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内源性逆转录病毒长末端重复序列在嗜酸性粒细胞增多症的基因表达及核苷酸序列分析
探索人内源性逆转录病毒长末端重复序列(LTR)基因及表达与嗜酸性粒细胞增多症发生的关系.PCR法检测嗜酸性粒细胞增多症患者外周血中内源性逆转录病毒长末端重复序列基因,RT-PCR法检测内源性逆转录病毒基因表达.变性高效液相分析和序列测定LTR片段核苷酸序列,对不同株基因序列作同源性的比较分析.PCR结果显示:20例嗜酸性粒细胞增多症患者细胞中均获得内源性逆转录病毒长末端重复序列扩增产物,嗜酸性粒细胞增多症组中长末端重复序列基因有高的表达,而正常人表达为阴性.与HERV-K家族LTR基因相应区域核苷酸序列比较;嗜酸性粒细胞增多组长末端重复序列U3、R、U5区同源性分析有核苷酸的改变,与淋巴瘤对照比较没有大片段的缺失.人类基因组中普遍存在逆转录病毒长末端重复序列.正常人和嗜酸性粒细胞增多症患者中长末端重复序列有不同程度核苷酸碱基的变异,但是,二者比较,这种改变与嗜酸性粒细胞的增多没有明显的相关性.在嗜酸性粒细胞增多症患者中有高的基因表达而正常人中没有可检出的病毒基因的表达,嗜酸粒细胞的增多可能与逆转录病毒基因表达水平有关,其诱导嗜酸粒细胞增多的机制需进一步的研究.
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在我国发现普马拉病毒新亚型
对我国东北地区捕获的157份棕背鼠平的肺组织进行普马拉病毒检测.其中免疫荧光检测出阳性标本1份,PCR检测出核苷酸阳性标本7份.对PCR产物进行测序后发现,其核苷酸的序列与报道的普马拉病毒核苷酸序列存在着差异.系统进化分析表明,我国发现的这株普马拉病毒,在进化树上形成了一个新的分支,为一新亚型.并且与在韩国和日本发现的普马拉病毒亲缘关系为接近.
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仙台病毒BB1株基因组cDNA序列测定及比较分析
该研究对仙台病毒BB1分离株的cDNA全序列进行测序,通过RT-PCR法获得的4个相互重叠的质粒克隆覆盖了全长基因组,并将BB1全长序列与其它已知的仙台病毒序列进行比较.BB1株病毒的基因组为15 384个碱基构成,与其它已知仙台病毒基因组的基因排列与组成规律是一致的,未发现插入或缺失突变.与现已公布5个仙台病毒代表株全基因组序列比较发现,BB1株与其它仙台病毒株同源性均有较大差异.遗传进化分析结果显示,BB1株与Z株和Hamamatsu株的同源性仅为87%和91%,不属于这两株代表的进化分支而归属于第三个基因型.
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我国分离的肠道病毒71型(SHZH03病毒株)全基因组核苷酸序列分析
对肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)中国(深圳)分离株SHZH03进行了全基因组(未包括多聚腺苷尾)7406个碱基的核苷酸序列测定.结果表明,SHZH03株与其它肠道病毒71型毒株相比,在编码区没有核苷酸的缺失和插入,其5′UTR和3′UTR区的长度和序列有一定的差异.核苷酸同源性比较结果表明,在P1区SHZH03株与SHZH98株、中国台湾流行株(TW2086、TW2272)的同源性较高(分别为92.5%,90.1%和87.9%),与新加坡流行株SIN5666、SIN5865及标准株MS、BrCr的同源性则在81%左右,而与Coxsackievirus A16(Cox.A16)的同源性低(63.6%).氨基酸同源性比较结果表明,在P1区SHZH03株与Cox. A16的同源性低,但在P2和P3区SHZH03株与Cox.A16的同源性高.P1区的遗传进化分析表明,SHZH03株和中国台湾1998年流行的EV71毒株的亲缘关系较近,属于同一型(genogroup),而与标准株BrCr和MS的亲缘关系较远.上述结果有助于肠道病毒71型的基础研究和中国对于EV71所致疾病的预防.
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中国19个狂犬病病毒街毒分离株N基因的序列分析
测定了30年来从不同动物中分离的19个中国狂犬病病毒街毒株N基因的部分核酸序列,并对其核苷酸差异做了比较分析.可将中国狂犬病病毒街毒株分为4个组群,各组间的同源性为83.45%～88.62%.除广西地区分离的狂犬病病毒街毒株彼此差异较大外,其余街毒株的地理分布与其N基因核酸序列差异的距离是密切相关的,基本上可按其地理分布分为东、西二大组.
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中国急性弛缓性麻痹病例高发地区脊髓灰质炎病毒分离株性质的研究
中国云南省昭通地区从1997年以来每年都是急性弛缓性麻痹(Acute flaccid paralysis,AFP)病例的高发地区,该地区的镇雄县1997～2001年每年都有≥2例由Ⅱ型脊髓灰质炎(脊灰)疫苗相关株引起的AFP病例.日本国际协力事业团(JICA)中国消灭脊灰项目的临床专家曾于2001年赴当地核查这些AFP病例,终临床确认了4例脊灰,认为存在脊灰病例聚集现象.针对此情况,对云南省镇雄县1997～2001年从AFP病例中分离到的Ⅱ型脊灰毒株(共13株)进行了序列分析,发现其VP1和3D区核苷酸序列变化位点、变化数目及改变各不相同,其中有8株为S2×S3重组株,5株为S2×S2疫苗相关株.病毒基因的分析不支持聚集病例间毒株的传播关系,不存在单一毒株循环引起的聚集现象.发现其中1株为脊灰疫苗衍生病毒(VDPV),但未发现其自然循环引发疾病流行.
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在江苏省发现曾有Ⅰ型脊髓灰质炎疫苗衍生病毒在自然界循环
目前我国已通过了世界卫生组织(WHO)西太平洋区关于中国无脊髓灰质炎(脊灰)的认证.但近几年在实验室监测中发现了为数不少的脊灰疫苗相关株病毒.经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)和核苷酸序列分析证实,在我国存在不同型别脊灰疫苗衍生株间的重组病毒,以及同一型别脊灰疫苗株病毒基因组核苷酸序列的差异.近从江苏省1996年和1998年的急性弛缓性麻痹病例粪便标本中,各分离到2株Ⅰ型脊灰病毒,经鉴定,这4株病毒均为同源Ⅰ型脊灰疫苗的衍生株病毒.证明江苏省曾有Ⅰ型脊灰疫苗衍生株病毒在自然界循环.
关键词： 脊髓灰质炎野病毒 脊髓灰质炎疫苗衍生株病毒 强化免疫 核苷酸序列分析 变异 -
川 渝 黔地区不同的脊髓灰质炎Ⅱ型疫苗重组病毒的分析
2000年,四川省(川)、重庆市(渝)及贵州省(黔)从急性弛缓性麻痹(AFP)病例粪便标本中分离到6株脊髓灰质炎(脊灰)Ⅱ型病毒,经中国疾病预防控制中心国家脊灰实验室用RT-PCR-RFLP法进行型内鉴定,并对病毒基因VP1区及3D区核苷酸进行序列测定,结果显示:6株病毒均为脊灰Ⅱ型(VP1区)与Ⅰ型(3D区)的重组株,但是重组方式呈三种表现.按患儿粪便标本采集地点的不同,将6株病毒分为3个组:A组的2例重组株,3D区为典型Ⅰ型序列,分布于贵州省仁怀市和水城县;B组的2例重组株重组位点发生在3D区第6 226～6 243位,在其前面为Ⅱ型序列,以后的核苷酸序列为Ⅰ型序列,分布于重庆市及四川省广安市;C组的2例重组株重组位点发生在3D区第6 270～6 306位,其前面为Ⅱ型序列,以后为Ⅰ型序列,在四川省马尔康县及简阳市发现.全部6株病毒VP1区的903个核苷酸与SabinⅡ株相比,同源性各自为99.8%,3D区则呈现有不同方式的重组,重组位点不同,且其分布地区各异,显示重组株的普遍性及多样性,其重组株的来源是多源性的,并已呈局部地区内有限的循环.
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广西壮族自治区2001年急性弛缓性麻痹病例中2株C4b亚型进化分支人肠道病毒71型VP1编码区基因特征分析
目的 分析广西壮族自治区2001年急性弛缓性麻痹(Acute Flaccid Paralysis,AFP)病例中分离到的两株人肠道病毒71型(Human Enterovirus Type 71,HEV71)VP1编码区的基因特征.方法 对2001年AFP病例中的非脊髓灰质炎肠道病毒(Non-Polio Enterovirus,NPEV)分离培养物,进行HEV71特异性逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcript-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测,对鉴定为HEV71的病毒分离物,随机选取其中2株进行VP1编码区核苷酸序列测定和分析.结果 在25份NPEV分离物中,有5份鉴定为HEV71核苷酸阳性,选取GX(Guangxi,广西)01-64和GX01-71株进行进一步分析.VP1编码区核苷酸序列分析结果显示,它们与基因C型4b亚型(Subgenotype C4b)进化分支参考株的相似性高,核苷酸序列相似性为95.2％,在遗传进化树中与C4b亚型病毒株同属一个分支.与1997～2008年国内HEV71流行株的氨基酸序列比对中发现,GX01-64和GX01-71株的第22位氨基酸、多肽SP(Synthetic Peptide,合成多肽)31～33以及CD4+T(Thymus,胸腺)细胞表位上的氨基酸发生了点突变.结论 广西壮族自治区早有HEV71感染的病例可以追溯到2001年,GX01-64、GX01-71株与国内1998～2003年所分离的C4b进化分支HEV71的亲缘关系很近,提示可能存在共同的祖先,并且它们的某些可能与抗原以及细胞表位有关的氨基酸序列发生了点突变.
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广西壮族自治区首次检出的GⅡ.4型诺如病毒N/S区基因特征
目的 了解广西壮族自治区一起感染性腹泻疫情中GⅡ.4型诺如病毒(Norovirus)的基因特征.方法 采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应,对采集于这起疫情的34份粪便标本进行诺如病毒核糖核酸(RNA)的检测,并对随机选取的1份阳性样本进行N/S区核苷酸序列测定和分析,并构建系统进化树.结果 34份粪便标本中,有29份检测诺如病毒RNA阳性,阳性率为85.3%.随机选取的1株诺如病毒株(LC17株)的N/S区核苷酸序列与GⅡ型所有亚型参考株相比,其与第4亚型(GⅡ.4型)的参考株--Lordsdale/1993/UK株的核苷酸序列同源性为93.3%,在遗传进化树图中,与GⅡ.4型株病毒在一簇.与早年流行的GⅡ.4型流行株同源性为94.7%～96.5%,与国内外2006年流行株同源性为98.2%～98.6%,但与1株广州株相比,同源性仅为94.7%.结论 此次感染性腹泻疫情是由诺如病毒GⅡ.4型感染所致,其病毒基因型在广西壮族自治区是首次发现和报导.GⅡ.4型毒株在不断的进化,并在核甘酸序列特征和毒株地域分布上表现出多样性,需加强对诺如病毒的分子流行病学研究,了解基因型的分布,鉴别其来源和传播途径,对控制诺如病毒感染有重要意义.
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湖南省急性弛缓性麻痹病例分离株的性状分析
1997～2001年,湖南省疾病预防控制中心从急性弛缓性麻痹(AFP)病例粪便标本中共分离到单型脊髓灰质炎(脊灰)毒株85株,经中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家脊灰实验室用逆转录-聚合酶链反应-限制性酶切片长度多态性分析(RT-PCR-RFLP)方法进行型内鉴定,全部为疫苗相关株.对其中从"零"剂次免疫患儿、有残留麻痹患儿和一些其他相关的患儿粪便标本中分离到的脊灰病毒进行了VP1区和3D区的核苷酸序列测定.结果显示:在脊灰Ⅱ型毒株中,绝大多数毒株在VP1区的核苷酸中第2909位位点发生突变,导致第143位氨基酸由Ile变为Asn或Thr.在脊灰Ⅱ型毒株中,广泛存在着型间重组现象.在重组病毒中,以Ⅱ型与Ⅲ型病毒的重组为主,占90%.从AFP病例及健康儿童中,从有残留麻痹患儿及无残留麻痹患儿的粪便标本中,都能分离到重组株,说明重组的发生具有普遍性,重组发生的位点在核苷酸的不同位置,重组的形式又具有多样性.通过对湖南省毒株的碱基突变和重组的研究表明,在湖南省1997～2001年的分离株不支持隔年传播,只在局部地区某一年内可能发生有限的循环.通过加强口服脊灰疫苗的免疫,提高免疫覆盖率,可以阻止疫苗相关病毒局限的循环.
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泰安市肾综合征出血热疫源地分型研究
我市自1984年流行肾综合征出血热(HFRS)以来,曾多次进行地理流行病学调查,根据流行季节、主要宿主动物种类确定流行类型.这种方法不够准确.为有效控制HFRS在我市发病与流行,1995～1997年应用聚合酶链反应(RT-PCR)、核苷酸序列分析、微量细胞病变中和试验(MCPENT)技术开展了疫源地分型研究.
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汉坦病毒Q32株L和M片段全基因序列分析
目的测定汉坦病毒Q32株L、M片段的全长序列,了解其分子基础.方法设计特异的PGR引物,用RT-PCR技术分段扩增Q32株全长L、M片段,PCR产物纯化后直接测序,或用T-A克隆方法进行PCR产物克隆,然后进行遗传进化分析.结果Q32株L片段的全基因序列共6533个核苷酸,GC含量为37.38%,AT含量为62.62%,包含一个单一的开放读码框架(ORF),该读码框架从38到6493,由6456个核苷酸组成,编码2151个氨基酸,可以合成相对分子质量为2.46×105的蛋白.M片段全基因序列共3616个核苷酸,GC含量为39.44%,AT含量为60.56%,包含一个单一的开放读码框架(ORF),其读码框架从41到3448,由3408个核苷酸组成,编码1135个氨基酸,可以合成相对分子质量为1.26×105的蛋白.Q32编码的RNA聚合酶也有6个比较保守的区域.结论汉坦病毒Q32株M和L片段具有和其他汉坦病毒糖蛋白和RNA聚合酶相似的核苷酸一级结构,核苷酸序列虽有差异,但在氨基酸水平上的同源性仍很高.
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汉坦病毒84Fli株S和M片段基因克隆、序列分析及在真核细胞中表达的研究
目的克隆汉坦病毒84Fli株S,M片段,测定这些基因的核苷酸序列,用瞬时表达了解S和M片段在真核细胞中的表达.方法以我国分离的汉坦病毒84Fli株感染的Vero-E6细胞提取总RNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增其S及M片段的全长cDNA.然后将84Fli株的S,M片段cDNA基因分别克隆入pCR2.1-TOPO载体中,随机挑选其中的3个克隆测定核酸序列,确定汉坦病毒84Fli株S和M片段核苷酸序列.根据S和M片段核苷酸序列设计引物,PCR扩增S及M片段的编码区,构建了真核表达质粒pcDNA3/84SC及pcDNA3/84MC.用质脂体法把质粒转入COS7细胞,瞬时表达NP及G1和G2糖蛋白.用免疫荧光(IFA)、Western blot和免疫沉淀方法检测核蛋白及糖蛋白的表达.结果汉坦病毒84Fli株的基因组S片段长度为1 688个核苷酸,编码430个氨基酸.汉坦病毒84Fli株的基因组M片段长度为3 616个核苷酸,编码1 136个氨基酸.用免疫荧光(IFA)检测S和M片段在COS细胞中的瞬时表达为阳性.Western blot结果显示,存在有相对分子质量为50 000左右的核蛋白表达,免疫沉淀法显示有核蛋白、G1和G2糖蛋白的表达.结论 84Fli株病毒和其他汉滩病毒在核苷酸序列上虽有差异,但在氨基酸水平上的同源性仍很高,成功地在COS7细胞中瞬时表达了汉滩病毒的核蛋白及糖蛋白.
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地方株HPV16L1基因免疫小鼠诱发的抗体反应
为了检测pcDNA-L1的表达,评价地方株HPV16L1基因诱导的体液免疫反应.我们采用PCR技术从宫颈癌组织中获得HPV16L1基因,以pGEM-Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析,再将L1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建重组pcDNA-L1,转染Cos-7细胞,通过IFA试验验证L1蛋白的表达.
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HCBP6对HCV核心蛋白反式激活作用的影响
目的:研究HCBP6蛋白在细胞内表达时,是否通过蛋白-蛋白之间的相互作用,对HCV核心蛋白的反式激活作用产生影响.方法:利用常规的分子生物学技术分别构建HCBP6蛋白和丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的真核表达载体.酶联负疫黏附法enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测CAT的表达水平,间接测定HCV核心蛋白对于SV40病毒即刻早期启动子的反式激活活性.结果:重组表达载体pcDNA3.1(-)-HCBP6、pcDNA3.1(-)-core经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误.转染HepG2细胞之后,HCV核心蛋白的表达,对于SV40病毒即刻早期启动子的转录表达活性具有显著的反式激活作用.但是,当与HCBP6蛋白的表达载体进行共转染时,SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性受到抑制.重复试验得到了相似的结果.HCBP6蛋白的表达对于HCV反式激活SV40病毒即刻早期启动转录活性的抑制率40.4-62.3%.结论:HCBP6蛋白在细胞内的表达对HCV核心蛋白反式激活SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性具有显著的抑制作用.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因10的克隆化研究
目的:丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白5A(NS5A)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质.为了探索HCV NS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因,我们应用微矩阵(microarray)技术对于转染和未转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析.研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物.以含有全长HCV-H株cDNA的pBRTM-3011质粒DNA作为模板,进行多聚酶链反应(PCR)扩增,将获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A.以pcDNA3.1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总RNA,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术(bioinformatics),克隆HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因.结果:构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误.以pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2后提取总RNA,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析.应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因,命名为NS5ATP10,新基因的编码基因序列全长为717个核苷酸(nt),编码产物由238个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV NS5A是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白.微矩阵技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术.发现了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为阐明HCV NS5A蛋白的反式激活作用及其机制,开辟了新的研究方向.
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丙型肝炎病毒结构基因转基因小鼠引起肝脏脂肪变
目的:建立持续表达和诱导表达型丙型肝炎病毒(HcV)结构基因(包括核心蛋白和包膜蛋白El、E2编码基因)的转基因小鼠动物模型,探讨HcV结构基因表达导致肝脏脂肪变的病理改变.方法:以含有近全长HcV cDNA的质粒为模板,通过多聚酶链反应(PcR)技术扩增HcV结构基因的DNA片段(约2.2kb),克隆到真核表达载体pcDNA4HisMas和pMT/BiP/V5-HisA中,分别构建成持续表达型表达载体pcDNA4HisMas-HcV core-E2和诱导表达型表达载体pMT/BiP/V5-HisA-HcV core-E2.以限制性内切酶分析和目的DNA片段的核苷酸序列分析,证实构建HcV结构基因的真核表达载体正确无误.以脂质体体外转染cos-7细胞系,利用抗-HcV E2的多克隆抗体进行westem blot杂交分析,证实转染细胞中有HcV E2蛋白的表达.利用小鼠受精卵细胞核微注射方法,导入线性化表达载体的DNA,利用假孕小鼠的受精卵植入方法,建立了表达HcV结构基因的转基因小鼠模型.对于持续表达型转基因小鼠的死胎、6月龄以及硫酸铜诱导表达型的转基因小鼠模型的肝脏组织,进行HE染色和病理学特征的分析.结果:构建了持续性表达和可诱导性表达型的HcV结构基因表达载体pcDNA4HisMas-HcV core-E2和pMT/BiP/V5-HisA-HcV core-E2,体外转染cos-7细胞证实转染细胞中有HcV E2抗原的表达.对于持续表达型转基因小鼠死胎肝脏病理学特征进行分析,发现肝组织尚未分化发育完成,肝内有大量造血细胞,肝细胞空泡变性,单个核细胞聚集现象.对于持续表达HcV结构基因的6月龄转基因小鼠的肝脏进行病理学分析,发现中央静脉区肝细胞小泡型脂肪变性,中央静脉周围细胞溶解坏死,中央静脉明显扩大,少数组织中亦见大泡型脂肪变性.对于可诱导型转基因小鼠的肝脏进行病理学分析,发现肝小叶内中央静脉周围坏死区累及5-10个小叶,周围无淋巴细胞浸润,交界区可见多数肝细胞核异常,或固化,或呈花环状,或溶解为淡蓝色无定形基质.泡浆内残留大量脂肪小泡,肝脏脂肪变与核异常有-移行过程.结论:建立了表达HCV结构基因的转基因小鼠,发现HCV结构基因的转基因小鼠肝脏有典型的脂肪变病理改变,为进一步研究HCV感染引起的慢性丙型肝炎合并脂肪变的特征和机制研究奠定了基础.
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幽门螺杆菌黏附素基因babA2的克隆、序列测定及其生物信息学分析
目的:获取幽门螺杆菌黏附素基因babA2,并将他克隆到质粒pET-22b(+)中进行核苷酸序列分析,并对其进行生物信息学分析,为研究Hp黏附素的分子机制和免疫原性提供基础.方法:利用PCR技术扩增babA2,并将其定向插入pET-22b(+)载体,通过DNA序列分析仪进行核苷酸分析,生物信息学软件对其进行生物学特性分析.结果:DNA序列分析表明,所克隆的babA2基因序列与GenBank公布的一致.ANTHEPROT V4.3c软件预测其蛋白质分子量约为78 KD,并显示出了良好的抗原性和疏水性.结论:本研究获得了序列正确的babA2基因,生物信息学分析表明其具有优良的免疫原性,为其重组表达及其相关研究奠定了良好的基础.
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不同分化胆管癌差异表达基因的分离、克隆和功能研究
从分子水平研究胆管癌发病机理及病理过程,对认识及防治胆管癌都具有重要的理论和实际意义.基于临床研究的结果[1],我们采用Liang 1992年建立的差异显示法(DDRT-PCR)[2],来寻找高、低分化胆管癌间差异表达基因的cDNA.1.材料和方法:(1)采用TRIzol总RNA提取试剂盒,分别提取高分化、低分化胆管癌新鲜组织总RNA,逆转录合成单链cDNA.(2)DDRT-PCR:在20 μL体系中对2 μL逆转录产物进行扩增,加入2 μmol/L 4dNTPs, 5 μmol/L 锚定引物T15M, 1 μmol/L随机引物, 37Bqα-32P-dCTP,1.5UTaq酶.(3)DD-PCR产物取6 μL上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,恒定功率50W,电泳约3 h,滤纸揭胶,覆保鲜膜后压X光片,-70 ℃曝光14 h,显影.确定感兴趣的差异片段的位置并切胶,将切下的凝胶常规方法提纯并进行再扩增.(4)反向Northernblot鉴定:点样后,用化学变性及热变性法交联,标记探针基本上按照文献[3]进行.常规方法68℃杂交12 h,中等强度洗膜后放射自显影,-80 ℃压片22 h,显影.(5)PCR产物经纯化后可以直接用来测序,测序引物用T15N,PCR产物的核苷酸序列分析采用全自动DNA序列分析仪及配套的ABI试剂.
