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人TSLC1基因核心启动子的克隆和鉴定
目的 克隆和鉴定人TSLC1基因的核心启动子区,用于开展其转录调控机制的研究.方法 用PCR方法从人基因组DNA中扩增出TSLC1基因翻译起始位点上游一系列大小不等的片段,连入pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体中.通过瞬时转染A549及NCI-H446细胞,检测细胞裂解液中的双荧光素酶活性,确定TSLC1基因的核心启动子区.结果 在人TSLC1基因启动子区的分段克隆中,ATG上游-68～-329 bp片段在A549及NCI-H446细胞中均具有很强的启动活性,对TSLC1的转录起重要作用.结论 人TSLC1基因翻译起始位点ATG上游-68～-329 bp区域可能为基因的核心启动子区.
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乙肝病毒核心启动子部分缺失对其活性及X蛋白转式激活作用的影响
目的研究乙型肝炎病毒(HBV)20/21bp缺失(nt1 748/1 747～nt 1 767)的核心启动子(CP)的活性及CP部分缺失对X蛋白转式激活作用的影响. 方法将HBV CP nt 1 601～1 860区段克隆到氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因表达载体(pCAT3-Basic)上,构建重组pCAT3质粒(20d-pCAT3、21d-pCAT3、wt-pCAT3)转染HepG2细胞以检测CP活性.将wt-pCAT3与野毒株型或CP 20/21bp部分缺失的含1.2拷贝HBV全基因重组质粒(P3.8Ⅰ、20d-P3.8Ⅰ、21d-P3.8Ⅰ)共转染HepG2细胞以检测X蛋白的转式激活作用.ELISA方法检测CAT表达量. 结果 PCR扩增和双酶切初步筛选的克隆株,经测序终鉴定重组质粒克隆成功.重组pCAT3质粒转染HepG2细胞表明,CP缺失的重组表达载体(20d-pCAT3、21d-pCAT3)较野毒株型CP的重组表达载体(wt-pCAT3)产生的CAT量明显下降,均仅为后者的14.2%;共转染试验表明,wt-pCAT3 可被P3.8Ⅰ产生的完整X蛋白转式激活,而分别不能或仅能较弱地被共转染的20d-P3.8Ⅰ、21d-P3.8Ⅰ产生的截短的X蛋白所改变. 结论 HBV 20/21bp缺失的CP活性较野毒株型CP活性显著下降;CP20/21bp缺失株的X蛋白难以发挥转式激活作用.
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核孔复合体相互作用蛋白(NPIP)对乙型肝炎病毒核心启动子转录活性的调节作用
目的:构建HBV核心启动子及NPIP的重组载体,研究NPIP对核心启动子表达的调节作用.方法:根据HBV核心启动子及NPIP的序列设计引物,用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和NPIP基因,分别构建HBV核心启动子的报告载体及NPIP的真核表达载体,脂质体法瞬时转染HepG2细胞.结果:成功构建HBV核心启动子的报告载体及NPIP的真核表达载体.脂质体法瞬时转染HepG2细胞48 h后,用ELISA法检测β-gal的表达,显示核心启动子在NPIP的影响下,其活性有降低3-4倍.通过体内实验证明NPIP可以下调HBV核心启动子的表达.结论:NPIP明显降低HBV核心启动子的表达,为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的线索.
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乙型肝炎核心启动子的研究进展
乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)与病毒复制、转录及疾病的关系密切,近年来国内外对核心启动子的结构、功能进行了广泛的研究,但目前研究的热点集中在核心启动子变异后的生物学活性改变以及与治疗的关系等方面,本文就其研究进展作一综述.
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乙型肝炎病毒核心启动子的结构及调节研究
0引言乙型肝炎是一种严重威胁人类健康的疾病,呈全球性分布,目前全世界有3.5亿人感染乙型肝炎病毒(HBV),其中相当一部分感染者发展为慢性肝炎,少数还发展为肝硬化甚至肝癌,至今仍缺乏有效控制[1-5].造成这一局面的原因很多,其中关于HBV与肝细胞之间相互作用的分子生物学机制的研究进展相对滞后是严重影响新型治疗技术和新型药物开发与研究的重要原因之一.进一步弄清HBV DNA的复制、转录及调节的过程,对于我们研究乙型肝炎的发病机制具有重要意义.本文仅就乙型肝炎病毒核心启动子(CP)结构及调节近几年的研究进展作一综述.
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乙型肝炎病毒核心启动子部分缺失真核表达载体的构建及对病毒抗原表达的影响
乙型肝炎病毒核心启动子(CP)部分缺失变异已证实在几种HBV感染的临床现象中存在[1-3].我们在一组14例血清抗-HBe阳性的无症状携带者中,发现有9例在nt1748(或nt1747)至nt1767间20(或21)个核苷酸的缺失,此9例中有5例合并有nt1896G→A点变异[4].本研究在此基础上,拟构建这种CP 20/21 bp缺失及合并存在A1896点变异的HBV全基因重组真核表达载体,并转染HepG2细胞,以研究此类变异株对病毒抗原表达的影响.
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一种检测乙型肝炎病毒核心启动子区nt1758-1777缺失突变新方法的建立
目的 建立一种新的单管巢式实时荧光PCR熔解曲线法用于快速灵敏地筛检临床乙型肝炎病毒(HBV)样本核心启动子区nt1758-1777片段缺失突变.方法 通过比对分析GenBank收录的HBV基因序列,设计通用巢式PCR引物,建立优化方法体系;对340例慢性乙型肝炎患者血清HBV CP区进行扩增,产物直接测序,并随机选择50例样本进行克隆测序,分析nt1758-1777缺失突变检出率.野生型和缺失型标准质粒来自于单克隆测序样本,并对两种标准质粒及克隆检测样本进行荧光定量PCR扩增,获得熔解曲线及熔解温度,得到熔解曲线的阳性标准.用新建立的方法对340份样本进行检测,并用焦磷酸测序加以验证.结果 直接测序法检出16例(4.7％)阳性样本.标准质粒及克隆检测样本中缺失序列比例≥15％的样品,其熔解温度(Tm)≥88.3℃,遂将≥88.3℃作为新方法的阳性标准.用新方法检出47例(13.8％)阳性样本,其中用焦磷酸测序验证缺失突变比例≥1.0％的样本38例,＜1.0％的样本9例;15份阴性样本缺失突变比例均＜1.0％.用焦磷酸测序验证缺失突变比例1.0％作为阳性阈值,新方法对nt1758-1777缺失检测的阳性符合率为80.9％,阴性符合率为100％,两种方法的一致性Kappa值为0.671.结论 与直接测序法相比,新方法可显著提高nt1758-1777缺失检出率,结合焦磷酸测序证实,可有效提高检测的准确性和经济性.该方法对建立,BV其他缺失突变的检测方法也可提供借鉴.
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乙型肝炎病毒核心启动子区基因异质性及对其转录活性的影响
从慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者外周血中扩增核心启动子(CP)基因序列,克隆入pGEM-Teasy质粒,随机挑选克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度.结果提示,HBV长期携带者体内有准种共存,CP区内存在热点缺失突变及散在点突变.为了进一步探讨CP区基因异质性对其转录活性的影响,将野生株及不同缺失突变的CP基因片段克隆入pcDNA3.1(-)载体的EcoRI位点,筛选反向克隆,经KpnI和XhoI双酶切后克隆入氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因表达载体pCAT3-basic上,构建重组报告质粒.以Lipofectamine PLUS转染试剂转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,用ELISA方法检测CAT表达量,反映了CAT基因上游启动子的转录活性.结果显示,成功构建了重组报告质粒,与野生株比较,HBV CP区准种群的存在不同程度地降低了CP基因的转录活性.
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血管紧张素原基因核心启动子(AGCEl)G-6A变异与新疆哈萨克族原发性高血压的相关性研究
目的研究血管紧张素原(AGT)基因核心启动子(AGCEl)部位G-6A分子变异与中国新疆哈萨克族原发性高血压的关系.方法应用聚合酶链反应(PCR)结合限制性酶切(RFLP)方法对85名新疆哈萨克族血压正常者与85例新疆哈萨克族原发性高血压(EH)患者进行G-6A分子突变的检测.结果AGT基因G-6A多态性各基因型在EH组和对照组中的分布分别为8.25%、37.64%、54.11%和32.94%、34.12%、32.94%,差异有统计学意义(x2=17.126,P＜0.001),-6A等位基因在EH组(72.94%)的分布高于对照组(50.00%),差异有统计学意义(x2=18.888,P＜0.001),携带A等位基因EH的患病风险度是携带G等位基因的2.696倍(OR=2.696,95% C1:1.714～4.239);女性EH患者与对照组的差别更大.结论AGT基因AA基因型可能与新疆哈萨克族EH的发生有关,-6A等位基因是EH发病的危险因子,并且与性别表达有关,对新疆哈萨克族女性的影响更大.
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二氢生物蝶呤还原酶基因启动子核心调控区域的定位及研究
目的：前期结果表明 QDPR 参与糖尿病肾病的发生发展。本研究对 QDPR 基因启动子核心调控区域定位，分析其转录调控功能。方法：构建含有大鼠 QDPR 基因翻译起始位点上游2092 bp 序列的萤火虫萤光素酶报告基因重组质粒。生物信息学预测潜在的核心启动子区域，并构建该区域多个片段缺失的萤火虫萤光素酶报告基因重组质粒。分别瞬时转染 HEK293T 细胞，通过双萤光素酶报告基因活性分析，定位 QDPR 基因启动子的核心调控序列。结果：与-2092~-1序列相比，缺失 QDPR 基因上游-529~-116序列的萤光素酶活性只有原来的1%（P ﹤0．01），而仅保留-529~-1序列的萤光素酶活性是原来的64%（P ﹤0．05）。将 QDPR 基因上游-529~-116序列逐段缺失后发现，分别缺失-529~-429，-428~-250，-141~-116三段序列的萤光素酶活性都显著升高（P ﹤0．01），而缺失-249~-142序列的萤光素酶活性则显著下降（P ﹤0．05）。结论：大鼠 QDPR 基因的核心启动子可能位于翻译起始密码子上游-529~-116区域内，该区域内存在多个转录因子 Sp1的结合位点，可能是 QDPR 基因潜在的正性调控区和负性调控区。
关键词： 糖尿病肾病 二氢生物蝶呤还原酶基因 核心启动子 双萤光素酶报告基因分析 -
hTERT核心启动子调控的hNIS重组腺病毒的构建与鉴定
目的:构建含人端粒酶逆转录酶(hTERT)核心启动子调控的人钠碘转运体(hNIS)基因重组腺病毒,并初步鉴定.方法:将hTERT核心启动子从hTERT/pcDNA3.1(+)质粒中切出,亚克隆至含全长hNIS cDNA序列的质粒载体FL*-hNIS/pcDNA3,应用限制性内切酶将hTERT-hNIS片段切出后连入穿梭质粒载体pAdTrack,应用AdEasy系统构建出重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS.同时,构建CMV启动子调控的hNIS重组腺病毒Ad-CMV-hNIS作为阳性对照.应用RT-PCR方法验证hTERT在转染肿瘤细胞中的转录活性.结果:成功构建重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS、Ad-CMV-hNIS并经PCR验证正确.RT-PCR证实hNIScDNA能从Ad-hTERT-hNIS转染的细胞中扩增出来.结论:成功构建重组腺病毒Ad-hTERT-KNIS;hTERT核心启动子在转染的肺癌A549细胞中具有转录活性.为下一步的碘治疗实验提供了实验依据.
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人端粒酶反转录酶启动子调控人钠碘同向转运体基因肿瘤靶向治疗的实验研究
目的:探讨肿瘤特异性人端粒酶反转录酶(hTERT)启动子调控的人钠碘同向转运体(hNIS)的特异性抗肿瘤作用.方法:将质粒pcDNA3.1-CMV-hNIS中的hNIS cDNA亚克隆至含hTERT核心启动子的质粒载体pGL3-hTERT-luc中,以构建质粒pGL3-hTERT-hNIS,并以质粒pGL3-hTERT-luc及pcDNA3.1-CMV-hNIS分别作为阴性对照及阳性对照,然后采用脂质体将其转染至人胚肺成纤维细胞MRC-5及肿瘤细胞HeLa、A549和U87中,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测hNIS mRNA水平；免疫细胞化学法及流式细胞术(FCM)检测hNIS蛋白的表达情况；摄碘实验验证hNIS蛋白的功能；同时采用MTT观察131I的细胞杀伤作用.结果:成功构建质粒pGL3-hTERT-hNIS,转染4种细胞后,3种肿瘤细胞的hNIS mRNA水平明显高于MRC-5细胞(P＜0.05).3种肿瘤细胞均可表达hNIS蛋白,而MRC-5细胞不表达.与Na125I孵育30 min时HeLa、A549和U87细胞的摄碘量分别是阴性对照组的25倍、20倍和18倍.131I照射7h后,3种肿瘤细胞的相对存活率显著下降(P＜0.05).结论:hTERT启动子调控hNIS基因在肿瘤细胞中特异性表达,这些细胞可特异性摄碘并被其有效杀伤,为行进一步体内实验奠定基础.
关键词： 人钠碘同向转运体 人端粒酶反转录酶(hTERT) 核心启动子 基因治疗 -
乙型肝炎病毒核心启动子缺失突变导致HBeAg表达不能
目前认为10%～30%的慢性乙型肝炎(CHB)患者为乙型肝炎e抗原(HBeAg)阴性CHB,表现为丙氨酸氨基转移酶(ALT)反复波动或持续异常,对干扰素α(IFNα)治疗的疗效差,病情呈持续发展,易进展为肝硬化和(或)原发性肝癌[1].
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乙型肝炎病毒基因型与肝细胞癌的关系
目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)基因型与肝细胞癌(HCC)相关性的病毒分子基础.方法 应用PCR-RFLP法或测序法测定回顾性随机配对的124例HBsAg阳性HCC患者和124例慢性HBV感染者的HBV基因型;比较HCC患者中不同HBV基因型的临床资料;检测HBV的HBx、Enh2与Bcp基因序列的变异.结果 慢性HBV感染者中HBV基因型B型占62.1%,C型占37.9%,HCC患者中基因B型占41.5%,C型占58.5%,未见其他基因型.基因B、C型的HCC患者平均年龄均在50岁左右.在≤35岁的HCC患者,感染的HBV以B型为主;在36～50岁组中, C型比例明显大于B型;而在50岁以上组中二者无明显差别.感染HBV基因B型HCC患者的血清总胆红素水平高于C型[分别为(56.3±79.5)μmol/L和(23.7±18.3) μmol/L,P=0.015];感染C型者HBeAg阳性率高于B型(分别为34.1%和9.74%,P=0.024);所有发生肝外转移的HCC患者的HBV基因型均为B型.在整个HBx、Enh2与Bcp区,基因B、C型HBV株氨基酸水平变异无明显差别.70.0%基因B型和96.2%C型HBV株发生nt1762/1764的双位点变异.此外,在反式激活区和增强子II区,B型HBV的基因变异明显,C型HBV株共有64个氨基酸发生热点变异,而B型HBV株仅有23个氨基酸发生热点变异.结论 福建省HCC患者HBV基因型以C型为主.C型HBV株在反式激活区的基因变异较大,这可能与感染C型HBV株者更易发生HCC有关.感染基因B型HBV的HCC患者较易发生肝外转移的现象值得进一步探讨.
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HBeAg阴性乙型肝炎患者前C区G1896A变异及其与前S1抗原的关系
HBV感染初期表现为血清HBV DNA水平升高,随之出现HBeAg;当患者体内出现抗-HBe时,血清HBeAg转阴,HBV DNA水平则会降低.然而,有部分HBeAg转阴的患者仍表现为慢性乙型肝炎(乙肝).有研究表明,前C区或核心启动子变异是导致HBeAg阴性慢性乙肝的原因之一,血清前S1抗原能敏感地反映体内的HBV复制情况[1-2].本研究使用分子信标技术来分析HBeAg阴性乙肝患者前C区变异率及其与前S1抗原的相关性.
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乙型肝炎核心启动子BCP的临床观察
慢性乙型肝炎BCP区的变异是多点和复合的,主要是1762(A-F)、1764(G-A)双变异,本文利用基因芯片的方法检测乙型肝炎患者中出现A1762T/G1764A双变异的现象与临床的关系.
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慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者乙型肝炎病毒前C/CP区变异研究进展
慢加急性肝衰竭(ACLF)是我国肝衰竭的主要类型,其病情发展迅速、预后不良、病死率较高.在我国,乙型肝炎病毒(HBV)感染是导致ACLF的主要病因,其中HBV前C(PC)/核心启动子(CP)区基因变异与ACLF的发生密切相关.本文重点介绍HBV PC/CP区基本结构和功能、PC/CP区变异后生物学特性的改变、ACLF的免疫病理损伤机制、PC/CP区变异与ACLF疾病进展的临床意义等方面的研究进展.
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人SAMHD1基因核心启动子区域的初步鉴定和分析
目的 鉴定人不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1 (SAMHD1)基因的核心启动子区域,研究SAMHD1的转录调控机制.方法 从HepG2细胞中提取基因组DNA,PCR扩增SAMHD1基因翻译起始位点上游937、667、553、399 bp片段.将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体,双酶切鉴定后将DNA条带切胶回收,再连入pGL3-Basic载体中,双酶切及DNA测序鉴定.将包含有4个片段的荧光素酶表达载体与pRL-TK共转染HepG2细胞,荧光素酶报告基因活性检测并分析4个片段的启动子活性.5'RACE鉴定SAMHD1在HepG2细胞中的转录起始位点.结果 电泳结果显示已经从HepG细胞中提取出基因组DNA.PCR扩增后电泳结果显示已经扩增出937、667、553、399 bp片段.双酶切后电泳结果显示成功将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体.双酶切及DNA测序鉴定已成功构建荧光素酶表达载体pGL3-937、pGL3-667、pGL3-553和pGL3-399.荧光素酶报告基因活性检测显示SAMHD1核心启动子区域位于0～-399区域(ATG前一个碱基为-1).5'RACE结果显示SAMHD1在HepG2细胞中转录起始位点位于-101.结论 SAMHD1的核心启动子位于翻译起始位点上游-101～-399区域,为深入研究肝细胞中SAMHD1转录调控机制奠定了基础.
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真核蛋白编码基因核心启动子元件
核心启动子(core promoter,CP)是位于转录起始位点附近由100个左右核苷酸所构成的功能区域,负责与转录因子结合同其它顺式作用元件如增强子、沉默子一起对转录进行调控.目前所发现的真核蛋白编码基因核心启动子元件包括:TATA盒、上游启动子元件BRE、起始子Initiator(Inr)、下游启动子元件DPE以及新发现的位于DPE附近的十基序元件MTE.上述核心启动子元件普遍存在于真核蛋白编码基因之中,对真核生物的生长、发育、适应环境起着重要作用.
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噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白的研究
目的:通过筛选乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(oore promoter,CP)结合蛋白,为HBV复制机制和调控机制的研究探索新的途径.方法:应用噬菌体展示技术,以HBV的核心启动子的聚合酶链反应(PCR)产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索.结果:噬菌体经富集后,随机筛选得到7个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定了和HBV启动子结合的肝细胞蛋白基因序列,分别编码β2微球蛋白和3种未知功能蛋白.结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了与HBV核心启动子结合的蛋白,分析了该蛋白的编码基因,为进一步研究HBV与肝细胞相互作用的分子生物学机制开辟了新的途径.
