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  • 人类真核翻译延长因子1A2过表达对胰腺癌SW1990细胞体外侵袭及体内转移的影响

    作者:许朝;胡端敏;章永平;诸琦

    目的 探讨人类真核翻译延长因子1A2(EEF1A2)过表达对人胰腺癌SW1990细胞体外侵袭和肺转移潜能的影响.方法 通过携带EEF1A2的慢病毒感染人胰腺癌SW1990细胞建立EEF1A2稳定过表达的SW1990/EEF1A2细胞株及空质粒对照的SW1990/GFP细胞株,并以亲本SW1990细胞作为空白对照.采用实时PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞EEF1A2mRAN和蛋白的表达.应用Transwell小室检测细胞的体外侵袭能力.通过裸鼠尾静脉注射癌细胞方法构建肺转移模型,8周后观察并计数肺表面的转移结节.结果 SW1990/EEF1A2细胞EEF1A2 mRNA相对表达量为3.252±0.344,显著高于SW1990/GFP细胞的1.000±0.060及亲本细胞的0.944±0.041(t值分别为2.255、2.305,P值均<0.01);EEF1A2蛋白表达量为0.833±0.050,显著高于SW1990/GFP细胞的0.247±0.035及亲本细胞的0.273 ±0.041(t值分别为0.572、0.559,P值均<0.01);穿膜细胞数为(60 ±4)个,显著多于SW1990/GFP细胞的(33 ±4)个和亲本细胞的(26 ±3)个(t值分别为31.33、34.78,P值均<0.01);裸鼠肺转移结节显著多于SW1990/GFP细胞及亲本细胞组(5/5比1/5、1/5,P值均<0.05).结论 EEF1A2过表达可以明显增强胰腺癌SW1990细胞的体外侵袭和肺转移能力.

  • 稳定表达EGFP-LC3的AR42J细胞系的建立

    作者:吴敏;李洁;刘晓;李钦芳;郭晓榕;湛先保

    目的 建立稳定表达增强型GFP (EGFP)-LC3的AR42J细胞.方法 利用慢病毒过表达载体Lentiviral-EGFP-LC3包装成慢病毒,感染大鼠胰腺腺泡细胞AR42J.以Lentiviral-EGFP感染作为阴性对照.通过倒置荧光显微镜观察及流式细胞分析仪检测病毒感染效率,蛋白质印迹法检测稳定传代细胞株的LC3蛋白表达.用毒胡萝卜素处理细胞建立内质网应激模型,采用蛋白质印迹法检测应激的AR42J细胞的LC3、PERK蛋白表达.结果 AR42J细胞的Lentiviral-EGFP-LC3感染效率>85%,并能稳定传代.Lentiviral-EGFP-LC3感染的AR42J细胞的LC3 mRNA表达量为未感染细胞的(9.14±0.32)倍;LC3蛋白阳性表达并有EGFP-LC3融合蛋白的表达.Lentiviral-EGFP感染的AR42J细胞的LC3 mRNA表达量为未感染细胞的(1.08 ±0.07)倍,无LC3蛋白表达,仅有GFP表达.与未感染组比较,EGFP-LC3组的LC3 mRNA表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),而EGFP组的差异无统计学意义.结论 成功构建了稳定表达EGFP-LC3的大鼠胰腺外分泌细胞AR42J,为进一步研究急性胰腺炎与自噬的关系提供了新的细胞模型.

  • 稳定过表达hB7-H3基因的人胰腺癌PANC1细胞株的构建

    作者:李东宝;李德春;赵华;赵鑫

    目的 构建稳定过表达hB7-H3基因的人胰腺癌PANC1细胞株,为研究hB7-H3基因的功能提供基础工具.方法 将hB7-H3基因片段插入携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒质粒GV287,构建重组hB7-H3-GV287质粒,转染293T细胞,荧光显微镜下观察GFP的表达,蛋白质印迹法检测hB7-H3蛋白表达;通过慢病毒包装后测定病毒滴度.将表达hB7-H3的病毒感染人胰腺癌PANC1细胞,应用流式细胞仪检测GFP及hB7-H3阳性表达率;实时PCR及蛋白质印迹法检测感染细胞的hB7-H3mRNA及蛋白表达.以自身环化的GV287质粒作为阴性对照(NC).结果 重组质粒的PCR扩增片段约1 368 bp,NC质粒无扩增产物,重组质粒DNA测序结果与设计的片段完全一致,表明重组hB7-H3-GV287质粒构建成功.重组质粒转染后293T细胞表达hB7-H3蛋白,而NC质粒转染后细胞无hB7-H3蛋白表达.重组hB7-H3质粒经慢病毒包装后的病毒滴度为2×108 TU/ml.慢病毒感染人胰腺癌PANC1细胞后,细胞hB7-H3阳性表达率、hB7-H3 mRNA及蛋白表达分别为94.3%、5.09±0.24、2.85±0.27,较NC慢病毒感染的18.5%、1.28±0.53、0.44±0.69显著增加,差异均有统计学意义(P值均<0.01).结论 稳定过表达hB7-H3基因的人胰腺癌PANC1细胞株的构建成功.

  • 靶向B7-H3基因RNA干扰慢病毒的构建及人胰腺癌PaTu8988稳定感染细胞株的建立

    作者:赵鑫;张光波;李智;干文娟;朱东明;赵华;张子祥;李德春

    目的 构建靶向人B7同源性3(B7-H3)基因的小发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,并建立稳定感染的胰腺癌PaTu8988细胞株.方法 根据GenBank提供的B7-H3 cDNA序列,设计4条靶向B7-H3的siRNA序列,构建重组干扰质粒pGCSIL-GFP-B7-H3-shRNA.将重组干扰质粒和过表达B7-H3质粒共同转染293T细胞,经蛋白质印迹法筛选出干扰效果佳的重组干扰质粒.该质粒经慢病毒包装,并感染胰腺癌PaTu8988细胞株,建立稳定低表达B7-H3细胞株.应用实时定量PCR及蛋白质印迹法检测细胞B7-H3基因的表达抑制率.结果 携带干扰效果好的shRNA的慢病毒感染PaTu8988细胞,建立了稳定低表达B7-H3基因的PaTu8988细胞株,其B7-H3 mRNA表达的抑制率达96.8%,B7-H3蛋白表达的抑制率达88.1%.结论 成功构建了人B7-H3-RNAi的慢病毒载体,并建立了稳定感染的低表达B7-H3基因的PaTu8988细胞株.

  • 沉默ABCC4基因表达对人胰腺癌PANC1、BxPC-3细胞增殖的影响

    作者:马瑾;张卓;王建承

    目的 检测ABCC4基因沉默后对人胰腺癌PANC1、BxPC-3细胞增殖及细胞周期的影响.方法 构建插入靶向ABCC4的shRNA片段的重组慢病毒载体,感染人胰腺癌细胞株PANC1和BxPC-3.采用实时定量PCR法和蛋白质印迹法检测感染细胞的ABCC4 mRNA及蛋白表达,克隆形成实验测定感染细胞形成的克隆数,流式细胞仪检测感染细胞的细胞周期.结果 成功构建了插入靶向ABCC4的shRNA片段的重组慢病毒载体.重组慢病毒感染PANC1及BxPC-3细胞后,细胞ABCC4 mRNA表达被抑制(0.28 0.01比1.00±0.03,0.22 ±0.02比1.00 ±0.03,P值均<0.05);ABCC4蛋白表达亦显著下调;感染的PANC1细胞克隆形成数量显著减少(4比65,P<0.05);细胞周期阻滞在G1期[(54.98±1.78)%比(42.93±0.88)%,(68.55±0.75)%比(54.76 ±0.29)%].结论 沉默人胰腺癌PANC1和BxPC-3细胞的ABCC4基因表达可显著抑制癌细胞的增殖,使细胞阻滞于G1期.

  • 稳定沉默Beclin1基因的胰腺腺泡细胞株AR42J的建立

    作者:李钦芳;吴敏;郭晓榕;李洁;顾晓霞;湛先保

    目的 采用RNA干扰技术沉默大鼠胰腺腺泡细胞AR42J的Beclin1基因表达,构建稳定的Beclin1基因沉默的AR42J细胞系.方法 设计并合成3种靶向大鼠Beclin1 mRNA的shRNA及阴性对照shRNA,分别插入质粒GV112,重组质粒分别命名为p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、p-sh-Beclin1-3 及p-shRNA-NC.应用lipo3000将重组质粒瞬转入AR42J细胞,应用RT-PCR检测细胞Beclin1 mRNA表达,筛选出沉默效率高的质粒,在293T细胞内经慢病毒包装(LV-shBeclin1),感染AR42J细胞,应用嘌呤霉素筛选,采用RT-PCR及蛋白质印迹法分别检测病毒感染细胞Beclin1 mRNA和蛋白表达.结果 重组质粒经琼脂糖凝胶电泳分离及测序证实shRNA序列符合预期.p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、p-sh-Beclin1-3及p-shRNA-NC转染后AR42J细胞Beclin1 mRNA表达抑制率分别为(17.8±4.0)%、(30.6±2.8)%、(45.8±7.7)%、(7.0±11.8)%.3个p-sh-Beclin1转染细胞的表达抑制率均较未转染细胞显著增加,差异有统计学意义(P值均<0.05),而转染p-shRNA-NC细胞的表达抑制率与未转染细胞的差异无统计学意义.抑制率高的p-sh-Beclin1-3经慢病毒包装,感染AR42J细胞,感染细胞的BeclinmRNA表达抑制率为(86.1±1.2)%,蛋白表达抑制率为(87.9±2.8)%,与未感染细胞的差异均有统计学意义(P值均<0.01).结论 成功建立Beclin1基因沉默的AR42J细胞株,为探讨Beclin1基因在急性胰腺炎发病机制中的作用提供新的细胞模型.

  • 多效蛋白基因的小干涉RNA慢病毒表达载体的构建及其对人小细胞肺癌H446细胞株生长与凋亡的影响

    作者:余勇;施敏骅;徐迅;胡华成

    目的 构建针对多效蛋白(pleiotrophin,PTN)基因的小干涉RNA(siRNA)慢病毒表达载体并观察其对人小细胞肺癌H446细胞株PTN表达抑制及对细胞生长和凋亡的影响.方法 设计4对针对PTN基阒的小发夹RNA(shRNA)序列,与Plvthm载体连接,构建慢病毒表达载体LV(lentiviral)-shPTN,连接产物转化到DH5α感受态细胞,阳性克隆测序鉴定.再用LV-shPTN与pRsvREV、pMDlg-pRRE、pMD2G三种质粒共转染293T细胞,小量包装与纯化产生慢病毒颗粒.感染H446细胞后,用荧光定量PCR及Western blot法检测PTN的表达.将包含对PTN基因十扰效率高的序列慢病毒载体进行大量包装、纯化及病毒滴度测定,将包装好的病毒感染H446细胞.实验分为正常未干扰细胞组、阴性对照组、PTN抑制组、化疗组及PTN抑制加化疗组,四甲基偶氮唑盐比色法观察细胞生长,流式细胞仪分析细胞凋亡.结果 测序结果与构建慢病毒载体的预期结果一致,对PTNmRNA的高抑制效率为72%,对PTN蛋白的高抑制效率为59%.大量包装与纯化后病毒滴度为1×10~8 TU/ml.PTN基因抑制组H446细胞活力明显低于正常未干扰细胞组和阴性对照组,基因抑制联合化疗组较单纯基因抑制组及化疗组细胞活力下降,凋亡率增高,并具有浓度依赖性.结论 构建PTN RNA干涉载体,转染后可有效降低H446细胞FIN的转录和表达,抑制H446细胞的生长并促进其凋亡,有望成为小细胞肺癌基因治疗的可选择的方法之一.

  • AQP1慢病毒载体成功转染心肌细胞后加重体外循环后心肌细胞水肿

    作者:闫玉梅;丁芳宝;梅举;孙锟

    目的 探讨水通道蛋白-1(AQP1)慢病毒载体可否成功转染心肌细胞,转染成功的心肌细胞在体外循环结束后,不同时点AQP1表达变化及与心肌水肿的关系.方法 健康成年羊36只,分为空载体组和AQP1慢病毒转染组.根据羊AQP1mRNA全基因设计酶切引物,克隆到慢病毒表达载体中,与其它包装载体共转染293T细胞产生病毒载体并测定病毒滴度.体外循环期间将空载体或AQP1病毒悬液注射入左心室心肌组织,体外循环结束后不同时间点(2、6、12、24、48、72 h)取材,每个时间点3只.应用realtimePCR、WesternBlot、ELASE、流式细胞仪(FACS)和干湿重法等检测AQP1慢病毒载体是否成功转染心肌细胞,成功转染体外循环后不同时间点AQP1表达变化和心肌水肿程度.结果 成功构建AQP1慢病毒载体并转染心肌细胞,体外循环后不同时间点AQP1表达变化趋势和心肌水肿程度与空载体组心肌表达变化趋势一致,但程度较高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 AQP1慢病毒载体可成功转染心肌细胞,AQP1高表达的心肌组织在体外循环后不同时间点AQP1的表达和水肿程度变化趋势不变,但均较空载体转染组程度高.AQP1表达量与心肌水肿程度正相关.

  • 慢病毒介导的miRNA逆转胃癌细胞耐药性研究

    作者:袁光波;郭建新;陈蜜;徐正阳;娄鹏荣;陶庆松

    目的:利用慢病毒介导的RNA干扰技术(RNAi),沉默SGC-7901/DDP胃癌耐药细胞株的多药耐药基因1(MDR-1)表达,逆转该细胞株对顺铂(DDP)的耐药性.方法:将前期筛选获得的MDR-1基因佳干扰片段构建慢病毒表达载体,包装成慢病毒,感染SGC-7901/DDP耐药株,通过逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印迹法验证干扰效果后进行DDP药物敏感度实验和细胞凋亡检测.结果:慢病毒介导的基因沉默效果较前期干扰质粒效果更明显,MDR-1mRNA表达抑制率为(51±3)%,且P糖蛋白表达下调至(47±8)%,干扰后的SGC-7901/DDP细胞IC50值下降至1.1 μg/mL,并且细胞株的凋亡率显著增加.结论:慢病毒介导的RNAi可有效抑制SGC-7901/DDP胃癌耐药细胞株的MDR-1基因表达,实现其DDP耐药性逆转.

  • 慢病毒介导高表达OTUD7B对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为影响

    作者:刘静;史建红;段菲;陈保平

    目的 去泛素化酶OTUD7B与肿瘤的发生、发展密切相关.为了明确OTUD7B在乳腺癌中所发挥的作用,实验利用慢病毒构建高表达OTUD7B载体感染MCF-7乳腺癌细胞后对其生物学行为的影响.方法 构建带有绿色荧光蛋白标签的人OTUD7B表达质粒的慢病毒(pEGFP-hOTUD7B)及对照(pEGFP-CI)感染MCF-7乳腺癌细胞;于荧光倒置显微镜下观察病毒转染效果及应用蛋白质印迹法及免疫组化法检测OTUD7B的表达水平;MTS法检测实验组(pEGFP-hOTUD7B)、阴性对照组(pEGFP-CI)和正常对照组对MCF-7乳腺癌细胞增殖能力的影响;应用细胞划痕实验检测细胞迁移能力;流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 感染病毒后于荧光倒置显微镜下观察病毒感染效率,可见病毒感染成功.应用蛋白质印迹法检测病毒感染率并找出适病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI),当MOI=30时,实验组、阴性对照组和正常对照组灰度值分别为3.81±0.08、2.12±0.078和2.05±0.15,差异有统计学意义,F=402.03,P<0.001.应用免疫组化法可见感染OTUD7B表达水平.MTS法结果显示,实验组、阴性对照组和正常对照组细胞24 h A值分别为0.36±0.08、0.56±0.25和0.69±0.17,F=11.819,P<0.001;48 h A值分别为0.65±0.17、1.45±0.48和1.82±0.63,F=23.752,P<0.001;在72 h A值分别为0.73±0.21、1.58±0.63和1.99±0.27,F=35.563,P<0.001.细胞划痕试验显示,24 h后实验组组迁移率为(7.7±0.91)%,阴性对照组和正常对照组迁移率分别为(13.4±1.52)%和(12.1±1.32)%,F=49.36,P<0.001,48 h后实验组迁移率为(12.4±1.29)%,阴性对照组及正常对照组迁移率分别为(32.9±1.71)%和(31.8±1.59)%,F=504.50,P<0.001.流式细胞仪检测细胞凋亡结果提示,实验组与阴性对照组及正常对照组相比明显使细胞阻滞在G0/G1期,促进其凋亡,FG0/G1期=425.102,FS期=135.063,均P<0.001.结论 成功构建了能够高表达OTUD7B的慢病毒载体,明显抑制了MCF-7乳腺癌细胞增殖、迁移,并促进了其凋亡.

  • ILK基因RNAi慢病毒表达载体的构建与鉴定

    作者:赵晓珍;徐振晔;许玲;王中奇;龚亚斌;周立娟

    目的:进一步研究整合素连接激酶(ILK)的功能,构建ILK基因RNAi慢病毒载体,并对其在肺腺癌A549细胞株中干扰效率进行鉴定.方法:针对ILK基因RNAi有效靶序列,合成4对oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI酶切的质粒pGCSIL-GFP载体连接产生shILK-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,用shILKi-LV载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293 T细胞,包装产生慢病毒,以293 T细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达水平测定病毒滴度.获得重组慢病毒后感染人肺癌A549细胞,荧光显微镜观察GFP及Real-time PCR检测ILK在A549细胞中的表达.结果:PCR扩增出插入片段,测序证实成功构建了ILK-shRNA慢病毒载体shILKi-LV.包装并浓缩慢病毒,滴度分别为6×108、6×108、5×108和4×108 pfu/mL;将病毒感染A549细胞,荧光显微镜下观察80%细胞表达绿色荧光,Real-time PCR检测ILK mRNA表达明显下降,其中染shILKFKD-1的A549细胞中ILK2-△△Ct值为0.058,shILKi-KD-2、3和4的ILK2-△△Ct值分别为0.162、0.072和0.119,尤以ILKsiRNA-1抑制明显.结论:成功构建shILKi-LV病毒载体并建立了A549-shILKi细胞模型,为ILK在肺癌信号转导通路中的研究提供了工作基础.

  • 人腺苷酸活化蛋白激酶5基因 RNA 干扰慢病毒载体的构建及其对人胃癌 SGC7901细胞生物学行为的影响

    作者:黄选;焦守峰;朱复财;刘丹;易波

    目的:探讨人腺苷酸活化蛋白激酶5(ARK5)基因 RNA 干扰(RNAi)慢病毒载体的构建及其对人胃癌 SGC7901细胞生物学行为的影响。方法以人 ARK5 mRNA 编码序列为干扰靶点,设计3条沉默 ARK5的特异性短发卡 RNA(shRNA),构建重组慢病毒表达载体,转染人胃癌 SGC7901细胞。采用实时荧光定量 PCR 和 Western blot 检测 ARK5基因的沉默效果,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell 法检测细胞侵袭能力,流式细胞仪检测葡萄糖饥饿和肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导处理对细胞凋亡的影响。结果测序结果证明, RNAi 重组慢病毒载体 ARK5-shRNA-3构建成功。实时荧光定量 PCR 检测显示,正常对照组、阴性对照组和 ARK5-shRNA-3转染组的 ARK5基因表达水平分别为1.002±0.082、1.001±0.050和0.140±0.003。 ARK5-shRNA-3转染组与正常对照组、阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。细胞划痕实验显示,ARK5-shRNA-3转染组的细胞迁移率为(38.5±4.3)%,而正常对照组和阴性对照组的细胞迁移率分别为(72.4±6.4)%和(75.1±7.1)%,差异有统计学意义(P<0.01)。 Transwell 检测结果显示,正常对照组、阴性对照组和 ARK5-shRNA-3转染组的穿膜细胞数分别为(257.4±12.3)个、(245.7±11.6)个、(112.5±7.8)个,ARK5-shRNA-3转染组与正常对照组、阴性对照组差异有统计学意义(P<0.01)。在葡萄糖饥饿和 TNF-α处理24 h 后,正常对照组、阴性对照组和 ARK5-shRNA-3转染组的细胞凋亡率分别为(11.7±3.2)%、(12.3±2.6)%和(30.8±4.3)%,ARK5-shRNA-3转染组与正常对照组、阴性对照组差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功构建了能高效沉默 ARK5基因的重组慢病毒表达载体,并且明显地抑制了胃癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进了胃癌细胞在饥饿胁迫及 TNF-α诱导情况下的凋亡。

  • 肝细胞生长因子受体c-met在甲状腺乳头状癌中的表达

    作者:王丽;刘泽兵;郑时玉;罗金芳;董军明

    目的 探讨肝细胞生长因子受体c-met在甲状腺乳头状癌中的表达及其形成中的作用.方法 采用免疫组化EnVision法检测35倒甲状腺乳头状癌切除标本中c-met的表达,并分析表达情况与临床病理指标之间的关系.构建c-met-siRNA慢病毒载体感染甲状腺乳头状癌K1细胞,裸鼠移植瘤实验观察肿瘤生长情况.结果 c-met在甲状腺乳头状癌中的阳性表达率为97.1%,与甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿组织中的表达差别有统计学意义(x2=20.4044,P< 0.05).c-met在甲状腺乳头状癌组织中的表达与患者年龄有关.裸鼠移植瘤实验显示c-met-siRNA组肿瘤体积较对照组显著缩小.结论 c-met可能在甲状腺乳头状癌的发生、发展中发挥作用,抑制其基因表达可以抑制裸鼠K1细胞移植瘤的生长.

  • 甲状腺髓样癌家系RET基因点突变质粒及稳定细胞系构建

    作者:陆凡倩;陈晓红;寇秀娟;白云龙;冯亚茹;杨静;王伯淳

    目的:构建中国大陆甲状腺髓样癌RET基因常见突变位点的质粒并验证其表达。方法分析中国大陆甲状腺髓样癌家系RET基因,进行RET基因外显子高通量“二代”测序分析。体外构建RET基因相应位点突变并研究在NIH3T3细胞中的表达水平。结果通过对野生型RET质粒进行点突变PCR、克隆测序后,成功获得相应位点点突变慢病毒质粒。经过慢病毒感染NIH3T3细胞,Western Blot验证目的基因为稳定表达。结论成功构建了载有RET基因突变的稳定细胞系,为研究RET不同位点突变提供了良好平台。

  • 慢病毒介导的Delta1-RNA干扰对人牙髓干细胞增殖及分化的影响

    作者:王雪飞;张纲;裘松波;何飞;谭颖徽;陈黔

    目的 探讨Notch配体Delta1基因的特异性RNA干扰(RNA interference,RNAi)对人牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC)增殖及分化的影响.方法 利用Delta1-RNAi慢病毒载体感染体外培养的DPSC获得稳定的Delta1-RNAi DPSC系;实验分3组:经Delta1-RNAi慢病毒感染的DPSC组(慢病毒组),经空慢病毒感染的阴性对照组和正常细胞的正常对照组,采用细胞生长曲线测定( cell counting kit-8,CCK-8)、流式细胞仪及免疫组化等方法检测细胞生长曲线、细胞周期、细胞核增殖抗原表达的变化情况;对各组细胞进行体外成牙本质分化诱导,采用茜素红染色法检测钙化结节数量的差别,并用碱性磷酸酶(ALP)活性检测ALP及蛋白质印迹法检测诱导后各组细胞中牙本质涎磷蛋白( dentin sialophosphoprotein,DSPP)表达量的区别.结果 与正常对照及阴性对照组相比,慢病毒组DPSC增殖能力显著降低,其S期细胞比例及增殖指数分别由正常对照组的22.32±2.35和33.68 ±4.19显著降低至5.44±0.91和16.0 ±6.07(P <0.05),细胞核增殖抗原的表达显著下降;慢病毒组细胞经诱导后形成钙化结节数量明显增多,ALP及DSPP表达含量较正常对照组及阴性对照组显著增高.结论 Notch配体Delta1基因被干扰下调后,人DPSC的体外增殖受到抑制,在体外成牙本质诱导培养条件下,细胞向成牙本质细胞的分化加快,证明Notch-Delta1信号转导途径对人DPSC的自我更新及分化的调控起着重要作用,为牙髓损伤后修复提供了理论基础.

  • Tmub1过表达及沉默慢病毒载体转染对大鼠BRL-3A肝细胞增殖的影响

    作者:赵晓彪;李光耀;刘孟刚;范霞;陈平

    目的 探讨Tmub1蛋白在肝细胞增殖中的作用.方法 分别使用Tmub1沉默慢病毒载体、Tmub1过表达慢病毒载体及对应的空载体转染大鼠BRL-3A肝细胞,得到稳定转染的细胞.转染后采用Western blotting检测Tmub1蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期.结果 转染LV-Tmub1慢病毒的肝细胞Tmub1蛋白表达明显增加,转染LV-Tmub1-RNAi慢病毒的肝细胞Tmub1蛋白表达明显降低,与正常肝细胞比较,差异均有统计学意义(P<0.01).转染LV-Tmub1慢病毒的肝细胞增殖快,转染LV-Tmub 1-RNAi慢病毒的肝细胞增殖慢,两组之间差异有统计学意义(P<0.01).过表达Tmub1慢病毒载体转染的肝细胞的G2+S期明显长于沉默Tmub1慢病毒载体转染的肝细胞,差异有统计学意义(P<0.01).结论 Tmub1蛋白可促进BRL-3A肝细胞的增殖.

  • 携带Bcl-2基因的慢病毒对原代培养的人卵巢颗粒细胞的影响

    作者:王雪峰;何援利;刘木彪;付霞霏

    目的 探讨携带Bcl-2基因的慢病毒对体外培养的原代人卵巢颗粒细胞感染效率及对细胞凋亡的影响.方法 构建携带Bcl-2基因的慢病毒载体,包装成高滴度慢病毒,将重组慢病毒在体外分别以不同感染复数(MOI)值(10、50、100、200、400)感染人卵巢原代颗粒细胞,观察感染24、48、72、96h后的感染效率及细胞增殖情况;将人卵巢颗粒培养24h后,分为3组.实验组:加MOI值为100的重组慢病毒GC-FU-Bcl-2;空白对照组:不加病毒;空载体对照组:加空载病毒GC-FU-EGFP.转染后第3、7天,采用Western blotting及反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测目的基因Bcl-2在人卵巢原代颗粒细胞中的蛋白及mRNA的表达水平.同时转染后第3天采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 原代培养的人卵巢颗粒细胞24h即贴壁,集落样生长,呈多角形或梭形;当MOI为100时,细胞的形态和生长不受影响,且感染效率较高,感染后72h达高峰,感染率达60%.携带Bcl-2基因的慢病毒感染靶细胞后,实验组中检测到Bcl-2基因及蛋白的表达,且卵巢颗粒细胞的凋亡率明显低于空载体对照组.结论 携带Bcl-2基因的慢病毒感染原代培养的人卵巢颗粒细胞后可过度分泌Bcl-2蛋白,抑制细胞凋亡.

  • 慢病毒颗粒包装、浓缩及对脐带血CD34~+细胞感染

    作者:王治东;葛常辉;许望翔;詹轶群;李长燕;曹萌萌;董波;杨晓明

    目的:建立慢病毒包装、浓缩及感染脐带血CD34~+细胞的条件方法.方法:采用第3代慢病毒系统包装病毒上清,结合超滤和超速离心两种方法对病毒进行浓缩.联合应用体外扩增培养,促进静止期细胞进入细胞周期、感染过程中促进细胞黏附和固定及重复感染等方法促进病毒感染.结果:CD34~+细胞体外培养48 h,细胞表面CD34标志物表达水平没有明显改变,通过两步法浓缩后,病毒滴度可达5.06×10~7/ml,对脐带血CD34~+细胞的感染效率可达37.7%.结论:通过上述方法可以获得滴度为10~7/ml以上的慢病毒上清,实现对脐带血CD34~+细胞的有效感染.

  • 干扰EphA3的慢病毒lentivirus-1504的构建及其对肝癌细胞7402抑制作用研究

    作者:李海量;王洪涛;赵亚丽;罗国兰;张晓清;薛萌;潘耀振;周建光

    目的 构建携带干扰癌基因EphA3的小干扰RNA(siRNA)慢病毒载体,并研究其对肝癌细胞7402的生长和迁徙的影响.方法 构建携带EphA3 siRNA的慢病毒载体质粒并将其与外源EphA3表达质粒共转染至人胚肾细胞293T中,Western 印迹检测其干扰EphA3蛋白表达的效果.将pSIH-H1-小发夹RNA(shRNA)-1504及空载体分别与3种包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒lentivirus-1504及对照慢病毒.将所获慢病毒分别感染肝癌细胞7402,并加入嘌呤霉素(puromycin)筛选,1周后将细胞收集.Western印迹检测EphA3蛋白的表达水平,然后分别应用MTT实验、平板克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验以及划痕实验检测敲低EphA3对肝癌细胞增殖能力、存活能力、恶性程度和迁移能力的影响.结果 lentivirus-1504抑制了7402细胞EphA3的表达,敲低EphA3后抑制了7402细胞的增殖能力、存活能力、恶性程度和迁移能力.结论 慢病毒lentivirus-1504能够明显抑制肝癌细胞7402的生长能力、存活能力、恶性程度和迁移能力,提示EphA3可能是一个新的肝癌治疗靶点.

  • 生长分化因子15过表达对心肌缺血再灌注的保护作用及与其自噬的关系

    作者:曹蕾;郭谦;王彰昭;张新然;焦建杰;何景华;强兆艳

    目的 通过构建生长分化因子15(GDF15)稳定过表达的心肌细胞株,探讨其对H9c2心肌细胞缺血/再灌注(I/R)损伤凋亡和自噬的影响.方法 建立H9c2 I/R损伤模型,用靶向GDF15过表达慢病毒和阴性空载体病毒转染H9c2细胞,筛选出GDF15稳定过表达细胞株.分为3组:对照组、空载体组和GDF15过表达组.用MTT法检测I/R后细胞存活率,以LDH试剂盒检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶活力,以免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax和自噬相关蛋白Beclin-l、LC3-B的表达.结果 I/R2 h,对照组、空载体组和过表达组的细胞存活率分别为(60.47 ±5.03)%,(63.21±17.13)%,(74.93±10.03)%,过表达组细胞活性较对照组与空载体组均增高,差异有统计学意义(P<0.01).对照组和过表达组LDH活力值分别为108.72±7.20,50.29±10.05,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).在I/R干预下,凋亡相关蛋白Caspase-3在对照组和过表达组的灰度值分别为99.73±0.61,67.68±0.47,过表达组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01).Bcl-2/Bax在对照组、空载体组和过表达组的灰度值分别为72.52±2.05,39.55±0.46,82.52±1.39,过表达组明显高于对照组和空载体组,差异有统计学意义(P<0.01).在I/R后,自噬相关蛋白Beclin-1在对照组、空载体组和GDF15过表达组的灰度值分别为58.93±0.64,36.71±0.35,88.39±0.72,过表达组明显高于对照组和空载体组,差异有统计学意义(P<0.01).LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在空载体组和GDF15过表达组的灰度值分别为2.11±0.02,3.32±0.04,过表达组明显高于空载体组,差异有统计学意义(P<0.01).结论 上调H9c2细胞的GDF15水平可保护H9c2大鼠心肌细胞,其作用机制可能通过促进细胞的自噬作用得以实现.

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