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组织工程肌腱研究进展
肌腱组织工程是组织工程中开展较早的研究领域之一[1].经过几十年有关肌腱替代物以及十余年肌腱组织工程的研究,取得了一些突破性进展.但由于肌腱解剖结构和功能要求的特殊性,特别是常见的人体手部肌腱损伤的修复,至今仍是临床工作和组织工程研究的难点之一.主要存在以下几个方面的问题:肌腱组织工程种子细胞的来源;同种异体肌腱细胞的免疫学反应;特殊力学强度和降解性能支架材料的制备和筛选;细胞与支架材料之间相互作用关系及细胞-材料复合体与周围组织相互关系的问题等等.现对上述问题的研究进展作一综述.
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力学应力对肌腱细胞代谢影响的研究进展
20世纪80年代后期，组织工程化肌腱的研究取得了显著成果，与传统肌腱损伤的修复方法相比，解决了自体肌腱移植引起的供区功能缺失和同种异体、异种肌腱移植后的免疫排斥等问题，为肌腱缺损的修复开辟了一条新的思路和治疗途径。肌腱细胞作为肌腱的基本功能单位，是组织工程化肌腱理想的种子细胞之一。本文从肌腱细胞的生物学特点入手，就力学应力作用对肌腱细胞代谢的影响作一简要综述。
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骨髓间充质干细胞在心血管疾病治疗中的应用
间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞,主要存在于全身结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量为丰富,在一定的诱导条件下能分化为成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞、骨骼肌细胞及心肌细胞[1-8].由于不同的文献对其有不同的命名,即集落形成单位成纤维细胞(CFU-F)、骨髓基质成纤维细胞(MSF)、骨髓基质细胞(MSC)、间充质干细胞(MSC)或间充质祖细胞(MPC).由于骨髓是其主要来源,因此统称为骨髓MSCs,并仅就其生物学特征、多向分化潜能及在心血管疾病治疗中的研究进展作一综述.
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间充质干细胞的研究进展
骨髓组织中,除含造血干细胞外,还含有另一类为间充质干细胞.它是一群均一的细胞,具有自身的增殖表征及组织化学特征.它在适宜的微环境中能分化为成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞和星状神经细胞等,它易于分离获取扩增,易于外源基因导入表达,有望成为细胞治疗和基因治疗的新型靶细胞,具有广阔的应用前景.
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间接共培养环境下脂肪干细胞诱导分化的研究
目的 肌腱病的治疗是临床的难点,脂肪干细胞(ADSCs)具有多向分化潜能,为肌腱病的治疗提供了新思路.此课题在体外构建ADSCs与肌腱细胞的间接共培养模式以探索其机制,为其临床应用提供参考.方法 分别采集培养兔肌腱细胞和ADSCs及富血小板血浆(PRP).选用孔径为0.4 μm的共培养嵌盒和6孔板来构建间接共培养模式.分别将P3代肌腱细胞、ADSCs接种于内、外室,另外设置PRP干预组.分别在第3,7,14天时,收集各组内、外室细胞并进行观察及检测,分析间接共培养环境对ADSCs诱导分化与胞外基质表达产生的影响.结果 间接共培养14 d,免疫组化结果显示单纯干细胞培养组ADSCs的Ⅰ型胶原与腱调蛋白(TNMD)的表达程度显著高于阴性的干细胞对照组,低于阳性肌腱细胞对照组,而PRP干预组的表达优于单纯干细胞实验组.结论 间接共培养的环境下,可以诱导ADSCs上调Ⅰ型胶原和腱调蛋白的表达.PRP的干预对诱导ADSCs细胞外基质的分泌有促进作用.
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生长因子对肌腱细胞表型及分化的影响
目前对于肌腱细胞体外培养的难点较为突出,其中一个难点为,肌腱细胞在体外长时间培养难以维持其表型的表达,继而影响其分化;另外一个难点是,在培养基内添加了大量的胎牛血清,而大量胎牛血清的使用会造成动物-人之间的疾病传播.已有研究显示在培养基中加入不同的生长因子以减少胎牛血清的使用并促进肌腱细胞的分化.本综述较为全面地总结了几种肌腱细胞较为重要的表型和分化标志物以及几种维持肌腱细胞表型的生长因子.
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干细胞在肌腱组织损伤修复中的潜能
损伤的肌腱组织修复过程非常缓慢,并且很难恢复到原来结构完整和机械力学正常的状态.对肌腱基本特征的了解缺乏限制了挛缩肌腱治疗方法的发展.肌腱细胞再生能力有限,而外基质绝大多数由这种再生能力较弱的肌腱细胞分泌.肌腱损伤后即使在恢复应力后依靠自身的修复功能依然不可能逆转其挛缩的状态.因此,寻找新型的、可促进肌腱生理性再生修复的方法具有极其重要的临床意义,而发现合适的种子细胞和理想的诱导剂是组织工程化肌腱细胞构建的关键所在,其中一些方法包括利用胚胎干细胞、肌腱前体细胞、脂肪干细胞及相应的转录调控因子形成新的肌腱组织.
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RNA干扰抑制大鼠肌腱细胞中V型胶原基因的表达*
目的：利用RNA干扰技术（RNAi）下调肌腱细胞中V型胶原蛋白的表达，拟为后续探讨V型胶原在损伤肌腱修复过程中的作用提供可行的试验方法。方法：分别设计干扰大鼠V型胶原[COL5（1）2（2）]两个亚基COL51和COL52表达的siRNA序列，转染大鼠肌腱细胞。通过实时荧光定量PCR和免疫荧光法检测V型胶原在基因和蛋白水平的表达。结果：转染特定的siRNA后，V型胶原两个亚基的基因表达被抑制约70%，蛋白表达也被明显抑制。结论：RNAi法可有效地抑制大鼠肌腱细胞中V型胶原的基因和蛋白水平表达。为进一步研究V型胶原在肌腱损伤修复过程中的作用提供了可行的试验方法。
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重建端粒酶活性延长ptsA58H质粒转染的人胚肌腱细胞寿命
目的探讨以重建细胞端粒酶活性,达到延长经ptsA58H质粒转化的人胚肌腱细胞系(THETC)寿命的可行性.方法构建含人端粒酶逆转录酶(hTERT)cDNA的质粒pGRN145,体外转染THETC;通过形态学观察、平板克隆形成率检测、软琼脂培养、不同培养条件下细胞生长曲线的测定,免疫组化法染色分析胶原分泌类型,hTERT mRNA表达及端粒重复序列扩增-PCR法检测细胞端粒酶活性等,对转染前后的细胞生物学特性进行比较.结果经pGRN145质粒体外转染的THETC(telT)有端粒酶活性表达,并继续保持旺盛的增殖能力,寿命延长.telT保持原有的温度依赖性及血清营养依赖性生长的特点,并正常分泌I型胶原,无恶性转化趋向.结论重建端粒酶活性可以延长THETC寿命,为建立组织工程标准细胞系提供了新的实验手段.
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皮肤成纤维细胞构建组织工程肌腱的实验研究
近年来,研究者们应用类似于骨髓基质干细胞的细胞作为组织工程肌腱的种子细胞[1-3],未获明显进展.皮肤成纤维细胞和肌腱细胞均来源于中胚层,细胞形态相似.如果成纤维细胞能取代肌腱细胞,作为种子细胞应用于肌腱组织工程则可望解决种子细胞缺乏的难题.作者曾应用成纤维细胞作为种子细胞修复肌腱缺损取得初步成功[4],但缺乏长期观察结果.本研究旨在长期观察皮肤成纤维细胞构建的组织工程肌腱,并与肌腱细胞作为种子细胞的组织工程肌腱进行比较.
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组织工程人工肌腱的研究进展
本文对目前组织工程肌腱的研究成果作一综述,主要从细胞支架、种子细胞、生长因子、周期性张力等各方面进行了阐述.今后,对材料进行合理改进,使之能供给肌腱细胞适合的生存环境,解决种子细胞的来源问题,加入适当的生长因子,并施以符合生理条件的周期性张力,组织工程化肌腱将成为修复肌腱缺损的一种理想而可靠的方法.
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组织块法培养成年兔肌腱细胞
背景:体外分离培养肌腱细胞,熟悉其生物学特性是研究肌腱愈合机制、改善肌腱愈合内环境的前提和基础.目的:采用组织块法体外培养成年兔肌腱细胞,观察其细胞形态、生长增殖情况以及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达.方法:无菌条件下取成年新西兰白兔双侧后肢趾屈肌腱,手术显微镜下剥离、去除肌腱外膜组织,剪成组织小块,0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶Ⅰ消化10~15 min,离心去上清,将组织小块转移到培养瓶中,贴壁后加入1 mL培养液,待细胞游出贴壁生长时,再加培养液继续培养,每3 d换液1次,当细胞长到80%~90%融合时按1∶3传代.结果与结论:一般10 d左右细胞会从组织块游出贴壁生长,此时细胞多呈星形或不规则形,随着时间延长细胞逐渐增多,呈梭形的成纤维细胞样.传代细胞刚接种时圆形,4~6 h开始贴壁并伸展为梭形,排列逐渐规则成群.从传代细胞的生长曲线可看出,前4 d细胞生长较慢,为潜伏期,第5天后进入快速增殖期,7 d以后进入平台期.免疫荧光法证实Ⅰ型胶原染色阳性,而Ⅲ型胶原染色呈阴性.结果表明采用组织块法可在体外成功培养成年兔肌腱细胞.
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组织工程化肌腱的实验研究与临床应用
学术背景:肌腱损伤的治疗方法由于供体肌腱缺乏或免疫排斥反应等因素,使肌腱移植受限,随着细胞培养技术和移植技术的发展以及生物材料科学的发展,一种伞新的理想肌腱替代物--组织工程化人工肌腱将终解决缺损肌腱的修复问题.目的:总结目前组织工程人工肌腱的研究历程和新成果.检索策略:应用计算机检索PubMed数据库1994-01/2007-12的相关文献,检索词"tissue engineering,artificial biocompatibletendon",限定文章语言种类为English.同时计算机检索万方数据库1994-01/2007-12的相关文献,检索词"组织工程,肌腱",限定文章语言种类为中文.共检索文献80篇,中文55篇,英文25篇.纳入标准:①具有原创性,论点论据可靠的实验文章.②观点明确,分析全面的文章.③文献主体内容与此课题联系紧密的文章.排除因研究目的与本综述无关者8篇,内容重复件的研究40篇.文献评价:终纳入符合标准的文献32篇.其中动物实验和在体、离体、细胞学实验10篇,综述、述评、讲座类文献12篇,临床研究10篇.资料综合:肌腱损伤后若未予以及时修复常会导致肢体功能障碍,组织工程化人工肌腱修复缺损肌腱可对肌腱缺损进行形态修复和功能重建,并达到永久性替代.目前,组织工程学研究进展迅速,但要真正应用于临床仍存在一些问题.首先,种子细胞的来源不能仪限丁自体肌腱细胞,其次,如何对材料进行合理改进,使其成为理想的塑造器官形状的三维支架材料,重要的是如何模拟体内环境,在体外成功构建肌腱组织.结论:在体外利用生物反应器模拟体内环境,进行组织工程化肌腱的构建,将是未来的研究方向.
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人工肌腱材料在手外科中的应用
中以"人工肌腱,手外科,细胞支架"或"artificial tendon,hand surgery,cytoskeleton"为检索词进行检索.选择文章与检索关键词材料学特点、生物相容性及其应用效果相关,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章.共纳入15篇文献.结果:组织工程细胞支架材料是组织工程研究中的一个重点及难点.没有合适的支架,种子细胞就会流失死亡.组织工程支架材料应具有良好的生物相容性、生物降解性、三维立体结构及可塑性与相当的力学强度外,还要具有良好的表面活性,以利于种子细胞的黏附,并为细胞在其表面生长繁殖、分泌基质提供良好的微环境.人工肌腱成为有生命的新型肌腱缺损替代物,被机体同化成为机体的一部分,参与机体的更新.组织工程化肌腱的基础研究和临床应用已显出诱人的前景.结论:肌腱组织工程对支架材料的要求很高,复合材料的开发研究将继续成为今后研究的热点,在材料制备工艺、设计及性能优化组合方面将有待于进一步研究.
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肌腱细胞体外转化的实验研究
目的建立一株既保存细胞的功能特性,又容易长期和大量繁殖的标准肌腱细胞.方法采用电穿孔法,在960μF、400V条件下将国外构建的质粒ptsA58H导入肌腱细胞.结果经潮霉素B严格筛选,挑选出了阳性克隆.结论该转化成功的为肌腱细胞标准细胞株建立了转化模型.
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Scleraxis慢病毒基因感染人羊膜间充质干细胞向肌腱细胞的定向分化
背景:Scleraxis作为肌腱细胞特异性表达分子,不仅参与肌腱祖细胞的聚集及分化,还影响肌腱细胞外基质的形成.人羊膜间充质干细胞具有多向分化潜能,在体外不同诱导条件下可分化为骨、软骨及其他结缔组织.目的:探讨Scleraxis慢病毒基因感染人羊膜间充质干细胞能否向肌腱细胞定向分化并观察其分化效果.方法:取足月产胎盘羊膜组织,两步酶消化法分离人羊膜间充质干细胞并采用倒置相差显微镜观察和流式细胞鉴定.取第3代细胞分3组进行培养,单纯人羊膜间充质干细胞培养组为空白组,人羊膜间充质干细胞经Slclerxis基因慢病毒感染后为过表达组,人羊膜间充质干细胞经不携带Scleraxis基因慢病毒感染后为空质粒组.细胞培养7 d内CCK-8法检测各组细胞增殖能力细胞.细胞培养后3 d和7 d,分别进行实时荧光定量PCR和Western Blot检测评价各组细胞向肌腱细胞定向分化的效果.结果与结论:①CCK-8检测显示:培养7 d内,过表达组、空质粒组与空白组细胞在增殖能力上无明显差异(P>0.05);②Westen blot检测显示:过表达组Scleraxis蛋白表达水平明显高于空质粒组和空白组(P<0.05);③实时荧光定量PCR显示:3 d时,过表达组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤连蛋白及肌腱蛋白C mRNA表达水平明显高于空质粒组(P<0.05),而腱调蛋白的表达与空质粒组无明显差异(P>0.05);7 d时,Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤连蛋白、肌腱蛋白C及腱调蛋白的表达水平明显高于空质粒组(P<0.05);④结果提示:人羊膜间充质干细胞经Scleraxis慢病毒基因感染后可向肌腱细胞定向分化.
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富血小板血浆与间充质干细胞增殖和胶原的产生
背景：间充质干细胞是可大量获取的肌腱组织工程种子细胞，但如何体外诱导成为此项技术的关键。
目的：观察富血小板血浆对体外培养间充质干细胞分裂增殖和胶原产生的影响。
方法：分离培养兔间充质干细胞，设立富血小板血浆高、中、低剂量组干预间充质干细胞，并设空白组做对照。
结果与结论：富血小板血浆高、中、低组间充质干细胞均保持较高的增殖活性，呈快速生长，曲线上升幅度大，与空白对照组比较差异有显著性意义(P <0.05)。培养时间越长作用越明显，培养一定时间后其作用具有剂量依赖性，较高剂量的富血小板血浆对细胞的增殖作用较为明显。提示富血小板血浆能明显促进间充质干细胞的Ⅰ和Ⅲ型胶原合成，剂量越大，刺激胶原产生的作用越明显。 -
体外培养肌腱细胞功能老化的观测
目的研究体外贴壁培养肌腱细胞的功能老化.方法取材成年鸡的趾深屈肌腱,经胶原酶消化法获取肌腱细胞,在体外进行传代培养,收集不同培养时期的细胞,进行形态学、细胞增殖、组织学、逆转录聚合酶连反应(RTPCR)及Western blot技术分析,观察不同体外培养时间肌腱细胞表型的变化.结果组织学、RTPCR及Western blot等均证实随着体外培养时间的延长,肌腱细胞传至第5代后,细胞形态发生明显改变,细胞增殖能力显著减弱,胶原分泌明显减少.结论体外贴壁培养的肌腱细胞传至第5代后,细胞表型发生显著老化的改变.
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低氧对肌腱细胞基因表达谱的影响
目的 探讨低氧对肌腱细胞基因表达谱的影响.方法 酶消化法分离得到的肌腱细胞分别在低氧(2％O2)和常规氧浓度(21％O2)下进行培养,第1代肌腱细胞进行表达谱检测,并用RT-PCR对其中4个差异表达基因进行验证.结果 低氧培养组与常规氧浓度组相比,有40个基因表达差异,且全部在低氧组表达上调.选取的4个差异表达基因的RT-PCR的验证结果与芯片结果一致.结论 低氧促进肌腱细胞增殖涉及多个基因参与.
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骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死的研究现状
从传统的发生生物学观点来看,成年受损伤大脑不具备结构上有意义的自身修复功能,成熟脑细胞一旦受损就不能再生.骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),又称骨髓基质干细胞,是骨髓中非造血实质细胞的干细胞,具有高度的自我复制能力和多向分化潜能,可分化成多种细胞.传统观点认为,MSCs只能够分化成中胚层来源的间质细胞,如:成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、网状细胞和血管内皮细胞,但近来研究表明它可以向三个胚层的多种组织分化,如来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等,故MSCs近年来被用于脑缺血动物模型的治疗,初步研究表明它能改善脑缺血动物的神经功能缺失症状,MSCs移植为脑缺血患者开辟了一种新的治疗方法.本文对MSCs移植治疗脑缺血的研究近况进行综述.
