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玉米幼芽提取物凝露对小鼠皮肤成纤维细胞的毒性
玉米幼芽提取物(Extracts of maize plumule,EMP)是将玉米幼芽通过甲醇和醋酸混合液进行索式抽提,用PVPP柱进行去杂分离而获得的富含不同嘌呤衍生物的粗提物,有研究表明,外源性嘌呤类物质具有激素样特征,可对动植物机体起到抗氧化以及保护修复的作用[1-5],通过进一步研究发现,EMP能有效清除活性氧自由基,抗击氧化应激损伤,延缓皮肤细胞因过氧化作用带来的老化[6-7],EMP具有抗衰老的功效,但目前未见将其用作化妆品新原料的文献报道.
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pcDNA3.1(+)TPA构建及其在人皮肤成纤维细胞的表达活性
为建立TPA基因治疗缺血性心脏疾病及防止血管再狭窄的新方法.构建真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA,并采用脂质体法将其转入体外培养的人皮肤成纤维细胞,并观察外源性TPA表达情况.结果发现:真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA在人皮肤成纤维细胞中获有效表达,酶联免疫吸附法TPA蛋白表达定量检测结果为647.8 ng/(106细胞·24 h),未转pcDNA3.1(+)TPA的人皮肤成纤维细胞测得为19.2 ng/(106细胞·24 h);发色底物法测得外源性TPA活性为125.0 U/(106细胞·24 h),未转pcDNA3.1(+)TPA的人皮肤成纤维细胞测得为5.8 U/(106细胞·24 h).提示:pcDNA3.1(+)TPA转入人皮肤成纤维细胞后,外源性TPA基因获有效表达,为TPA基因治疗缺血性心脏病的临床研究提供了前提基础.
关键词： 组织型纤溶酶原激活因子 基因治疗 pcDNA3.1 皮肤成纤维细胞 缺血性心脏病 -
人眼球后和其它部位成纤维细胞的差异
研究表明，眼球后成纤维细胞活性增强在Graves眼病（Graves ophthalmopathy，GO）的发生中起重要作用。但是成纤维细胞具有多相性，不同部位成纤维细胞在相应部位疾病的发病中所起的作用不同。本文选用人眼球后和腹部皮肤成纤维细胞进行这方面的研究，初步探讨两种成纤维细胞在结构和功能方面的某些差异。 1 材料与方法 眼外肌（部分）及周围结缔组织取自一位22岁因眼外斜视手术的男性病人；腹部皮肤组织块取自一位9岁因脂肪瘤手术的男性儿童，患者均无自身免疫性疾病史。按照Bahn方法，进行原代和传代细胞培养。实验中为防止传代细胞某些功能发生较大变化，仅选用3～10代的细胞。在培养的两种成纤维细胞内（球后和皮肤成纤维细胞浓度各为6×104和4×104个cell/mL），分别加入不同药物，同时设不加药物的阴性对照，每个浓度设3或4个复孔。适时加入3H-TdR，后测定每分钟计数值。
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山羊耳皮肤成纤维细胞的传代培养及活力分析
目的研究体外传代培养山羊耳皮肤成纤维细胞活力及染色体倍性. 方法体外培养山羊耳皮肤成纤维细胞至17 代,并利用TUNEL原位分析、BrDU结合免疫标记以及低渗悬滴制备染色体的方法,对第5代和第17代细胞的细胞凋亡、DNA合成和染色体倍性进行了分析. 结果山羊皮肤成纤维细胞在体外能够传代到17代以上,85%以上(42/49 )的细胞染色体为正常的2倍体,并且与第5代的细胞相比较,细胞凋亡(1.75% vs 1.15%) 、DNA合成(17.43% vs 16.89%)都没有显著的变化(P>0.05). 结论长期传代培养(17代)的成纤维细胞的活力和DNA物质没有受到严重损伤,可以用来作为核移植的供体.
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牛-山羊异种克隆早期胚的分叶状线粒体
利用牛卵母细胞和山羊耳皮肤成纤维细胞制作异种克隆胚,分别于激活后1、36、44、60、144 h,观察发育情况,并收集原核期胚,2-细胞胚,4-细胞胚,8-细胞胚和桑甚胚.光镜检查各时期胚,分别选取形态良好的5枚,用2.5%的戊二醛固定24 h后,用1.5%锇酸后固定40 min,再用乙醇逐级脱水并用丙酮置换,Epon-812包埋,后包埋块放入烤箱内聚合(37℃,24 h,45℃,24 h;60℃,24 h).
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诱导多潜能干细胞研究应用新进展
诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPScells)技术是21世纪干细胞领域令人瞩目和期待的新兴干细胞制造技术.2006年8月,日本东京大学的Takahashi等[1] 从胚胎干细胞相关的24个基因中,筛选出4个基因(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4.),将它们同时导入小鼠皮肤成纤维细胞后.将小鼠体细胞重新编程为具有类似胚胎干细胞特点,并具备向3个胚层各类型细胞分化潜能的新型细胞.
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间充质干细胞和淋巴细胞分泌细胞因子的抗衰老功效研究
目的 探索体外扩增培养的间充质干细胞和淋巴细胞分泌的天然细胞因子对皮肤的抗衰老功效.方法 从健康产妇羊膜和新生儿脐带血单个核细胞分别提取扩增间充质干细胞和淋巴细胞,分别制备含人天然细胞因子的细胞提取物.检测提取物中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF-β1)、干细胞因子(SCF)、γ 干扰素(IFN-γ)含量和这两种提取物对人皮肤成纤维细胞(HFF-1)的促增殖活性以及促胶原蛋白合成能力.结果 两种细胞提取物中bFGF含量在20pg/mL左右,淋巴细胞提取物中TGF-β1及SCF含量在20pg/mL以上、IFN-γ 含量在80pg/mL以上;间充质干细胞提取物中TGF-β1含量在10pg/mL左右,SCF含量在40pg/mL左右、IFN-γ 含量在60pg/mL左右.两种细胞提取物均对体外培养的HFF-1细胞有明显促增殖作用,并能促进胶原蛋白的合成.结论 羊膜间充质干细胞提取物和淋巴细胞提取物均对皮肤细胞有抗衰老功效,bFGF、TGF-β1等细胞因子的含量检测及对体外培养的HFF-1促增殖实验可作为细胞提取物中细胞因子的活性评估指标.
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Smad交互蛋白1与瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的形成
本期“Smad交互蛋白1在增生性瘢痕组织中的表达及其对纤维化相关因子的影响”参考文献［13］：瘢痕疙瘩和增生性瘢痕是临床上常见的问题，以细胞外基质胶原过度和异常沉积为其特征。但瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的分子机制尚未完全清楚。这里，我们证明下调转录因子SIP1（Smad interacting protein 1）可能和瘢痕疙瘩和增生性瘢痕形成相关。近的研究结果显示在病理性瘢痕组织中SIP1的mRNA水平下降，经TGF-β1（transforming growth factorβ1）处理过的正常皮肤和病理性瘢痕的成纤维细胞SIP1的mRNA水平也下降。相反，在未增生的瘢痕组织中SIP1的mRNA的表达量没有降低。SIP1的mRNA的表达量和Ⅰ型胶原（type Ⅰ collagen）呈负相关，和基质金属蛋白酶1（matrix metalloproteinase-1）表达呈正相关。瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的成纤维细胞中过表达SIP1可抑制TGF-β1刺激的Ⅰ型胶原的表达和诱导的基质金属蛋白酶1表达。敲除正常皮肤成纤维细胞SIP1可提高TGF-β1诱导的Ⅰ型胶原的表达水平。这些发现证明SIP1能够调节皮肤纤维化，降低病理性瘢痕组织中的SIP1可上调Ⅰ型胶原水平和下调基质金属蛋白酶1水平。由此导致的细胞外基质胶原异常累积终形成病理性瘢痕。
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三维培养的人皮肤成纤维细胞的实验研究
目的探讨三维培养的人皮肤成纤维细胞的生物学特性,为其在皮肤组织工程中的应用提供进一步的实验依据.方法培养人皮肤成纤维细胞,制备鼠尾胶原;对人皮肤成纤维细胞进行三维培养,流式细胞仪检测细胞的增殖和凋亡,RT-PCR检测TGF β1、层粘连蛋白(fibronectin,Fn)mRNA的表达,电镜观察细胞的形态学特征.结果三维培养的人皮肤成纤维细胞增殖缓慢,未见明显细胞凋亡.RT-PCR检测二维、三维培养的人皮肤成纤维细胞TGF β1、Fn mRNA的表达无明显差异.电镜观察细胞染色质多,细胞器丰富.结论三维培养的人皮肤成纤维细胞增殖缓慢,但生物学活性良好.
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粘脂贮积症Ⅰ型酶学诊断与产前诊断
粘脂贮积症Ⅰ型是常染色体隐性遗传病,基因定位于10号染色体,是因为溶酶体α神经氨酸苷酶缺乏,导致涎酸大量贮积所致.粘脂贮积症Ⅰ型临床主要表现为Hurler样面容、骨骼发育不良,眼底红斑.该病常规实验室检查可发现,尿中不存在粘多糖,但含大量涎酸寡糖,淋巴细胞和骨髓细胞中有包涵体,皮肤成纤维细胞多含粗包涵体,其中多为中性多糖和粘脂.用检测酶活性的方法可对粘脂贮积症Ⅰ型进行病因学诊断与产前诊断.
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皮肤成纤维细胞Filipin染色诊断C型Niemann-Pick病
目的 建立皮肤成纤维细胞filipin染色诊断C型Niemann-Pick病(NPC)方法.方法 原代培养小鼠皮肤成纤维细胞,用脂蛋白缺乏血清(LPDS)培养5 d后,与人低密度脂蛋白(LDL)共培养24 h,经filipin染色并共聚焦照相.结果 纯合子小鼠(NPC-1-/-)小鼠组核周有密集的蓝色未酯化胆固醇聚集,而野生型小鼠(NPC-1+/+)核周无未酯化胆固醇聚集.结论 通过filipin染色可诊断NPC病.
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不同SOD1基因突变的肌萎缩侧索硬化患者皮肤成纤维细胞中突变蛋白表达及线粒体功能
目的 针对携带不同SOD1基因突变的肌萎缩侧索硬化(ALS)患者皮肤成纤维细胞进行SOD1突变蛋白表达和线粒体功能的探索.方法 活检获取2008-2012年北京大学第三医院神经内科门诊确诊的携带SOD1-V14M、SOD1-G16A、SOD1-C 111Y基因突变的家族性ALS患者及年龄性别相匹配的健康对照皮肤组织,培养并建立成纤维细胞系;采用PCR扩增和直接测序的方法测定基因突变位点;共聚焦免疫荧光检测细胞内SOD1蛋白聚集量及线粒体膜电位变化;流式细胞仪检测活性氧(ROS)水平.结果 携带SOD1-V14M、SOD1-G16A、SOD1-C111Y基因突变的ALS病人成纤维细胞出现胞质SOD1蛋白异常聚集,三组突变的SOD1蛋白的浆核比与对照组相比分别升高2.54、2.80及3.25倍;成纤维细胞线粒体膜电位△Ψm明显降低,红/绿荧光强度的比值相比对照组分别减少了36％、124％、142％;且细胞内ROS水平均较对照组增高了3.33、3.65、6.87倍.结论 在携带SOD1基因突变的ALS病人成纤维细胞内出现胞质SOD1蛋白异常聚集、线粒体功能异常及ROS水平改变,患者的外周组织成纤维细胞可作为ALS发病机制研究的有力工具,更益于将来可能的临床应用.
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皮肤成纤维细胞构建组织工程肌腱的实验研究
近年来,研究者们应用类似于骨髓基质干细胞的细胞作为组织工程肌腱的种子细胞[1-3],未获明显进展.皮肤成纤维细胞和肌腱细胞均来源于中胚层,细胞形态相似.如果成纤维细胞能取代肌腱细胞,作为种子细胞应用于肌腱组织工程则可望解决种子细胞缺乏的难题.作者曾应用成纤维细胞作为种子细胞修复肌腱缺损取得初步成功[4],但缺乏长期观察结果.本研究旨在长期观察皮肤成纤维细胞构建的组织工程肌腱,并与肌腱细胞作为种子细胞的组织工程肌腱进行比较.
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久效磷致大鼠皮肤成纤维细胞凋亡及氧化损伤的作用
目的 研究久效磷对体外培养的大鼠皮肤成纤维细胞凋亡及氧化损伤作用的影响。方法 取4只3日龄清洁级SD大鼠的背部皮肤，以组织块法培养大鼠皮肤成纤维细胞，正常传代。取第4代成纤维细胞，调整细胞密度为1.0×106/瓶，当细胞至亚融合状态，分别加入0（对照）、0.01、0.1、1μg/L的久效磷溶液培养6、12、24 h。采用流式细胞术检测大鼠皮肤成纤维细胞凋亡率；采用分光光度比色法检测皮肤成纤维细胞超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)含量。结果 0.1-1 μg/L久效磷染毒6、12、24 h时，大鼠皮肤成纤维细胞SOD、CAT活性均低于对照组(P＜0.05或P＜0.01),仅0.01 μg/L久效磷染毒24 h时SOD活力低于对照组（P＜0.05）。各浓度久效磷染毒大鼠皮肤成纤维细胞凋亡率和MDA含量均明显高于对照组(P＜0.05或P＜0.01)。随着久效磷染毒剂量的升高和染毒时间的延长，大鼠皮肤成纤维细胞SOD、CAT活力均呈下降趋势，而MDA含量和细胞凋亡率呈上升趋势。结论 久效磷可诱导大鼠皮肤成纤维细胞氧化损伤和细胞凋亡率增高。
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久效磷对大鼠皮肤成纤维细胞胶原Ⅰ和ⅢmRNA表达的影响
目的 研究久效磷对体外培养的大鼠皮肤成纤维细胞生长及胶原Ⅰ和Ⅲ合成的影响.方法取4只出生3d清洁级SD大鼠背部皮肤,以组织块法培养大鼠皮肤成纤维细胞,正常传代.取第4代成纤维细胞,按1.0×10(6)个/瓶接种于25 c㎡培养瓶中,当细胞至亚融合状态,分别加入0(对照)、0.01、0.1、1 μg/L的久效磷溶液,培养24 h,镜下观察细胞生长状况,收集各组细胞.采用实时定量PCR(RT-PCR)检测大鼠皮肤成纤维细胞胶原Ⅰ和ⅢmRNA的表达;采用噻唑兰(MTT)比色法检测皮肤成纤维细胞的细胞活性.结果久效磷对体外培养的皮肤成纤维细胞有显著的抑制作用,且抑制率呈剂量依赖性;;0.01、0.1、1 μg/L久效磷染毒组大鼠皮肤成纤维细胞抑制率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01).且随着久效磷染毒剂量的升高,大鼠皮肤成纤维细胞胶原Ⅰ和胶原ⅢmRNA的表达水平呈下降趋势;与对照组相比,0.01、0.1、1 μg/L久效磷染毒组大鼠皮肤成纤维细胞胶原Ⅰ和胶原ⅢmRNA的表达水平均下降,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01).结论久效磷可抑制大鼠皮肤成纤维细胞的生长,降低大鼠皮肤成纤维细胞胶原Ⅰ和ⅢmRNA的表达.
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虾青素对辛硫磷所致大鼠皮肤成纤维细胞氧化损伤的拮抗作用
目的 探讨虾青素对辛硫磷所致大鼠皮肤成纤维细胞氧化损伤及凋亡的拮抗作用.方法 取4只3日龄清洁级SD大鼠背部皮肤培养.取第4代成纤维细胞,正常对照组和辛硫磷氧化损伤组更换新鲜培养基,低、中、高剂量虾青素保护组分别更换含0.2、2、20 μg/L虾青素的培养基,于37℃、5％ CO2培养24h后,正常对照组更换新鲜培养基,辛硫磷氧化损伤组和各剂量虾青素保护组分别更换含10 μg/L辛硫磷的培养基,于37℃、5％ CO2培养24h.采用噻唑兰(MTT)比色法检测细胞存活率；采用流式细胞术检测细胞凋亡率；测定细胞超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)含量.结果 与对照组比较,辛硫磷染毒组和虾青素保护组大鼠皮肤成纤维细胞存活率和SOD、CAT活力下降,凋亡率和MDA含量升高.与辛硫磷染毒组比较,虾青素保护组大鼠皮肤成纤维细胞存活率和SOD、CAT活力较高,凋亡率和MDA含量下降；且随着虾青素剂量的升高,辛硫磷染毒大鼠皮肤成纤维细胞存活率和SOD、CAT活力呈上升趋势,凋亡率和MDA含量呈下降趋势.结论 虾青素对辛硫磷所致的大鼠皮肤成纤维细胞氧化损伤及凋亡具有明显的拮抗作用.
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欧亚旋覆花总黄酮对糖基化终末产物诱导L929细胞衰老及RAGE表达的影响
目的 探讨欧亚旋覆花总黄酮(IBFTF)对糖基化终末产物(AGEs)诱导小鼠皮肤成纤维细胞株L929衰老的保护作用,和AGEs特异性受体(RAGE)的表达机制.方法 采用0.100 g/L AGEs培养液刺激离体培养的L929细胞48h制备衰老模型,药物组分别给予不同质量浓度IBFTF (0.1、0.2、0.4 g/L)继续作用6h,阳性对照组给予0.1 g/L氨基胍半硫酸盐(AG)继续作用6h,对照组给予完全培养液.检测胞内β-半乳糖苷酶阳性染色细胞数量和细胞周期比例等衰老指标;检测胞内活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平等氧化应激指标.采用细胞免疫荧光检测RAGE荧光强度,Western blotting和qRT-PCR分别检测RAGE蛋白和mRNA表达情况.结果 IBFTF可显著抑制AGEs诱导的L929细胞衰老并降低RAGE的蛋白和mRNA表达水平;不同质量浓度IBFTF作用于衰老的L929细胞后,可显著提高细胞内SOD活性,显著降低MDA和ROS水平,具有浓度依赖性.结论 IBFTF对AGEs诱导衰老的L929细胞有保护作用,其机制可能是通过抑制RAGE表达来实现的.
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不同细胞饲养层对HL-60白血病细胞株增殖分化的影响
目的:研究不同细胞饲养层对HL-60白血病细胞株增殖的影响.方法:利用人的骨髓基质细胞(BMSC),皮肤成纤维细胞(SFB)及脐静脉内皮细胞株(ECV304)作为细胞饲养层,分别与HL-60白血病细胞株共培养5d,行细胞分类、计数检测HL-60细胞株的增殖分化情况.结果:BMSC及SFB饲养层均能抑制HL-60细胞株的增殖并促进其分化,BMSC略优于SFB饲养层,而ECV304细胞饲养层却无明显的促分化的作用,第五天才出现较弱的抑增殖作用.结论:BMSC及SFB饲养层能有效抑制HL-60癌株,可能是通过细胞与细胞间的接触或细胞因子、因素的近距离调节所致,ECV304该项能力较弱.
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枸杞多糖延缓小鼠皮肤衰老随机平行对照研究
[目的]观察枸杞多糖对小鼠皮肤的抗衰老作用.[方法]使用随机平行对照方法,分别灌胃给予D-半乳糖致衰老小鼠不同剂量的枸杞多糖,采用生化方法测定小鼠皮肤组织中成纤维细胞数目、皮肤组织含水量及H2O2含量.[结果]枸杞多糖的衰老小鼠皮肤组织中成纤维细胞数目与含水量明显高于衰老模型组,而H2O2含量则明显下降.[结论]D-半乳糖可造成小鼠皮肤衰老,枸杞多糖具有显著的抗小鼠皮肤衰老作用.
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不同牵拉方式对成纤维细胞增殖影响的研究
目的 建立一种模拟临床扩张术的细胞牵拉培养装置,比较不同牵拉方式对成纤维细胞增殖情况的影响,寻找能充分模拟临床扩张术的体外细胞牵拉培养方式.方法 自行设计一种可置入普通培养皿的细胞牵拉培养装置,将正常皮肤的成纤维细胞种植在弹性硅胶膜上,设计单次大牵拉组(共牵拉延长率达30％)、渐进式牵拉组(牵拉10％→停留→牵拉10％→停留→牵拉10％→停留,共牵拉延长率达30％)、非牵拉组,MTT法和Western Blot显示细胞增殖情况.结果 细胞在牵拉模型上生长良好,细胞被拉长,并与牵拉方向平行排列,30％延长度的牵拉能刺激细胞增殖,渐进式牵拉组对细胞的促增殖作用强于单次大牵拉组.结论 细胞在牵拉模型上生长良好,牵拉能刺激细胞增殖,模型可以用于模拟体外应力刺激细胞效应的实验研究.渐进式牵拉作用方式是模拟临床皮肤软组织扩张术较好的作用方式.
