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HER-2基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建及序列分析
目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以HER-2为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定.方法:设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGPU6/GFP/Neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定.再转染人大肠癌HT29细胞,进行荧光摄像和G418抗性筛选.结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列.结论:HER-2靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,并可以进行稳定筛选.
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基因表达谱芯片技术筛选NS5ATP11反式调节基因
目的:应用基因芯片技术研究未知功能基因NS5ATP11的表达对于肝细胞基因表达谱的影响.方法:从HepG2细胞RNA中用反转录聚合酶链反应法(RTPCR)扩增出NS5ATP11编码区DNA,常规分子生物学技术构建NS5ATP11的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP11,利用脂质体转染技术转染HepG2细胞,NS5ATP11的表达以Western blot杂交技术证实.从转染和非转染细胞HepG2种提取总mRNA,逆转录为cDNA,并进行基因芯片技术分析.结果:证实构建pcDNA3.1(-)-NS5ATP11在HepG2细胞中表达正确.NS5ATP11重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达改变进行分析.结果表明,8种基因的表达水平上调,10种基因的表达水平下调.结论:NS5ATP11对于肝细胞基因表达谱存在一定影响;基因芯片技术是分析蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径,有助于了解NS5ATP11对肝细胞和其他生物学功能的调节作用.
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HCBP6对HCV核心蛋白反式激活作用的影响
目的:研究HCBP6蛋白在细胞内表达时,是否通过蛋白-蛋白之间的相互作用,对HCV核心蛋白的反式激活作用产生影响.方法:利用常规的分子生物学技术分别构建HCBP6蛋白和丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的真核表达载体.酶联负疫黏附法enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测CAT的表达水平,间接测定HCV核心蛋白对于SV40病毒即刻早期启动子的反式激活活性.结果:重组表达载体pcDNA3.1(-)-HCBP6、pcDNA3.1(-)-core经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误.转染HepG2细胞之后,HCV核心蛋白的表达,对于SV40病毒即刻早期启动子的转录表达活性具有显著的反式激活作用.但是,当与HCBP6蛋白的表达载体进行共转染时,SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性受到抑制.重复试验得到了相似的结果.HCBP6蛋白的表达对于HCV反式激活SV40病毒即刻早期启动转录活性的抑制率40.4-62.3%.结论:HCBP6蛋白在细胞内的表达对HCV核心蛋白反式激活SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性具有显著的抑制作用.
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基因表达谱芯片技术筛选肝再生增强因子反式调节基因
目的:为了阐明人肝再生增强因子(augmenter of liverregeneration,ALR)的表达对于肝细胞基因表达谱的影响,我们应用基因芯片技术,对于转染和未转染的HepG2细胞进行了分析.方法:从HepG2细胞RNA中用反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)扩增出ALR编码区DNA,常规分子生物学技术构建ALR的真核表达载体pcDNA3.1(-)-ALR,利用脂质体转染技术转染HepG2细胞,ALR的表达以Western blot杂交技术证实.从转染和非转染细胞HepG2种提取总mRNA,逆转录为cDNA,并进行基因芯片技术分析.结果:经过限制性内切酶分析和序列测定,证实pcDNA3.1(-)-ALR构建正确.ALR在HepG2细胞中的表达以Westernblot杂交技术得到证实.对于ALR重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达谱,利用基因芯片技术进行分析.结果表明,2种基因的表达水平上调,24种基因的表达水平下调.这些基因包括淀粉酶α、肿瘤坏死因子受体、金属蛋白酶1组织抑制因子、性激素相关蛋白等基因,相信这些类型的基因在ALR所发挥的生物学效应起到重要的作用.结论:ALLR于肝细胞基因表达谱存在一定影响;基因芯片技术是分析蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径,有助于了解ALR对肝细胞和其他生物学功能的调节作用.
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基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白反式调节基因
目的:乙型肝炎病毒(HBV)基因组编码的HBxAg是一种很强的反式激活(transactivation)病毒蛋白,在正常肝细胞的恶性转化(transformation)以及肝细胞癌(HCC)的形成过程中具有十分重要的作用.为了阐明HBxAg的表达对于肝细胞基因表达谱的影响,我们应用基因芯片技术,对于转染和未转染的HepG2细胞进行了分析.方法:以含有全长乙型肝炎病毒基因的pCP10质粒作为模板,应用聚合酶链反应技术(PCR)扩增的HBxAg基因片段,常规分子生物学技术构建HBxAg的真核表达载体pcDNA3-HBxAg,利用脂质体转染技术转染HepG2细胞,HBxAg蛋白的表达以Western blot杂交技术证实.从转染和非转染细胞HepG2中提取总mRNA,逆转录为cDNA,并进行基因芯片技术分析.结果:经过限制性内切酶分析和序列测定,证实pcDNA3-HBxAg构建正确.HBxAg在HepG2细胞中的表达以Western blot杂交技术得到证实.对于HBxAg重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达谱,利用基因芯片技术进行分析.结果表明,16种基因的表达水平上调,58种基因的表达水平下调.这些基因包括细胞生长、细胞凋亡、信号转导等基因,相信这些类型的基因在HBxAg的恶性转化中具有十分重要的作用.结论:HBxAg是一种病毒反式激活蛋白,对于肝细胞基因表达谱有显著影响;基因芯片技术是分析病毒反式激活蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径.
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Sunrivin靶向小干扰RNA诱导大肠癌细胞凋亡的作用
本研究拟用基因克隆技术构建Survivin靶向的小干扰RNA(SiRNA)重组表达载体,探讨用RNA干扰的方法下调大肠癌细胞中Survivin基因的表达,从而抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡,为大肠癌的基因治疗提供理论依据.
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PIRES-EGR-1-endostatin基因放疗抗肿瘤效应的实验性研究
肿瘤基因-放疗(gene-radiotherapy,GR)是目前研究热点,电离辐射可启动重组表达载体中早期生长反应因子1(early growth response-1,EGR-1)同时诱导下游基因的超强表达.
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丙型肝炎病毒NS3蛋白真核表达载体的构建及其基因免疫研究
基因免疫是指将编码特异抗原的目的基因重组表达载体直接接种到宿主组织内,在体内表达基因产物,进而激发宿主产生特异性免疫反应.自1990年首次报道发现基因免疫以来,这一新的免疫技术已经在基础免疫学研究和疫苗研制等许多领域得到广泛应用.对许多疾病(如流感)的基因免疫接种,可以产生抵御再次感染的保护性免疫反应[1].在小鼠体内接种HCV包膜蛋白和核心蛋白的重组质粒可诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫反应[2～4].本研究中我们构建了HCV NS3区真核表达载体,对其基因免疫效果进行初步探讨.
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PcDNA3.1-rhGM-CSF表达质粒的构建及其对K562细胞生长与分化的影响作用
目的:观察GM-CSF对髓系白血病细胞(K562)生长、分化的影响作用.方法:采用PCR、T-A克隆及基因定向克隆技术,将rhGM-CSF基因插入PcDNA3.1(+)空载体中,构建了PcDNA3.1-rhGM-CSF真核表达载体.经限制性内切酶消化和DNA测序鉴定确认,转染人K562髓系白血病细胞、72小时后采用细胞形态学检测、MTT试验、免疫组化技术观察和分析PcDNA3.1-rhGM-CSF在K562细胞中的表达及其影响该细胞生长与分化的作用.结果:①成功构建PcDNA3.1-rhGM-CSF真核细胞表达载体;②重组质粒PcDNA3.1-rhGM-CSF能在K562细胞中表达,并诱导K562细胞向单核细胞系、巨噬细胞系分化;③K562细胞增殖受到明显抑制.结论:成功构建了PcDNA3.1-rhGM-CSF真核细胞表达载体;转染K562细胞能向单核细胞系、巨噬细胞系分化.
关键词： 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 重组表达载体 细胞分化 K562 -
乙型肝炎病毒S基因单独和联合白细胞介素-12诱导小鼠产生特异性免疫应答
核酸疫苗是用带有目的抗原基因的重组表达载体免疫动物,使目的抗原在体内持续表达,诱导机体产生特异性体液和细胞免疫应答[1].我们用含乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)主蛋白编码基因的核酸疫苗单独或与白细胞介素-12(IL-12)联合免疫Balb/c小鼠,检测小鼠的抗-HBs和HBsAg特异性细胞毒活性.
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mTOR特异性siRNA重组表达载体的构建及鉴定
目的：构建mTOR siRNA 重组表达载体，为探讨RNA干扰技术抑制巨噬细胞 mTOR 基因的相关研究奠定基础。方法设计具有短发夹结构的DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGPU6/GFP/Neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定。再转染入巨噬细胞RAW264.7,进行荧光摄像和阳性克隆筛选。Western blot方法检测巨噬细胞mTOR蛋白表达。结果 DNA 测序结果及 PCR 鉴定证实成功构建小鼠 mTOR siRNA 重组表达载体。Western blot结果显示转染该重组载体的巨噬细胞mTOR蛋白表达下降约41%。结论 mTOR靶向RNA干扰重组表达载体构建成功,可以进行稳定筛选，该载体对巨噬细胞mTOR蛋白表达有抑制作用。
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靶向Akt2基因RNA干扰重组表达载体的构建和测序
目的 利用RNA干扰技术,以Akt2为靶基因,设计并构建重组表达载体,并进行测序鉴定.方法 利用GenBank中已知Akt2的mRNA基因序列设计具有短发夹结构的两条寡核甘酸序列,经退火形成互补双链,与pGEM-T Easy载体进行连接,经蓝白筛选后以T7和SP6为引物进行PCR鉴定,对表达载体pRNAT-U6.2及亚克隆产物进行双酶切,将得到的基因及线性化的表达载体再次连接,利用PCR方法进行重组体的筛选鉴定并进行测序分析.结果 将合成的DNA序列克隆到表达载体上,经PCR扩增筛选鉴定和测序鉴定证实为所需序列.结论 Akt2靶向RNA干扰重组表达载体构建成功.
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小菜粉蝶颗粒体病毒颗粒体蛋白基因的序列测定及在大肠杆菌中的表达
根据颗粒体病毒颗粒体蛋白(Granulin)基因在其起始密码子上游的12个碱基高度保守序列(TATAAGGAATTT)以及大菜粉蝶颗粒体病毒(PbGV)的颗粒体蛋白基因的序列[1]设计引物,PCR扩增得到850bp左右大小的片段,核苷酸序列测定结果表明该病毒的granulin基因全长为855bp,起始密码位于第38～40位碱基,终止密码位于779～781位碱基,编码框序列全长为744;推测该基因编码一段由247个氨基酸组成的多肽,分子质量约为2.9178×104道尔顿.与其它颗粒体病毒颗粒体蛋白基因进行同源性比较,核苷酸同源性都在70%以上,氨基酸同源性都在75%以上,高的为大菜粉蝶颗粒体病毒(PbGV),核苷酸同源性为97%,氨基酸同源性为98%.构建了重组表达载体pet-28a-Gran,IPTG诱导后经SDS-PAGE检测,表明获得了颗粒体蛋白基因在大肠杆菌BL21中的特异表达.
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p16基因转染对膀胱癌细胞系BIU-87体外生长的抑制作用
为探讨p16基因在膀胱癌发生、发展过程中的作用及其在膀胱癌基因治疗中的应用前景,我们将野生型p16基因导入缺失p16基因的BIU-87细胞中,观察p16基因的肿瘤抑制功能.一、材料与方法1.p16基因重组表达载体的构建与鉴定:质粒pGRE5-1含全长0.96 kb的人p16cDNA基因片段,用EcoRI和XhoI双酶切pGRE5-1分离出p16cDNA基因片段,将其插入真核表达载体pcDNA3(5.4kb)的EcoRI/XhoI酶切位点间,构建成重组质粒,命名为pcDNA3-p16,酶切、电泳鉴定.
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Moesin抗体与动脉粥样硬化相关疾病的关系
目的 通过重组表达的方法获得纯化的膜突蛋白(moesin),利用纯化的重组moesin作为抗原建立间接酶联免疫吸附实验(ELISA),检测并探讨抗膜突蛋白抗体与动脉粥样硬化相关疾病的关系.方法 设计针对moesin的引物,通过PCR扩增,得到moesin的编码DNA,构建出能够表达moesin的重组质粒,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)在适当温度和条件下诱导表达,通过SDS-PAGE电泳鉴定所表达的蛋白,并对重组蛋白进行纯化.利用纯化的重组moesin作建立间接ELISA,采用酶联免疫吸附试验检测120例动脉粥样硬化相关疾病(20例急性冠状动脉综合征、30例原发性高血压、20例颈动脉硬化、20例糖尿病及30例血脂异常症)患者血清抗膜突蛋白抗体,观察抗膜突蛋白抗体的阳性率.结果 表达产物经SDS-PAGE电泳分析,确定所得表达产物为moesin;抗原的佳包被浓度为4 mg/L,抗体的佳稀释倍数为1:100,酶标二抗的佳稀释倍数是1:20 000.在120例动脉粥样硬化相关疾病中,抗膜突蛋白抗体的阳性检出率较高,达25％～70％,显著高于正常对照组的5％(P＜0.01)；急性冠状动脉综合征组阳性检出率高达70％,高于其它疾病组(P＜0.05),其它各亚型疾病组之间差异无显著性.结论 成功地表达了重组人moesin；建立了佳的重组moesin作为抗原检测抗膜突蛋白抗体的间接ELISA反应条件；抗膜突蛋白抗体在动脉粥样硬化相关疾病患者中有较高的检出率.
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CD147基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建及序列分析
目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以CD147为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定.方法:设计具有短发夹结构的一对DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSilencer 4.1-CMV neo构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定.结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列.结论:CD147靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,为肿瘤的基因治疗提供了可能.
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重组人β-防御素-2基因COS-7细胞的转染表达
目的:通过构建两种SV40系列的重组载体,即N端带Flag标签的重组hBD-2基因和C端带Myc和6xHis双标签的重组hBD-2,并转染COS-7细胞,探索建立既能持续有效地表达和分泌hBD-2、其表达产物又易于被检测和分离纯化的哺乳类动物细胞表达系统的可能性及技术路线.方法与结果:(1)将hBD-2全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV.tag2B构建出hBD-2的上游带Flag报告基因的重组表达载体pCMV.tag2B/hBD-2,经DNA测序证明:hBD-2cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的碱基组成顺序均准确无误.(2)hBD-2全长cDNA片段插入编码双重标签基因Myc和6xHis的真核表达质粒pcDNA3.1/Myc-His(+),构建出C端带Myc和6xHis双重标签的重组真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2.DNA测序结果表明:hBD-2cDNA片段插入方向和全长cDNA的碱基组成顺序均准确无误.(3)采用脂质体转染法分别将以上两种重组真核表达载体导入COS-7细胞,分别从mRNA和蛋白质水平分析hBD-2的表达情况.并检测经重组真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2转染细胞的可溶性蛋白及其培养上清的抗菌活性.(4)采用RT-PCR法对经带Flag报告基因的重组表达载体pCMV.tag2B/hBD-2转染的COS-7细胞的总RNA进行RT-PCR扩增,结果扩增出一条约240 bp的cDNA片段,其大小与预测相符.经Western blot法检测到细胞可溶性蛋白在约10 kD处有强反应条带显示.(5)用特异性引物(hBD2p6/hBD2p7)对经pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2转染的COS7细胞的总RNA进行RT-PCR扩增,用抗标签基因His表达产物的特异性抗体,经Western blot法检测到细胞蛋白在约10 kD处有强反应条带显示,其大小与该重组质粒结构中由pCMV启动子驱动的基因片段有可能表达成肽链的分子量(10.1)相符.双层肉汤琼脂平板扩散法抑菌试验结果表明:分别与正常COS-7细胞的细胞可溶性蛋白及其培养上清比较,转染pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2的COS-7细胞的细胞可溶性蛋白及其培养上清在金黄色葡萄球菌质控菌株25 923的平板上形成明显的抑菌环.结论:(1)N端带Flag标签基因重组真核表达载体pCMV.tag2B/hBD-2已被成功构建和转染COS-7细胞.通过RT-PCR法和Western blot法证实hBD-2基因已在COS-7细胞内持续有效地表达.(2)C端带双重标签基因Myc和6xHis的真核表达质粒pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2已被成功构建和转染COS-7细胞.通过RT-PCR法、Western blot法和体外抗菌实验证实,该系统不仅能有效地表达和分泌具抗菌活性hBD-2,也为其表达产物的检测、分离纯化提供了必要条件.
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反向MDR1及TNF-α重组表达载体的构建及其在乳腺癌耐药细胞中的表达
目的克隆MDR1及TNF-α基因cDNA,构建反向pEGFP-MDR1重组表达载体和pDsRed2-TNF-α重组表达载体,并在乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达.方法应用RT-PCR和DNA重组技术构建反向绿色荧光蛋白pEGFP-MDR1融合蛋白表达载体和红色荧光蛋白pDsRed2-TNF-α融合蛋白表达载体,经脂质体分别和同时导入乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达,应用荧光显微镜直接观察融合蛋白的表达情况,G418筛选阳性克隆.结果转染了反向pEGFP-MDR1载体的MCF-7/ADR细胞在胞浆和胞核均可见到绿色荧光.而转染了pDsRed2-TNF-α载体的MCF-7/ADR细胞在胞浆和胞核均可见到红色荧光.而同时转染了反向pEGFP-MDR1载体和pDsRed2-TNF-α载体的细胞胞浆和胞核均可见到红色及绿色荧光.结论反向pEGFP-MDR1融合蛋白和pDsRed2-TNF-α融合蛋白能在乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR中分别及同时获得表达,为进一步研究基因治疗联同免疫治疗逆转乳腺癌耐药建立了很好的基础.
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大鼠SLPI基因siRNA重组表达载体构建及其在调控真皮多能干细胞增殖中的作用
目的 观察分泌型白细胞蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte protease inhibitor,SLPI)对真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells,DMSCs)的促增殖作用.方法 酶消化法分离、纯化、扩增新生大鼠DMSCs.在前期成功构建SLPI基因过表达载体基础上,根据SLPI基因siRNA的设计挑选出佳抑制SLPI基因表达的干扰载体,RT-PCR、Western blot鉴定.重组表达载体转染DMSCs,观察其表达,运用CCK-8法和流式细胞术检测细胞周期,观察SPLI基因促进DMSCs的增殖作用.结果 成功分离获得真皮来源、具有细胞干性的DMSCs;并成功构建SLPI基因过表达真核载体及SLPI基因siRNA表达载体,转染DMSCs(分为过表达组和干扰组,并以转染空载体者为对照组).CCK-8检测显示,48、72、96 h,过表达组增殖较快,干扰组增殖较慢,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);72、96 h,过表达组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),说明过表达组增殖较快,即SLPI基因有促进增殖作用.流式细胞检测表明,过表达组G1期与干扰组比较差异有统计学意义(P＜0.05),S期、G2期与对照比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 SLPI基因具有明确的促DMSCs增殖作用,促进细胞从G1向S和G2期转变,即通过调控细胞周期发挥促增殖作用.
关键词： 分泌型白细胞蛋白酶抑制因子 重组表达载体 真皮多能干细胞 增殖 -
靶向COX-2基因短发夹RNA重组表达载体的构建及鉴定
目的 利用RNA干扰技术,以COX-2为靶基因,构建靶向COX-2基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达质粒并进行鉴定分析.方法 设计、合成1对COX-2编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,经退火形成互补双链,通过定向克隆至质粒pGenesil-1,构建shRNA真核表达载体.转化JM109大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析;RT-PCR和Western blot检测重组表达质粒对COX-2 mRNA和蛋白表达的抑制效果.结果 酶切证实目的DNA定向克隆至载体上,测序分析结果与目的序列相同.RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组比较,pshRNA-COX-2重组表达质粒对β-actin基因无明显影响,而对COX-2有明显抑制作用.COX-2 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为66.9%和50.3%.结论 成功构建的靶向干扰COX-2基因重组质粒能够显著抑制COX-2基因表达.
