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pcDNA3.1(+)TPA构建及其在人皮肤成纤维细胞的表达活性
为建立TPA基因治疗缺血性心脏疾病及防止血管再狭窄的新方法.构建真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA,并采用脂质体法将其转入体外培养的人皮肤成纤维细胞,并观察外源性TPA表达情况.结果发现:真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA在人皮肤成纤维细胞中获有效表达,酶联免疫吸附法TPA蛋白表达定量检测结果为647.8 ng/(106细胞·24 h),未转pcDNA3.1(+)TPA的人皮肤成纤维细胞测得为19.2 ng/(106细胞·24 h);发色底物法测得外源性TPA活性为125.0 U/(106细胞·24 h),未转pcDNA3.1(+)TPA的人皮肤成纤维细胞测得为5.8 U/(106细胞·24 h).提示:pcDNA3.1(+)TPA转入人皮肤成纤维细胞后,外源性TPA基因获有效表达,为TPA基因治疗缺血性心脏病的临床研究提供了前提基础.
关键词： 组织型纤溶酶原激活因子 基因治疗 pcDNA3.1 皮肤成纤维细胞 缺血性心脏病 -
多发性骨髓瘤黏蛋白-1基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达
本研究旨在构建多发性骨髓瘤黏蛋白1(两串联)基因(mucl-2vntr)的真核表达载体及该重组体在COS-7细胞中的表达,为研制多发性骨髓瘤基因疫苗奠定基础.以MUC1-2VNTR蛋白的编码基因作为目的基因,在其前端加上KOZAK序列后,两端分别加上HindⅢ和Xba Ⅰ酶的酶切位点,将人工合成的全基因定向插入pcDNA3.1/myc-his B载体中,转化E coli感受态细胞获得重组菌株,经酶切及测序鉴定为pcDNA3.1-2vntr/myc-his B重组质粒后,采用Lipofectimine脂质体介导法转染COS-7细胞,用荧光显微镜对荧光表达进行观察,然后用Western blot检测重组体在细胞内外的表达.结果表明:合成的MUC1-2VNTR基因全长约140 bp,所构建的pcDNA3.1-2vntr/myc-his B重组质粒经双酶切及测序鉴定后,与预期片段大小相符,并含有完整的阅读框架和目的基因.将其转入COS-7细胞后48小时,荧光显微镜和Western blot检测均可证实黏蛋白1表达.结论:成功的构建了多发性骨髓瘤真核表达载体pcDNA3.1-2vntr/myc-his B,并在COS-7细胞中成功地表达黏蛋白1,这为黏蛋白1的功能研究和多发性骨髓瘤基因疫苗的研制提供了实验基础.
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小鼠pcDNA3.1(+)-烯酰水合酶辅酶1真核表达质粒的构建及鉴定
淋巴道转移是影响上皮来源恶性肿瘤患者预后的重要因素[1],澄清其转移机制意义重大.烯酰水合酶辅酶1(enoyl coenzyme A hydratase 1,ECH1)是一种具有烯酰辅酶水合酶活性的酶,该基因表达于细胞的过氧化物酶体,与多种肿瘤相关.
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pcDNA3.1/eIF5A真核表达载体的构建及其在真核细胞CCRF-CEM中的表达
目的:摸索真核细胞翻译启动因子5A(eIF5A)编码基因的合成、pcDNA3.1/eIF5A真核表达载体的构建及其在真核细胞CCRF-CEM中的表达.方法:用PCR合成eIF5A基因,将基因分别接在克隆载体pMD 18-T的EcoR V多克隆位点上和真核表达载体pcDNA3.1的Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ的多克隆位点之间,构建eIF5A基因的克隆载体和真核表达载体,分别在大肠杆菌E.coli DH5α中转化并提取质粒,将真核表达载体pcDNA3.1/eIF5A的质粒提取后,用脂质体包合并转染真核细胞CCRF-CEM,用流式细胞仪对eIF5A的表达水平进行检测.结果:eIF5A在CCRF-CEM细胞中的表达水平为107.03,eIF5A在转染细胞CCRF-CEM/trans中的表达水平为114.27,表达升高.结论:本实验构建了pcDNA3.1/eIF5A真核表达载体,发现其在CCRF-CEM细胞中高表达.本实验结果将有助于探讨肿瘤治疗过程中的新靶标.
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PcDNA3.1/hTSHRa重组体的构建
目的:构建重组体pcDNA3.1/hTSHRa.方法:提取人正常甲状腺组织总RNA,逆转录后进行PCR,将纯化的扩增产物hTSHRa与表达载体pcDNA3.1TOPO连接后转化TOP10 E.coli感受态菌.重组质粒经PCR、Hind Ⅲ酶切和核苷酸序列测定方法进行鉴定.结果:PCR扩增得到hTSHR膜外区N端753bp的基因片段hTSHRa.该片段与表达载体pcDNA3.1TOPO连接后转化TOP10 E.coli感受态菌.重组质粒经PCR、Hind Ⅲ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHRa片段插入序列和方向正确.结论:hTSHRa片段插入真核表达载体pcDNA3.1TOPO,插入序列和插入方向正确,可用于后续基因表达.
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PcDNA3.1/hTSHR1043～1354 bp重组体的构建及在中国仓鼠卵巢细胞中的表达
目的 构建重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354 bp及在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达hTSHR膜外区氨基酸314～418蛋白分子.方法 提取人正常甲状腺组织总RNA,反转录后进行聚合酶链反应(PCR),将纯化的扩增产物hTSHR1043～1354 hp与表达载体pcDNA3.1连接后转化TOP10 E.coli感受态菌.经PCR、Hind Ⅲ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定插入序列和方向正确的重组质粒转染CHO细胞,并用Western blot方法鉴定表达的蛋白.结果 PCR扩增得到hTSHR膜外区C端312 bp的基因片段hTSHR1043～1354 bpo该片段与表达载体pcDNA3.1的连接后转化TOP10 E.coli感受态菌.重组质粒经PCR、Hind Ⅲ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHR1043～1354 bp片段插入序列和方向正确.重组质粒转染的CHO细胞裂解液经Western blot可以检测出15 900的蛋白条带,与预期的蛋白相对分子质量相符.结论 成功构建了重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354 bp,其转染CHO细胞后表达15 9 000的目的蛋白(hTSHR氨基酸314～418蛋白片段).
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HBV X基因真核表达载体的构建研究
目的:构建HBV X基因与pCDNA3.1相融合的高效真核表达载体,为进一步研究HBV X基因的功能奠定基础.方法:设计并合成HBV X基因的引物,从HBV DNA阳性的血清中,PCR扩增得到HBV X基因全序列,将其连接到真核表达载体pCDNA3.1上后,酶切图谱分析PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体.结果:以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBV X基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同.结论:成功构建了HBV X基因的真核表达载体,为下一步研究HBV X基因及其产物的功能奠定了基础.
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hTSHR188-403bp基因免疫BALB/c小鼠建立Graves'病动物模型
目的:构建pcDNA3.1/hTSHR(188～403 bp)重组质粒,并将其基因免疫BALB/c小鼠建立Graves'病动物模型.方法:RT-PCR扩增hTSHR膜外区188～403 bp,与pcDNA3.1载体连接,构建重组质粒pcDNA3.1/hTSHR,用酶切、PCR及测序方法进行鉴定.于1、4、7、9、10周将重组体免疫实验组小鼠,对照组注射生理盐水,0、6、11周取血,检测血清TRAb、T4、TSAb、TBAb.取甲状腺常规病理切片,HE染色镜检.结果:构建的重组质粒经酶切、PCR鉴定证明插入方向正确,测序结果与GeneBank中hTSHR的相应片段序列相同.免疫组T4、TRAb和TSAb水平均从第6周开始显著升高(P＜0.05),TBAb差异无统计学意义(P＞0.05),对照组差异均无统计学意义(P＞0.05).实验组甲状腺病理检查结果,显示滤泡增生,胶质浓缩等Graves'病的病理表现,对照组形态正常.结论:构建了重组质粒pcDNA3.1/hTSHR(188～403 bp),成功建立了类Graves'病动物模型.
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真核表达质粒pcDNA3.1-CSRP2-HA的构建及鉴定
目的:构建并鉴定真核表达质粒PcDNA3.1-CSRP2-HA.方法:据GeneBank 中人CSRP2 CDS序列设计并合成引物,提取A549细胞总RNA,并将其逆转录成cDNA作为模板,进行PCR扩增,获得CSRP2目的基因后,再与PcDNA3.1-HA载体进行连接重组,构建PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒,经限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测序分析等方法鉴定后,瞬时转染入A549细胞,Western blot法检验CRP2蛋白表达.结果:成功构建PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒,Western-blot结果显示PcDNA3.1-CSRP2-HA能够在A549细胞中表达.结论:PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒构建并鉴定成功,为后续研究CRP2在炎症诱发氧化损伤机制中的转录调控作用奠定了基础.
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pcDNA3.1(+)—增强型绿色荧光蛋白在大鼠鞘内注射的表达
目的:构建重组质粒pcDNA3.1(+)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)并观察其在大鼠体内的转染部位及表达时间.方法:构建重组质粒pcDNA3.1(+)-增强型绿色荧光蛋白后直接注射到正常大鼠的蛛网膜下腔,观察其在大鼠体内转染后的时空效应.结果:双酶切结果符合真核表达载体pcDNA3.1(+)约5.4kb, EGFP约750bp,另外测序分析与文献报道结果完全一致;动物实验结果表明,鞘内注射24h后在大鼠的脑脊膜和脊神经的外膜上有EGFP表达,在14d达到高峰,4周后明显下降,第7周消失;在实验组大鼠的心、肝、脾、肺、肾及股四头肌均没有绿色荧光.对照组所有取材部位均没有绿色荧光.结论: 重组质粒pcDNA3.1(+)-EGFP通过直接注射法被成功转染至大鼠的蛛网膜下腔,且外源基因得到了表达.
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Ⅰ型单纯疱疹病毒在潜伏期表达微RNA以调控病毒自身mRNA的表达
Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)全长10.8 kb,其在潜伏期中,不表达任何病毒源性的蛋白产物,仅表达潜伏相关转录本(LAT).论文作者将8.3Kb的LAT构建入PCDNA3.1载体中并将其转入293T细胞,随后从其总RNA中分离小片段RNA并进行454测序,共测得225 439个小片段RNA序列,其中144 955个序列为细胞内微RNA,有651个微RNA读数可能来源于HSV-1.根据HSV-1茎环结构前体序列预测,这些读数来源于HSV-1的4个茎环结构前体,为6个HSV-1表达的微RNA.其中,读数多的为miR-H2-3p(265)和miR-H4-3p(266).
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降钙素基因相关肽真核表达载体pcDNA3.1/CGRP的构建
目的 构建带有大鼠降钙素基因相关肽基因(rCGRP)的重组真核表达载体pcDNA3.1(+)/rCGRP.方法 应用Trizol试剂从SD大鼠脑组织提取总RNA,RT-PCR扩增rCGRPcDNA(PCR引物上加上双酶切位点),产物通过Hind Ⅲ和BamH I酶切、纯化、连接,将目的 基因插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+),再将重组质粒转化感受态细菌,通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,再经PCR、酶切和测序鉴定所得克隆.结果 (1)RT-PCR产物电泳分析扩增产物行1%琼脂糖凝胶电泳后可见一条特异的片段,和rCGRPcDNA大小相吻合;(2)重组克隆鉴定①PCR鉴定.PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳后可见一条特异的片段,和rCGRPcDNA大小相吻合;②酶切鉴定,抽提质粒经双酶切.酶切产物行1%琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪下可见两特异性条带,分别和pcDNA3.1(+)和rCGRPcD-NA大小相吻合;③DNA测序,测序结果经BLAST分析,与rCGRP基因编码区全长序列完全一致.结论 (1)大鼠脑组织中有rCGRP的表达;(2)通过RT-PCR及基因重组技术成功构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)/rCGRP.
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pcDNA3.1-AKR1B10真核表达载体的构建
从胰腺癌PaTu8988S细胞中提取总RNA,并克隆AKR1B10基因,构建pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体.转化感受态大肠杆菌DH5α细胞,提质粒,酶切及测序鉴定,pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体构建成功.
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Notch1基因C端特征结构域pcDNA3.1-AN真核表达载体的构建
目的:扩增人胎盘组织Notch1基因C端特征性结构域ANK和NLS(简称AN),并构建pcDNA3.1-AN真核表达载体.方法:按照GenBank中Notch1序列,设计-对引物,利用RT-PCR方法从人胎盘组织中获取AN cDNA片段,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-AN.结果:所获得的序列是Notch1特征性的AN结构域.结论:成功构建了pcDNA3.1-AN真核表达载体.
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pcDNA3.1-FKBP12.6基因表达载体的构建及扩增
目的 构建并扩增pcDNA3.1-FKBP12.6基因表达载体.方法 目的基因全基因合成,PCR加入酶切位点,连接入pGEM-T easy载体,经酶切鉴定及测序后获得测序正确的目的基因.连接入真核表达载体pcDNA3.1(-),再经酶切鉴定及测序后进行peDNA3.1-FKBP12.6的扩增.结果 成功构建并扩增pcDNA3.1-FKBP12.6基因表达载体.结论 pCDNA3.1-FK-BP12.6表达载体的构建,为深入研究FKBP12.6基因对心肌细胞结构和功能的影响奠定基础,进而为探索安全、高效的心肌功能异常的治疗提供新的途径.
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Gadd45a表达质粒的构建及在人类T细胞中的表达
目的:构建Gadd45a表达质粒,并诱导该质粒在人类T细胞中的表达.方法:采用反转录PCR法从人胚胎干细胞中扩增Gadd45a的蛋白质编码框,将之克隆至pcDNA3.1载体后,利用电穿孔方法将构建好的表达质粒pcDNA3.1-Gadd45a和空白质粒pcDNA3.1分别转染至Jurkat细胞或正常人CD4+T细胞,分别用荧光定量RT-PCR和Western blot的方法检测转染后细胞Gadd45a mRNA和蛋白的表达.结果:成功构建Gadd45a表达质粒pcDNA3.1-Gadd45a,转染该质粒的Jurkat和正常人CD4+T细胞均显示Gadd45a过表达.结论:Gadd45a表达质粒的构建及诱导其在人T细胞中的过表达为进一步研究Gadd45a在表观遗传学机制中的作用提供了研究基础.
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真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA的建立及其在人皮肤成纤维细胞的表达活性
目的:建立在人皮肤成纤维细胞中稳定表达的细胞株,为组织型纤溶酶原激活因子(TPA)功能分析和对缺血性心脏疾病基因治疗提供理论依据.方法:构建真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA,然后将其转入人皮肤成纤维细胞,经G418筛选后,用RT-PCR,ELISA和发色底物法观察外源性TPA表达情况.结果:真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA在人皮肤成纤维细胞中获有效表达,酶联免疫吸附法TPA蛋白表达定量检测结果为每24小时643.5 ng/106个细胞,高于未转pcDNA3.1(+)TPA的皮肤成纤维细胞每24小时19.2 ng/106个细胞;发色底物法测得外源性TPA活性为每24小时122.6 U/106个细胞,亦高于未转pcDNA3.1(+)TPA的皮肤成纤维细胞每24小时5.8 U/106个细胞.结论:pcDNA3.1(+)TPA转入人皮肤成纤维细胞后,外源性TPA基因获有效表达,该细胞模型将成为TPA功能研究和缺血性心脏病基因治疗的重要方法.
关键词： 组织型纤溶酶原激活因子 基因治疗 pcDNA3.1 皮肤成纤维细胞 缺血性心脏病 -
pcDNA3.1-mAFP真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达
目的 构建真核表达载体pcDNA3.1-mAFP,观察其在293肿瘤细胞中的表达情况.方法 从Hepa1-6 小鼠肝癌细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增小鼠甲胎蛋白(mAFP)基因编码区全长序列,测序确认后,插入到pcDNA3.1真核表达载体中,双酶切鉴定.用Lipofectamine脂质体将构建的重组载体转染293肿瘤细胞,检测AFP蛋白在293细胞中的表达情况.结果 成功克隆了mAFP基因编码区全长序列,构建出重组真核表达载体pcDNA3.1-mAFP,脂质体转染后可检测到mAFP基因在293细胞中的表达.结论 该研究成功构建了重组pcDNA3.1-mAFP真核表达载体,为进一步开展原发性肝癌的靶向性基因治疗奠定了基础.
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pcDNA3.1(+)TPA构建及其在人脐静脉内皮细胞的表达活性研究
目的建立TPA基因在人脐静脉内皮细胞外源性表达的方法,为缺血性心脏疾病的基因治疗及防止血管再狭窄提供理论依据和新方法.方法构建真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA,并采用脂质体法将其转入体外培养的人脐静脉内皮细胞,并观察外源性TPA表达情况.结果真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA在人脐静脉内皮细胞中获有效表达,酶联免疫吸附法TPA蛋白表达定量检测结果为568.6ng/106细胞/24h,未转pcDNA3.1(+)TPA的人脐静脉内皮细胞测得为17.8ng/106细胞/24h;发色底物法测得外源性TPA活性为108.8IU/106细胞/24h,未转pcDNA3.1(+)TPA的人脐静脉内皮细胞测得为5.6IU/106细胞/24h.结论 pcDNA3.1(+)TPA转入人脐静脉内皮细胞后,外源性TPA基因获有效表达,为缺血性心脏病的TPA基因治疗提供了理论依据和新方法.
关键词： 组织型纤溶酶原激活因子 基因治疗 pcDNA3.1 脐静脉内皮细胞 缺血性心脏病 -
结核杆菌HSP70真核表达载体的构建
目的：构建结核杆菌HSP70重组真核表达质粒。方法：用PCR方法从结核杆菌H37RV基因组中扩增出结核杆菌HSP70基因NDA序列，应用T-A克隆技术，克隆到质粒GPEM-G vector,经DNA测序证实基因碱基无误后，亚克隆到真核表达质粒PCDNA3.1(+)，构建成PCDNA3.1-HSP70重组质粒。结果：经酶切鉴定，证实重组质粒构建正确。结论：结核杆菌HSP70真核表达载体构建成功。
