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丹参功能基因组学研究Ⅱ——丹参毛状根不同时期基因表达谱分析
目的:研究丹参毛状根不同时期的基因表达谱,发掘丹参功能基因.方法:通过比较不同时期丹参毛状根的生长量和次生代谢产物含量确定用于cDNA芯片杂交的材料.采用间接标记法进行探针标记后进行杂交反应,GenePix Pro 4.0软件对芯片图像进行分析,数据用Lowess方法进行归一化处理.采用两倍差异标准结合T检验来确定差异表达基因.Northern点杂交检验4个基因与芯片杂交结果的一致性.差异基因单向测序后经过gap4软件拼接聚类,然后利用BLASTX,BLASTN进行比对分析,利用Gene Ontology和KEGG进一步预测基因的功能.结果:30～45 d为丹参毛状根的快速增殖期,45～60 d为丹参次生代谢产物的快速积累期.将45,60 d丹参毛状根分别与30 d材料进行杂交,得到203个差异基因.4个基因Northern点杂交的结果与芯片杂交结果一致.测序后得到172条EST,拼接聚类后形成114个Unigene,其中功能已知基因62个,功能未定的假想蛋白34个,相似性较低的未鉴定基因9个,无显著相似性的基因9个."GO"分类中67个基因得到注释,KEGG分析中74个基因得到注释,26个有详细的代谢途径分析.结论:得到一系列次生代谢相关基因如细胞色素P450、二萜合酶等基因片段,为深入开展丹参功能基因组学研究提供了基础.
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丹参功能基因组学研究Ⅰ——cDNA芯片的构建
目的:构建丹参cDNA芯片,为基因表达谱研究提供条件.方法:采用CTAB法提取丹参根总RNA,采用Pharmacia公司QuichprepTMMicro mRNA PurifiCation Kit分离mRNA后,通过在cDNA分子两端加上EcoR Ⅰ/Not Ⅰ接头,在T4多核苷酸激酶的作用下磷酸化,与表达载体λZAP Express Predigested Vector连接,然后用包装蛋白在体外包装连接产物,感染E.coli XL1-Blue MRF'构建成cDNA文库.挑取分离良好的噬菌斑进行PCR扩增,经过电泳检测、纯化、再次电泳检测后得到的克隆用于芯片点制.以丹参actin基因作为阳性对照,不含DNA的点样液和PolyA为阴性对照.结果:cDNA文库插入片段长度为500～2 500 bp.共得到4 354个克隆用于芯片点制.单色荧光(Cy3)杂交显示,阳性对照均出现杂交信号,阴性点没有杂交信号.整张芯片背景清晰,漏点少,杂交点为完整的圆形,芯片质量完好.结论:该芯片的制作为首张有关道地药材的cDNA芯片,为丹参功能基因组的研究提供了强有力的工具.
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脾气虚证免疫相关基因组学机制初探
目的采用cDNA芯片技术,探讨脾气虚证免疫功能的异常变化,并揭示其发生的基因组学机制.方法分别提取脾气虚证慢性胃炎与溃疡性结肠炎患者(6例)以及健康人(3名)外周血白细胞总RNA,mRNA微量扩增,制成杂交探针;脾气虚证慢性胃炎与溃疡性结肠炎患者分别用Cy3标记,健康人用Cy5标记.标记好的Cy3、Cy5探针等量混匀后与cDNA芯片杂交.扫描仪扫描芯片荧光信号,处理、分析数据.分别比较脾气虚证慢性胃炎与溃疡性结肠炎患者同健康人外周血白细胞中免疫相关基因表达水平的差异.结果脾气虚证慢性胃炎与溃疡性结肠炎患者外周血白细胞中CD9、CD164、PF4、RARB基因表达下调,IGKC、DEFA1、GNLY基因表达上调.结论脾气虚证发生有免疫相关基因组学基础,脾虚时机体免疫功能紊乱.
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应用抑制消减杂交和cDNA芯片技术筛选流行性感冒病毒感染相关基因
病毒基因组有限的编码能力和以病毒蛋白为靶的抗病毒药物易出现耐药性,使从病毒感染宿主筛选病毒感染相关生物大分子作为抗病毒药靶和诊断标志物成为新的研究方向.为了筛选流行性感冒(流感)病毒感染相关基因,采用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,以流感病毒A/鲁防/93-9(H3N2)感染的MDCK细胞及正常MDCK细胞为材料,构建病毒感染特异性差减cDNA文库.从文库中随机挑取约800个克隆,PCR扩增其中插入片段,经纯化、紫外定量后,用基因芯片自动点样仪点在氨基片上,制备cDNA芯片.将流感病毒感染的MDCK细胞和正常MDCK细胞的总RNA分别用Cy3、Cy5反转录荧光标记后,与cDNA芯片杂交,用芯片扫描仪扫描获得芯片杂交信号,经阳性对照校正和归一化处理后,以如下条件作为判定基因差异表达的标准;(a)Cy3与Cy5的信号比值大于1.5(正常细胞用Cy5标记)或小于0.67(正常细胞用Cy3标记);(b)Cy3和Cy5信号值之一必须大于1 000.经cDNA芯片筛选获得了18个流感病毒感染特异性克隆,经测序和生物信息学分析发现均为流感病毒感染相关新基因EST.流感病毒感染相关基因cDNA片段的获得,为新型病毒药靶诊断标志物发现和功能研究提供了基础.
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cDNA芯片法筛选压力负荷型心肌肥厚相关基因
应用cDNA芯片技术筛选腹主动脉绑扎后4周大鼠的压力负荷型心肌肥厚相关基因.在反转录来自假手术及腹主动脉绑扎(4周)的大鼠心肌组织RNA的过程中,用α-33P-dATP进行探针的标记.然后将探针与微阵列尼龙膜杂交,高严谨度洗涤后分析杂交图谱.通过所获某种特定基因信号的相对强度值来比较其在对照及腹主动脉绑扎的大鼠心肌组织中表达水平的差异.结果显示有235个基因片段在两组之间信号差别在3倍以上,其中5倍以上差异的基因有55个,而在这55个基因中有26个基因功能未知.所得差异片段包括TGFβ受体III ,raf, ARF, clk2 等重要的信号传导分子与心肌肥厚的发生密切相关.
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肝癌伴门静脉癌栓的基因表达研究
目的用cDNA芯片研究原发性肝癌(HCC)伴和不伴门静脉癌栓(PVTT)形成的基因表达差异.方法利用含有5075个功能基因cDNA的人表达谱芯片,将原发性肝癌患者分成AB、CD两组,AB组为不伴门静脉癌栓组(n=3),CD组为伴有门静脉癌栓组(n=3),分别提取标本癌、门静脉癌栓和癌旁组织,抽提总mRNA,反转录为cDNA与芯片进行杂交,对比mRNA表达的差异.结果两组相比较AB组的癌组织与CD组的癌及癌栓组织上调表达基因分别有39个和35个不同,两组下调表达基因分别有59个和46个不同.在不重复的两组的上调和下调表达基因中,表达明显上调的基因(ratio＞3)AB组有3个、CD组有5个,而明显下调的(ratio＜0.4)AB组有4个、CD组有10个.结论 cDNA芯片是检测伴和不伴门静脉癌栓肝癌的不同基因表达差异的有效方法.这些不同的基因表达与门静脉癌栓的形成、维持、发展有关.进一步分析这些基因将有助于门静脉癌栓生物学特性的了解.
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应用低密度芯片初步筛选胃癌淋巴转移相关基因的研究
目的:运用低密度cDNA芯片技术初步筛选影响胃癌淋巴结转移的分子标志.方法:运用自制低密度cDNA芯片检测15例胃癌患者原发癌灶和淋巴结转移癌中多个基因mRNA表达,并用RT-PCR方法进行验证,分析其与胃癌侵袭和淋巴结转移的相关性.结果:hTERT在淋巴结转移癌中表达明显高于胃原发癌灶(P=0.001).原发癌灶中MMP 7和Heparanase表达在小结节孤立型淋巴结病例中明显高于大结节融合型者(P值分别为0.022和0.002),而CDH1表达明显降低(P=0.002);淋巴结转移癌灶中CDH1表达在小结节孤立型淋巴结病例中亦明显降低(P=0.046).按淋巴结转移个数分成轻重两组(≤6个为轻度转移,≥7个为重度转移),原发癌灶中MMP-7和hTERT表达在重组明显高于轻组(P值分别为0.001和0.005);淋巴结转移癌灶中MMP-7、S100A4和hTERT基因表达在重组明显增高(P值分别为0.000 05、0.007和0.016),而nm23H1和CDH1表达明显降低(P值分别为0.013和0.001).胃原发癌中MMP-7、Heparanase、S100A4过表达和(或)nm23H1、CDH1、KAI-1表达降低或缺失者,胃癌多侵透浆膜,且浆膜受侵面积较大.结论:hTERT、MMP-7、S100A4、Heparanase、CDH1和nm23H1基因表达与胃癌淋巴结转移关系密切,可望成为胃癌淋巴结转移诊断和治疗的分子靶点.
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加压素对大鼠内耳细胞信号转导基因表达的影响
目的研究加压素对大鼠内耳细胞信号转导有关基因表达的影响,探讨加压素引起膜迷路积水的发生机制.方法大鼠腹腔注射精氨酸加压素50μg/kg,每天1次,共1周;取出听泡,提取内耳总RNA,逆转录成cDNA并标记;然后和大鼠cDNA芯片杂交,显示加压素注射前后大鼠内耳mRNA表达强度变化.结果筛选出和细胞信号转导有关的差异表达基因10条,Ratio＞5的上调的基因有Chnl,Pak3和Ptprc.结论加压素可能从细胞信号转导基因表达方面影响内耳的液体平衡,从而导致膜迷路积水.
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关键词：
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BEP2D细胞恶性转化不同时期差异表达基因的筛选
目的筛选并鉴定α粒子辐射诱发永生化人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化不同时期差异表达的基因.方法抑制消减杂交(SSH),cDNA芯片.结果利用SSH构建了BEP2D细胞3个恶性转化不同时期差异表达基因的文库,BEP2D细胞的文库有416个克隆,R15H20细胞的文库有301个克隆,R15H35细胞的文库有586个克隆,经cDNA Microarray验证发现:BEP2D细胞文库来源的芯片与3代细胞探针杂交后的阳性信号率为90.4%、21.6%和19.7%;R15H20细胞文库来源的芯片的阳性信号率为8.6%、93.8%和31.6%:R15H35细胞文库来源的芯片的阳性信号率为23.5%、18.2%和90.7%.结论联合应用SSH和cDNA Microarray是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速和有效方法;经 cDNA Microarray鉴定出的 3个文库中差异表达的cDNA可能代表了α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化相关的基因.
关键词： α粒子 抑制消减杂交 cDNA芯片 永生化人支气管上皮细胞 -
cDNA芯片技术杂交效率的优化
目的cDNA芯片杂交影响因素很多,如固定于玻片的DNA片段的浓度、溶解DNA片段的点样液、荧光探针浓度及纯度杂交液、杂交温度、杂交时间和Cy3与Cy5荧光素标记探针等,本实验针对其中重要影响因素进行优化筛选,以提高杂交效率.方法通过逐一改变cDNA杂交技术重要影响因素的实验条件,平行设置多组实验,从中筛选出佳实验数据.结果与结论重复实验结果表明,杂交效率较高的条件为:浓度约为0.50 μg·μL-1 DNA片段,溶于1×Micro Spotting Solution(ArrayItTM)中,与纯化后的荧光标记在0.5%SDS/10×SSC甲酰胺杂交液,在42℃杂交.
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基因芯片技术在心脏外科的应用
基因芯片技术以高通量、高效率、大规模的独特优势,为心血管外科的各类疾病的研究提供了强有力的系统研究手段.本文着重阐述了基因芯片技术在先天性心脏病研究慢性心衰、心肌保护及心脏移植排斥反应四方面的应用.
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基因芯片技术在心脏外科的应用
进入后基因组时代以后,基因芯片技术在心脏外科诸多方面的研究与应用及其现今存在的一些问题.
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表浅性与浸润性膀胱癌基因表达谱的比较
目的 比较人表浅性与浸润性膀胱癌基因表达谱的差异.方法 应用基因芯片技术对表浅性膀胱癌和浸润性膀胱癌的RNA进行检测分析.得到芯片灰度扫描图,通过图像处理软件GenePix Pro 3.0对图像进行分析,得到表达差异基因的相应数据,根据差异基因的类型及膀胱癌的特点分析数据.结果 按显著差异基因标准,从13939条基因中筛选出显著差异表达基因:表浅组714条,其中480条下调,234条上调;浸润组470条,其中302条下调,168条上调.在显著差异基因中,下调基因的数量比上调基因多近1倍,免疫相关基因在浸润性膀胱癌中下调明显.结论 浸润性和表浅性膀胱癌的基因表达谱具有许多共同特点,但表浅性膀胱癌的差异表达基因较浸润性膀胱癌更多.免疫相关基因在浸润性膀胱癌中缺失较表浅性膀胱癌严重.
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内毒素活化巨噬细胞早期和晚期基因表达的cDNA芯片分析
目的利用cDNA芯片技术分析内毒素活化的小鼠腹腔巨噬细胞早期和晚期基因表达,以更全面了解内毒素在感染、创伤反应中通过巨噬细胞介导的炎症和免疫反应.方法以未刺激的和用1 mg/ L脂多糖(LPS)分别刺激2 h(早期)和24 h(晚期)的小鼠腹腔巨噬细胞制备33P标记的cDNA探针,并分别与小鼠cDNA表达芯片(含1 176个已知基因)杂交.结果巨噬细胞活化早期的3倍差异表达基因为69个,其中44个上调,25个下调;巨噬细胞活化晚期的3倍差异表达基因中有11个上调,26个下调;只有8个基因同时出现于活化早期和晚期的差异表达基因中.许多转录因子、细胞内信号转导调节蛋白、炎症细胞因子和细胞凋亡相关基因的表达均发生了明显的调节变化.发现BTB和CNC同源1(BACH1)、早期生长反应蛋白2(EGR2)、E47反应蛋白1(EIP1)、Ngfi-A结合蛋白2(NAB2)、成髓细胞白血病癌基因样蛋白(MYBL2)、神经纤维癌蛋白基因1(NF1)、睫状神经营养因子(CNTF)和Sema4A等一些以前未曾报道与LPS诱导的巨噬细胞活化相关的基因.结论采用cDNA芯片技术了解内毒素诱导的巨噬细胞活化早期和晚期的综合基因表达信息,有助于更好地了解感染、创伤后细菌内毒素诱导的炎症免疫反应.
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cDNA芯片在卵巢癌早诊及临床病理分期中的初步应用探讨
目的:探讨PTEN,nm23H1,VEGF165,Tiam1,MMP-2,Timp2,HE4和S100A4基因在卵巢癌发生和侵袭中的作用.方法:采用cDNA芯片技术分别检测20例卵巢癌和5例正常卵巢组织中上述基因cDNA表达谱差异.结果:PTEN,Timp2和nm23H1cDNA在卵巢癌组织中表达下调(CY-3/CY-5＜0.5);Tiam1,VEGF165,MMP-2,HE4和S100A4cDNA在卵巢癌组织中表达上调(CY-3/CY-5＞2.0);且HE4基因表达上调的为明显(CY-3/CY-5＞5.0).表达下调和表达上调的上述基因与卵巢癌临床病理分期、组织分化程度关系密切(P＜0.01).结论:上述基因与卵巢癌发生及侵袭关系密切.cDNA基因芯片技术对于探讨卵巢癌分子机制,寻找卵巢癌分子标志物具有重要意义.
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脐带间充质干细胞对NB4白血病细胞基因组表达谱的影响
背景:间充质干细胞是体内微环境的重要组成部分且影响肿瘤细胞的多种生物学行为,间充质干细胞的潜在临床价值是近年来的研究热点.目的:通过基因芯片方法分析脐带间充质干细胞对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞基因组表达谱的影响.方法:体外建立脐带间充质干细胞与急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞共培养体系,检测脐带间充质干细胞对NB4细胞增殖、凋亡和分化的影响,分别提取了NB4细胞单独培养组和NB4细胞+脐带间充质干细胞共培养组NB4细胞的mRNA并将其反转录为cDNA,两组分别标记荧光,做成探针并与基因芯片杂交,检测其荧光强度,分析两组基因表达谱的差异.结果与结论:①脐带间充质干细胞促进NB4细胞的增殖和分化并抑制其凋亡;②脐带间充质干细胞作用后的NB4细胞的基因表达谱中有530个基因上调和53个基因下调,与基因相关的功能和信号通路也在一定程度上受到了调节;③结果表明,脐带间充质干细胞通过改变肿瘤细胞内大量基因表达、基因功能及多种信号通路影响NB4细胞的生物学行为.
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低氧对肌腱细胞基因表达谱的影响
目的 探讨低氧对肌腱细胞基因表达谱的影响.方法 酶消化法分离得到的肌腱细胞分别在低氧(2％O2)和常规氧浓度(21％O2)下进行培养,第1代肌腱细胞进行表达谱检测,并用RT-PCR对其中4个差异表达基因进行验证.结果 低氧培养组与常规氧浓度组相比,有40个基因表达差异,且全部在低氧组表达上调.选取的4个差异表达基因的RT-PCR的验证结果与芯片结果一致.结论 低氧促进肌腱细胞增殖涉及多个基因参与.
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卵巢癌相关基因筛选的初步研究
目的通过研究人卵巢癌组织和正常卵巢组织中差异表达的基因,筛选出卵巢癌相关基因以用于早期诊断和治疗.方法以cDNA基因表达谱芯片分析研究卵巢癌组织样本和正常卵巢组织的基因表达谱,计算机分析后比较两种组织中差异表达的基因.结果共筛选出差异表达的基因178条,表达上调基因有40条,下调基因138条,有显著表达差异的基因54条,涉及到11大类基因.结论卵巢癌同其它恶性肿瘤一样,是多种基因结构和功能改变的结果,有关卵巢癌特异性相关基因及其作用尚有待进一步研究.
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神经母细胞瘤恶性进展相关基因初步筛选及验证
目的 利用神经母细胞瘤(NB)临床标本筛选与恶性进展相关的基因.方法 利用比较基因组杂交技术和表达谱基因芯片技术筛选人类17号染色体上某些区域可能存在的与NB密切相关的候选基因,并结合生物信息学分析和RT-PCR检测结果对候选基因进行进一步鉴定.结果 通过初步筛选,在人类17号染色体增添区域发现了与NB恶性进展相关的新基因(ncRAN),该基因包含2个剪切体,Nbla 10727和Nbla 12061.ncRAN在各组织中及MYCN单/多拷贝组细胞中呈现差异性表达,其高表达与不良预后密切相关(P =0.000 221).结论 在17号染色体增添区所鉴定的新基因很可能是1个与NB恶性进展密切相关的癌基因.
