首页 > 文献资料
-
构建特发性脊柱侧弯椎间盘终板抑制消减cDNA文库的方法和意义
目的:构建青少年特发性脊柱侧弯椎间盘终板抑制消减cDNA文库,以研究特发性脊柱侧弯的基因表达变化间的内在联系及规律.方法:从来源于一位特发性脊柱侧弯患者顶椎椎间盘终板凸凹侧软骨组织分离poly(A)+RNA,经反转录后,利用抑制消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库.结果:挑取300个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示其中248个克隆有插入片段,片段大小范围为250～750pb.结论:应用消减杂交的方法,再经适当的改进,在去除相同遗传背景的条件下,可以建立较特异性脊柱侧弯椎间盘终板cDNA消减文库,该文库为进一步批量筛选特发性脊柱侧弯发生的相关基因群并克隆特发性脊柱侧弯相关表达基因,研究其特发性脊柱侧弯发生的分子机理与生物学特性间的关系奠定了基础.
-
应用抑制消减杂交和cDNA芯片技术筛选流行性感冒病毒感染相关基因
病毒基因组有限的编码能力和以病毒蛋白为靶的抗病毒药物易出现耐药性,使从病毒感染宿主筛选病毒感染相关生物大分子作为抗病毒药靶和诊断标志物成为新的研究方向.为了筛选流行性感冒(流感)病毒感染相关基因,采用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,以流感病毒A/鲁防/93-9(H3N2)感染的MDCK细胞及正常MDCK细胞为材料,构建病毒感染特异性差减cDNA文库.从文库中随机挑取约800个克隆,PCR扩增其中插入片段,经纯化、紫外定量后,用基因芯片自动点样仪点在氨基片上,制备cDNA芯片.将流感病毒感染的MDCK细胞和正常MDCK细胞的总RNA分别用Cy3、Cy5反转录荧光标记后,与cDNA芯片杂交,用芯片扫描仪扫描获得芯片杂交信号,经阳性对照校正和归一化处理后,以如下条件作为判定基因差异表达的标准;(a)Cy3与Cy5的信号比值大于1.5(正常细胞用Cy5标记)或小于0.67(正常细胞用Cy3标记);(b)Cy3和Cy5信号值之一必须大于1 000.经cDNA芯片筛选获得了18个流感病毒感染特异性克隆,经测序和生物信息学分析发现均为流感病毒感染相关新基因EST.流感病毒感染相关基因cDNA片段的获得,为新型病毒药靶诊断标志物发现和功能研究提供了基础.
-
单眼视网膜摘除鸽视盖差异表达基因的筛选
目的筛选单眼剥夺鸽视盖差异表达的基因. 方法采用抑制消减杂交技术构建左侧视网膜剥夺后左视盖基因差异表达的文库,对部分重组克隆进行序列分析,反Northern进一步去除假阳性. 结果随机测序150个表达序列标签,16个表达序列标签经反Northern证实为真阳性,包括与基因库已知基因同源的及未发现明确的同源序列,138个基因片段已申请序列号. 结论视盖差异表达基因的研究为深入研究视觉发育、视中枢的分子构筑提供有益的线索.
-
人胚胎造血的AGM区基质细胞基因表达谱分析
为了筛选在主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞中差异表达的基因,以药物流产的孕30-35天的人胚胎AGM区来源基质细胞为"实验方",以源自意外而致流产的孕4-5月的水囊引产的胎儿肝组织的基质细胞为"驱动方",建立了在人AGM区基质细胞中差异表达基因的消减杂交文库.进一步用基因芯片技术对所建立的抑制消减杂交文库进行筛选,并挑选其中明显差异表达的18个克隆进行序列测定和同源性分析.结果表明: 在所构建的AGM抑制消减杂交文库中,经过PCR鉴定有特异性扩增带且扩增带分子量在200-700 bp的克隆有211个,阳性率高达76.4%.经过基因芯片筛选,挑选出ratio值大于5的克隆共18个进行序列测定显示,在测序的18个明显差异表达的阳性克隆中,4个为未知基因,14个为已知基因,其中这些已知基因分别参与了细胞迁移、分化、生长、细胞周期、信号转导及血管发生等细胞重要生命过程. 这些基因大多数在胚胎分化造血发育中的作用尚未见报道. 结论筛选AGM区基质细胞中差异表达的基因为进一步研究胚胎造血发育的分化调控的分子机理提供了必要的理论基础.
-
伤寒活疫苗Ty21a免疫相关新基因的克隆及其组织分布
粘膜免疫在机体的免疫防御系统中起着重要的作用.寻找粘膜免疫防御相关的分子,对于揭示粘膜免疫的规律具有重要的意义.在通过抑制消减杂交,建立cDNA消减文库的过程中,发现了几条在Ty21a免疫后基因表达发生改变的新的ESTs.为了揭示这些ESTs对应的基因在粘膜免疫中的作用,我们利用RACE-PCR技术扩增了其中1条EST对应基因的全长.
-
利用抑制消减杂交技术研究钩端螺旋体致病相关基因
目的利用抑制消减杂交技术(SSH), 比较致病与非致病钩端螺旋体(简称钩体)之间基因组差异,筛选致病钩体特有的基因片段. 方法以赖型017株为tester,非致病性patocⅠ株为driver,选择合适的四碱基内切酶将基因组酶切,连接特殊设计的adaptor进行消减杂交和PCR,得到消减混合物,与T/A克隆载体连接,转化JM109建立差异消减文库,经PCR和Southern blot筛选鉴定阳性克隆,进而对部分片段进行测序和同源分析. 结果 AluⅠ适于将钩体酶切成用于SSH技术的小片段; 经SSH筛选鉴定得到30个片段大小为200～1?300bp的阳性克隆, 部分已测序的片段中1个与硫胺素合成蛋白高度同源,4个与GenBank无明显同源性,可能为赖型致病钩体所特有而非致病钩体缺失的基因片段,已被GenBank收录,收录号分别为 AF300873～300877. 结论 SSH是一种有效、灵敏、高特异的比较分析基因组差异的方法,对钩端螺旋体致病基因的筛选、基因组分化、分子遗传研究等具有重要意义.
-
人胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建
目的应用抑制消减杂交技术(SSH)构建胰腺癌和正常胰腺组织间差异表达的抑制消减cDNA文库.方法分别提取胰腺癌(tester)和癌旁正常胰腺组织(driver)中的总RNA和mRNA,合成双链cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将胰腺癌双链cDNA分为两组,分别加上不同的接头,再与正常胰腺组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,分离出胰腺癌差异表达基因的cDNA片段.将该差异表达片段克隆至T/A载体,并转化大肠杆菌TOP 10F',经蓝白斑筛选后,再用PCR方法筛选阳性克隆,从而构建胰腺癌抑制消减cDNA文库.结果文库扩增后得到257个白色克隆,随机挑取50个阳性克隆进行PCR扩增分析,其中47个克隆有插入片段,克隆阳性率为94%,片段大小主要集中在300～600bp之间.结论成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆胰腺癌特异性表达基因奠定了基础.
-
胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建及质量分析
目的构建人胰腺癌抑制消减cDNA文库.方法从来源于同一标本的胰腺癌和癌旁正常组织分离poly(A)+ RNA,经反转录后,利用抑制消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库.结果挑取500个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示其中 457个克隆有插入片段,片段大小范围为 250～750 pb.结论应用消减杂交的方法,再经适当的改进,在去除相同遗传背景的条件下,可以建立较特异的胰腺癌cDNA消减文库,该文库为进一步批量筛选胰腺癌发生的相关基因群并克隆胰腺癌相关表达基因,研究其胰腺癌发生的分子机理与生物学特性间的关系奠定了基础.
-
利用抑制消减杂交技术研究与支气管哮喘发作有关的嗜酸粒细胞差异表达基因
目的探讨与支气管哮喘(简称哮喘)发作有关的外周血嗜酸粒细胞(EOS)差异表达基因.方法提取哮喘发作期患者外周血EOS总RNA为实验子(tester),治疗缓解期外周血EOS的总RNA为驱动子(driver);应用简单模块架构搜索工具(SMART) cDNA合成方法合成双链互补脱氧核糖核酸(cDNA),利用抑制消减杂交(SSH)技术筛选与哮喘发作有关的差异表达基因,进一步应用Southern 印迹杂交验证差异表达基因.结果共获得编码转化生长因子β活化激酶样蛋白(transformation growth factor β activated kinase like,TAK1L)、环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosate, cGMP)门控通道同源蛋白等12个差异表达基因.结论这些差异表达基因可能涉及EOS促炎症反应、细胞内信号传导、能量代谢及细胞凋亡等多种作用机制.进一步研究这些基因功能将帮助阐明EOS在哮喘发病的分子机制及可能为哮喘药物研究提供新的靶点.
-
Aβ1-40诱导大鼠脑皮质与海马差异表达基因的克隆与鉴定
我们于2001年3～8月以β-淀粉样蛋白1-40(beta-amyloid protein,Aβ1-40)注入脑室建立大鼠AD模型,采用抑制消减杂交(SSH)技术构建Aβ诱导大鼠皮质与海马差异表达的基因文库,旨在探讨Aβ1-40神经元毒性的分子机制.
-
创伤早期伤口液作用真皮多能干细胞差异表达cDNA文库的构建
目的:研究创伤早期伤口液作用前后真皮多能干细胞基因表达的变化,探讨真皮多能干细胞参与创伤修复启动的分子机制.方法:取伤后1d伤口液作为创伤修复启动微环境,刺激真皮多能干细胞,24h后提取总RNA为实验方(tester),未予刺激的真皮多能干细胞总RNA为驱动方(driver).实验方、驱动方总RNA由SMART cDNA方法合成cDNA,然后用抑制消减杂交(SSH)方法获得消减杂交产物.消减杂交产物克隆到T载体构建消减文库.对部分克隆进行杂交筛选及序列比对.结果:消减杂交文库挑取615个克隆进行PCR扩增,阳性率约为97%.取其中48个克隆进行反向Northern杂交,获得5个差异表达基因.经Genebank检索,这些差异表达基因与已知序列有较高同源性,其中大多为与创伤修复相关的基因.结论:我们成功构建了创伤早期伤口液刺激前后大鼠真皮多能干细胞差异表达cDNA文库,并筛选、克隆出部分与真皮多能干细胞参与创伤修复相关的差异表达基因.
-
膀胱移行细胞癌差异表达基因的克隆与鉴定
应用抑制消减杂交(SSH)构建膀胱移行细胞癌差异表达的消减文库,再应用Dot blot方法筛选出差异表达的基因,为研究膀胱癌发生、发展提供实验依据.现报告如下.
-
青少年特发性脊柱侧弯椎间盘终板抑制消减cDNA文库的构建
用抑制消减杂交(SSH)构建组织间差异表达基因的cDNA消减文库,可进一步大批量筛选、克隆特发性脊柱侧弯表达的相关基因.
-
CO对小鼠小脑基因表达的影响
目的 探讨CO对小鼠小脑基因表达的影响.方法 利用差异表达基因克隆技术抑制消减杂交法(suppression subtractive hybridization,SSH),筛选750 mg/m3 CO暴露染毒72 h小鼠小脑差异表达基因.结果 获得了750 mg/m3 CO暴露染毒72 h小鼠小脑差异表达的cDNA片段20个,克隆化后测序.结论 CO主要影响细胞信号和传递﹑代谢﹑精子生成﹑免疫等功能相关的基因表达.
-
离心机训练对大鼠不同组织mRNA表达的影响
目的分析5个与离心机训练有关的基因在大鼠各组织的表达水平及其与训练时间的关系.方法分别提取离心机训练不同时间组大鼠心、脑、肾、肺和肠5种组织的mRNA并进行量化,采用狭线杂交方法,用Dig-11-dUTP标记5个用抑制性消减杂交筛选离心机训练大鼠获得的基因片段作探针,杂交结果通过光密度扫描半定量后,进行统计学处理. 结果未知基因CH157的表达水平在训练6 d时大鼠心脏和脑组织明显下降(P<0.05),训练12 d时有所回升;未知基因CH244的表达水平在大鼠心、脑、肠组织在训练6 d、12 d时均下调,但其表达量个体差异表现突出,不呈现明显的统计学意义;神经元一氧化氮合酶抑制剂 (PIN)基因,随着离心机训练时间的延长,在大鼠心脏和肾脏组织中的表达水平明显上调 (P<0.05);细胞色素b (Cyt b)基因在大鼠心脏、脑组织中表达水平随着训练时间增长而明显上调 (P<0.01),在肾、肺和肠组织中的表达在训练6 d时明显升高(P<0.05),训练12 d时有所恢复;延长因子1-α(EF1-α)基因在大鼠脑组织中表达水平随着训练时间增长而明显上调,在肠组织中的表达在训练6 d时明显升高(P<0.05),训练12 d时恢复到训练前水平.结论 5个基因在离心机训练大鼠不同组织中的表达水平存在差异,且这种差异与离心机训练时间相关.这可能与离心机训练提高抗荷耐力的机制有关.
-
快速老化小鼠海马抑制消减cDNA文库的构建
目的:构建快速老化小鼠(senescence-accelerated mouse, SAM)海马抑制消减cDNA文库.方法:以SAM快速老化亚系SAM-prone/8 (SAMP8)海马作为实验组,抗快速老化小鼠亚系SAM-resistance/1 (SAMR1)海马作为对照组,应用抑制消减杂交(SSH)技术,构建SAMP8海马特异表达cDNA抑制消减文库;用蓝白斑筛选,以PCR鉴定文库质量.结果:构建文库的阳性克隆率为96.18%,克隆中cDNA片段介于250～2?000?bp之间.结论:成功构建了SAMP8海马抑制消减文库.
-
人胃癌抑制消减cDNA文库的构建及文库质量分析
目的：构建人胃癌抑制消减cDNA文库，为进一步大批量筛选、克隆胃癌特异性表达的基因奠定基础。方法：从胃癌和癌旁正常组织分离poly(A)+RNA，经反转录后，利用抑制消减杂交（SSH）方法，通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库。结果与结论：挑取800个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段，结果显示其中750个克隆有插入片段，片段大小范围为250～700 bp。为进一步大批量筛选、克隆胃癌特异性表达的基因奠定了基础。
-
BEP2D细胞恶性转化不同时期差异表达基因的筛选
目的筛选并鉴定α粒子辐射诱发永生化人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化不同时期差异表达的基因.方法抑制消减杂交(SSH),cDNA芯片.结果利用SSH构建了BEP2D细胞3个恶性转化不同时期差异表达基因的文库,BEP2D细胞的文库有416个克隆,R15H20细胞的文库有301个克隆,R15H35细胞的文库有586个克隆,经cDNA Microarray验证发现:BEP2D细胞文库来源的芯片与3代细胞探针杂交后的阳性信号率为90.4%、21.6%和19.7%;R15H20细胞文库来源的芯片的阳性信号率为8.6%、93.8%和31.6%:R15H35细胞文库来源的芯片的阳性信号率为23.5%、18.2%和90.7%.结论联合应用SSH和cDNA Microarray是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速和有效方法;经 cDNA Microarray鉴定出的 3个文库中差异表达的cDNA可能代表了α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化相关的基因.
关键词： α粒子 抑制消减杂交 cDNA芯片 永生化人支气管上皮细胞 -
氡染毒小鼠外周血细胞差异表达基因的筛选与鉴定
目的 在建立氡染毒小鼠模型的基础上,筛选和鉴定氡染毒小鼠外周血细胞差异表达基因.方法 采用HD-3型多功能氡室对BALB/c小鼠动态吸入染毒,建立实验动物模型.按照小鼠吸入氡及其子体的累积剂量分为实验组(累积剂量105 WLM)和对照组(室内本底浓度,1 WLM).采用RNA转录物5'末端启动机制技术(SMART)和抑制性消减杂交技术(SSH)构建正、反向消减cDNA文库,选取含有插入cDNA片段的克隆进行反向Northern杂交筛选上调或下调的阳性克隆.克隆的测序结果进行同源性检索和生物信息学分析.结果 在成功构建了消减cDNA文库基础上,挑取白斑390个,获得312个含有插入片段的单克隆,进行反向Northern杂交,分析基因的上调或下调水平.选取差异表达克隆41个进行测序及生物信息学分析,终获得10条已知功能或有注释的差异基因片段和3条未知的表达序列标签(EST).筛选出的差异表达基因涉及氧化损伤、细胞增殖和肿瘤发生等多方面的功能.结论 氡染毒可引起一系列基因表达的上调或下调,利用SSH技术可以筛选到氡染毒的差异表达基因,为探讨氡损伤机制提供参考.
-
SSH方法分离大剂量照射后小鼠骨髓差异表达EST序列
目的为探讨骨髓辐射损伤的分子机理,研究了整体照射条件下,辐射前后骨髓基因表达的变化.方法小鼠7 Gyγ射线照射后4 h提取骨髓总RNA为实验方(tester),对照组动物骨髓总RNA为驱动方(driver);实验方、驱动方总RNA由SMART cDNA合成方法合成双链cDNA,进而由抑制消减杂交(SSH)方法获得消减杂交产物,消减杂交产物克隆到T载体建立消减文库;对部分克隆进行杂交筛选及序列比对.结果消减杂交文库挑取800个克隆进行PCR扩增,阳性率约为86%;部分克隆经两轮杂交筛选获得14个差异片段;7个差异片段与鼠EST库已有序列高度相似,其余7个差异片段可能是新的EST序列.结论大剂量照射后小鼠骨髓cDNA消减文库的建立以及部分差异表达EST的验证为进一步研究辐射相关差异表达基因奠定基础.
