技术,对植入前的胚胎进行染色体非整倍性的检测,选择佳的胚胎予以移植,其适用于高龄(＞35岁)、既往非整倍体妊娠、反复体外受精(IVF)失败、反复流产、严重的男性不育等因素导致的不孕不育.PGD有关的分析技术正日新月异地发展,微阵列比较基因组杂交技术、单核苷酸多态性微阵列技术等微阵列技术以及新一代测序技术已用于临床,卵裂球全基因组测序也即将成为可能.综述该领域的进展以及PGD/PGS的争议问题.
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实时荧光定量PCR技术及在植入前遗传学诊断中应用
实时荧光定量聚合酶链反应技术是一种基于荧光共振能量转移原理进行核酸定量的新型技术,常用荧光检测系统主要包括SYBR Green Ⅰ染料、Taqman探针、分子信标探针、蝎子引物探针、杂交探针、LUXTM引物、Amplisensor探针等.目前该技术已成功应用于胚胎植入前遗传学诊断的性别鉴定、基因型分析、基因突变检测和基因表达研究等方面,具有潜在的应用价值.
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流式细胞仪在辅助生殖技术中的应用
流式细胞术是20世纪70年代发展起来的单细胞检测和分离技术,因其效果确切可靠,已广泛应用于医学、生物学的各个领域.辅助生殖技术中X、Y精子的分离技术可以用于预防性连锁遗传疾病,而精子的检测则可以明确不孕症的诊断,预测精子的受精能力,为选择正确的助孕方法提供依据.因而使用流式细胞仪(FCM)分离和检测人精子有重要的意义.现对FCM在生殖医学中X、Y精子分离和检测的应用作如下综述.
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多重置换扩增技术在植入前遗传学诊断中的应用
多重置换扩增技术(MDA)是基于环状滚动扩增的全基因组扩增技术,具有高扩增效率和高保真性等特点.尽管用于单细胞扩增时存在某些缺陷,但其在胚胎植入前遗传学诊断(PGD)实验研究和临床应用中仍取得巨大进展.MDA联合常规PCR技术已成功用于PGD的临床诊断,实现了单次胚胎活检、单个胚胎细胞的性别、部分单基因病的同步诊断.
