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小鼠甲胎蛋白和4-1BB配体融合基因疫苗对树突状细胞生物学特性的影响
目的 观察感染小鼠甲胎蛋白(mAFP)和4-1BB配体(m4-1BBL)融合基因对小鼠树突状细胞(DC)生物学特性的影响.方法 构建含mAFP和m4-1BBL的融合基因腺病毒Ad-mAFP-内部核糖体起始位点(IRES)-m4-1BBL,感染H22肝癌细胞,Western blot法检测mAFP和4-1BBL蛋白的表达；诱导培养DC,并将其分为实验组、载体对照组和阴性对照组,以上各组感染后观察DC形态学变化；流式细胞仪检测各组细胞表型；混合淋巴细胞反应(MLR)检测各组DC的刺激活性以及对T细胞分泌干扰素(IFN)-γ的影响.结果 成功构建融合基因重组腺病毒Ad-mAFP-IRES-m4-1BBL并表达于H22细胞；体外诱导培养获得典型的DC；流式细胞仪检测各组DC感染后的细胞表型,实验组DC细胞CD80[(60.7±8.7)％]、CD86[(67.0±4.6)％]表达率显著增高于其余两组(P＜0.05),刺激T细胞增殖能力(0.66±0.05)亦显著增强(P＜0.05),刺激T细胞分泌IFN-γ[(1280.7 ±68.2) ng/L]水平更高(P＜0.05).结论 成功构建含mAFP及4-1BBL融合基因腺病毒疫苗,其感染DC后刺激T细胞增殖和分泌IFN-γ的能力增强.
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一种新的重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-mAFP的构建
目的 构建表达小鼠甲胎蛋白(murine alpha fetoprotein,mAFP)基因的重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-mAFP,并测定其滴度.方法 从Hepa1-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增mAFP基因,测序确认后,插入到pAdBM5-GFP穿梭载体中,双酶切鉴定重组腺病毒载体.线性化重组腺病毒载体与病毒骨架DNA质粒用磷酸钙共沉淀法共转染HEK293A细胞,通过同源重组使腺病毒表达mAFP基因,并在HEK293A细胞中大量扩增含目的基因的重组腺病毒,用TCID50法测定重组腺病毒滴度.结果 成功克隆了小鼠mAFP基因,构建出表达mAFP基因的重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-mAFP,获得了表达mAFP基因的重组腺病毒,病毒滴度达3.2×108PFU/ml.结论 本研究成功构建了pAdBM5-GFP-mAFP载体,获得了高滴度表达mAFP基因的重组腺病毒,为进一步开展肝癌的免疫基因治疗奠定了基础.
关键词： pAdBM5-GFP 小鼠甲胎蛋白 重组腺病毒载体 -
pcDNA3.1-mAFP真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达
目的 构建真核表达载体pcDNA3.1-mAFP,观察其在293肿瘤细胞中的表达情况.方法 从Hepa1-6 小鼠肝癌细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增小鼠甲胎蛋白(mAFP)基因编码区全长序列,测序确认后,插入到pcDNA3.1真核表达载体中,双酶切鉴定.用Lipofectamine脂质体将构建的重组载体转染293肿瘤细胞,检测AFP蛋白在293细胞中的表达情况.结果 成功克隆了mAFP基因编码区全长序列,构建出重组真核表达载体pcDNA3.1-mAFP,脂质体转染后可检测到mAFP基因在293细胞中的表达.结论 该研究成功构建了重组pcDNA3.1-mAFP真核表达载体,为进一步开展原发性肝癌的靶向性基因治疗奠定了基础.
