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HFRS患者BLCL的建立及HTNV S基因片段在其内获得长期稳定的表达
虽然对汉坦病毒核蛋白(HV NP)氨基端蛋白的原核表达产物的抗原性及免疫原性已进行了许多研究,并已用于出血热的诊断,但该抗原表位的精确一级结构及其基因定位迄今尚未完全明确.而研究T细胞表位的前提是首先要构造含病原体抗原基因片段的表达载体质粒.要实现CTL效应细胞对靶细胞的有效杀伤,前提条件之一是效靶细胞必须具有相同的HLA型别.通常选用与效应细胞同源即同一供者的PBMC建立靶细胞,本研究采用与HV特异性CTL同源的患者自身的EB病毒转化的B淋巴母细胞系(EBV-transformed B lymphoblastoid cell line,BLCL)建立靶细胞系,将含有不同汉滩病毒(HTNV)S基因片段的重组真核表达载体转染入BLCL,获得长期稳定表达,为下一步进行CTL杀伤试验提供靶细胞系.
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pMAGE-Al/EGFP转染的人树突状细胞体外诱导特异性抗肿瘤免疫效应的研究
树突状细胞(DC)是目前已知功能强的抗原提呈细胞,被广泛应用于研制各种肿瘤疫苗[1].肿瘤特异性抗原MAGE-Al在不同来源肿瘤组织中有较高表达[2],因而在肿瘤免疫治疗中一直备受重视.本实验中我们构建了重组真核表达载体pMAGE-Al/EGFP,体外电转染人人外周血单核细胞来源DC,并评价其体外诱导特异性抗肿瘤免疫的能力,以期为临床开展MAGE-Al为基础的免疫治疗提供有利的分子生物学工具.
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重组人内皮抑素真核表达载体pCD-sEndo的构建和表达
目的:构建表达人内皮抑素的重组真核表达载体,并将其转染人肝癌SMMC-7721细胞,观察其体外抑制血管生成的活性.方法:将含有IL-2分泌肽的人endostatin全长cDNA插入真核表达载体pcDNA3.0产生重组质粒pCD-sEndo,利用阳离子脂质体介导将其体外转染人肝癌细胞SMMC7721细胞,G418筛选后得到阳性克隆,并被命名为SMMC/sEndo,采用western-blot检测转染细胞上清中endostatin蛋白的表达,鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成实验检测转染细胞上清中内皮抑素蛋白的生物活性.结果:成功构建endostatin基因的真核表达质粒pCD-sEndo并经酶切和序列测定证实,通过阳离子脂质体转染SMMC-7721细胞,Western-blot显示转染细胞上清有人endostatin蛋白的表达,Mr20000,而转然空质粒对照组未检测到目的蛋白.CAM实验显示在给予内皮抑素蛋白的鸡胚绒毛膜血管稀疏,血管密度明显减少,并且随着蛋白量的增加,血管减少程度加强.结论:重组endostatin真核表达质粒构建正确,转染SMMC-7721细胞后可有效表达具有生物学活性的人endostatin蛋白并能分泌到细胞外.
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乙型肝炎病毒核心启动子部分缺失真核表达载体的构建及对病毒抗原表达的影响
乙型肝炎病毒核心启动子(CP)部分缺失变异已证实在几种HBV感染的临床现象中存在[1-3].我们在一组14例血清抗-HBe阳性的无症状携带者中,发现有9例在nt1748(或nt1747)至nt1767间20(或21)个核苷酸的缺失,此9例中有5例合并有nt1896G→A点变异[4].本研究在此基础上,拟构建这种CP 20/21 bp缺失及合并存在A1896点变异的HBV全基因重组真核表达载体,并转染HepG2细胞,以研究此类变异株对病毒抗原表达的影响.
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重组MAGE-A1/EGFP质粒转染人树突状细胞体外诱导MAGE-A1特异性T细胞免疫
目的:应用人重组真核表达载体pMAGE-A1/EGFP转染的树突状细胞(DCs)在体外诱导MAGE-A1特异性T细胞免疫.方法:构建重组质粒pMAGE-A1/EGFP,体外电转染该质粒入DCs,通过流式细胞仪检测和胞内染色法LDH法比较转染前后DCs在蛋白表达、细胞成熟度和诱导MAGE-A1特异性T细胞免疫能力的差异.结果:成功构建pMAGE-A1/EGFP真核表达质粒,电穿孔法导入DCs后观察到MAGE-A1与EPFG实现等效表达,分别为8.8%±0.9%和8.47%±0.78%.pMAGE-A1/EGFP转染的DCs表面CD86、CD40L和CD83表达水平显著升高,提示DCs的成熟度增加;同时表达的MAGE-A1蛋白可与小鼠来源抗MAGE-A1的单抗发生特异性结合,并在体外诱导MAGE-A1特异性CD4+T细胞克隆扩增,当再次接触MAGE-A1抗原时大量分泌IFN-γ.结论:pMAGE-A1/EGFP转染的DCs不仅能在体外诱导MAGE-A1特异性T细胞免疫,还可通过流式细胞仪进行快速检测,为临床开展MAGE-A1为基础的免疫治疗奠定了一定基础.
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抗阿尔茨海默病重组真核表达载体的构建
目的:将淀粉样蛋白N端的抗原表位基因以4种不同的组合与小鼠IgG重链区基因融合,构建抗阿尔茨海默病的重组质粒.方法:通过RT-PCR技术从小鼠脾组织中克隆IgG重链区cDNA,将柔性接头与抗原表位基因序列设计在5′端引物中,然后以克隆出的小鼠IgG重链区cDNA为模板,用PCR法克隆出由柔性接头将抗原表位和IgG重链区基因融合在一起的序列,并插入到pVAX质粒载体中.结果:扩增出来的4种不同组合的抗原表位基因和IgG重链区基因融合序列大小分别为999、1 020、1 005、1 026 bp,均与GenBank上登录的相符;pVAX重组质粒酶切结果表明融合基因正确地插入到pVAX载体中,全自动测序亦显示抗原表位基因和IgG重链区基因为所需基因,接头序列也完全正确.结论:成功构建了抗阿尔茨海默病的4种表位基因-IgG重链区融合表达的重组质粒,为探索防治阿尔茨海默病打下基础.
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构建降钙素基因相关肽真核表达质粒pLXSN-CGRP
降钙素基因相关肽(CGRP)是目前体内强的扩血管物质[1],对心脑血管有很强的扩张作用.pLXSN载体是一种高效的真核表达载体.我们将大鼠CGRPcDNA插入到多克隆位点,构建重组真核表达载体pLXSN-CGRP.
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pcDNA3.1-mAFP真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达
目的 构建真核表达载体pcDNA3.1-mAFP,观察其在293肿瘤细胞中的表达情况.方法 从Hepa1-6 小鼠肝癌细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增小鼠甲胎蛋白(mAFP)基因编码区全长序列,测序确认后,插入到pcDNA3.1真核表达载体中,双酶切鉴定.用Lipofectamine脂质体将构建的重组载体转染293肿瘤细胞,检测AFP蛋白在293细胞中的表达情况.结果 成功克隆了mAFP基因编码区全长序列,构建出重组真核表达载体pcDNA3.1-mAFP,脂质体转染后可检测到mAFP基因在293细胞中的表达.结论 该研究成功构建了重组pcDNA3.1-mAFP真核表达载体,为进一步开展原发性肝癌的靶向性基因治疗奠定了基础.
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pRluc-hKOR-pcDNA3.1 真核重组质粒的构建及在HEK293细胞中的表达
目的: 构建与海肾荧光素酶(renilla luciferase,Rluc)融合的人κ型阿片受体(kappa opioid receptor, KOR)的真核表达载体,用于生物发光共振能量转移法检测人KOR与其它受体间的相互作用.方法: 以质粒pcDNA3.1-hKOR为模板,PCR方法扩增人KOR.扩增的人KOR用NotⅠ和XhoⅠ双酶切,同时用这2种酶双酶切质粒pRluc-pcDNA3.1.然后将这2种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10.挑取菌落培养,提取质粒,然后进行酶切鉴定,后进行测序.将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾(human embryonic kidney 293,HEK293) 细胞,免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察.结果: 扩增出了1条约1.2 kb的片段,与预期的人KOR大小相符,质粒酶切结果显示重组质粒 pRluc-hKOR-pcDNA3.1被切成2条片段,其中1条为pRluc-pcDNA3.1载体大小,另1条为目的片段大小.经测序鉴定,序列与GenBank (NM_000912)中的序列高度同源.共聚焦显微镜观察显示,阿片受体主要表达在细胞膜上.结论: 构建成功了pRluc-hKOR-pcDNA3.1重组真核表达载体,此表达载体可用于检测人KOR与其它受体之间的相互作用.
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重组人β-防御素-2基因COS-7细胞的转染表达
目的:通过构建两种SV40系列的重组载体,即N端带Flag标签的重组hBD-2基因和C端带Myc和6xHis双标签的重组hBD-2,并转染COS-7细胞,探索建立既能持续有效地表达和分泌hBD-2、其表达产物又易于被检测和分离纯化的哺乳类动物细胞表达系统的可能性及技术路线.方法与结果:(1)将hBD-2全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV.tag2B构建出hBD-2的上游带Flag报告基因的重组表达载体pCMV.tag2B/hBD-2,经DNA测序证明:hBD-2cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的碱基组成顺序均准确无误.(2)hBD-2全长cDNA片段插入编码双重标签基因Myc和6xHis的真核表达质粒pcDNA3.1/Myc-His(+),构建出C端带Myc和6xHis双重标签的重组真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2.DNA测序结果表明:hBD-2cDNA片段插入方向和全长cDNA的碱基组成顺序均准确无误.(3)采用脂质体转染法分别将以上两种重组真核表达载体导入COS-7细胞,分别从mRNA和蛋白质水平分析hBD-2的表达情况.并检测经重组真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2转染细胞的可溶性蛋白及其培养上清的抗菌活性.(4)采用RT-PCR法对经带Flag报告基因的重组表达载体pCMV.tag2B/hBD-2转染的COS-7细胞的总RNA进行RT-PCR扩增,结果扩增出一条约240 bp的cDNA片段,其大小与预测相符.经Western blot法检测到细胞可溶性蛋白在约10 kD处有强反应条带显示.(5)用特异性引物(hBD2p6/hBD2p7)对经pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2转染的COS7细胞的总RNA进行RT-PCR扩增,用抗标签基因His表达产物的特异性抗体,经Western blot法检测到细胞蛋白在约10 kD处有强反应条带显示,其大小与该重组质粒结构中由pCMV启动子驱动的基因片段有可能表达成肽链的分子量(10.1)相符.双层肉汤琼脂平板扩散法抑菌试验结果表明:分别与正常COS-7细胞的细胞可溶性蛋白及其培养上清比较,转染pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2的COS-7细胞的细胞可溶性蛋白及其培养上清在金黄色葡萄球菌质控菌株25 923的平板上形成明显的抑菌环.结论:(1)N端带Flag标签基因重组真核表达载体pCMV.tag2B/hBD-2已被成功构建和转染COS-7细胞.通过RT-PCR法和Western blot法证实hBD-2基因已在COS-7细胞内持续有效地表达.(2)C端带双重标签基因Myc和6xHis的真核表达质粒pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2已被成功构建和转染COS-7细胞.通过RT-PCR法、Western blot法和体外抗菌实验证实,该系统不仅能有效地表达和分泌具抗菌活性hBD-2,也为其表达产物的检测、分离纯化提供了必要条件.
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正常成人肝组织中BMP-9读码框架的克隆
目的 获得骨形态发生蛋白(BMP-9)基因并进行基因读码框架的克隆.方法 自正常成人肝组织提取总RNA,一步法RT-PCR扩增BMP-9,扩增产物经过胶回收及酶切后,克隆人高效真核表达质粒pcDNA4/HisMax,构建重组表达载体.结果 RT-PCR扩增获得约1.3kb大小的产物,经限制性酶切分析和DNA测序,证实为人BMP-9基因的完整开放读码框架.重组载体表达读码序列正确.结论 正常成人肝组织总RNA经一步法RT-PCR,能够对BMP-9基因的开放读码框架进行完整有效的筛选.BMP-9开放读码框架的完整克隆为其在骨、内分泌和神经系统等多能作用的转基因实验研究提供了基础.
