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普马拉病毒实时荧光定量RT-PCR方法的建立
目的 建立一种适应国境口岸地区特定鼠种中普马拉病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法.方法 利用Beacon Designer7.0软件设计引物和探针,以人工合成普马拉病毒S基因的片段作为模板,进行实时荧光定量RT-PCR检测,并验证该方法的灵敏度及特异性.结果 模板的Ct值与模板稀释浓度的对数存在良好的线性关系,标准曲线y=-3.122x+ 38.605,R2=0.995,PCR扩增效率为109.1％,其低检出限为31.6 copies/μl.结论 建立的实时荧光定量RT-PCR方法特异性好、灵敏度高,适合于普马拉病毒的快速检测.
关键词： 普马拉病毒 定量 实时荧光RT-PCR -
在我国发现普马拉病毒新亚型
对我国东北地区捕获的157份棕背鼠平的肺组织进行普马拉病毒检测.其中免疫荧光检测出阳性标本1份,PCR检测出核苷酸阳性标本7份.对PCR产物进行测序后发现,其核苷酸的序列与报道的普马拉病毒核苷酸序列存在着差异.系统进化分析表明,我国发现的这株普马拉病毒,在进化树上形成了一个新的分支,为一新亚型.并且与在韩国和日本发现的普马拉病毒亲缘关系为接近.
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辽宁省普马拉病毒检测及基因特征分析
目的 研究辽宁省境内棕背(鼠平)体内普马拉病毒(PUUV)的基因特征及分布情况.方法 收集辽宁省抚顺和本溪地区棕背(鼠平)的肺组织标本,采用间接免疫荧光法(IFA)检测PUUV抗原,RT-PCR方法扩增标本中PUUV S基因片段,并测序,进行同源性比对和系统发生分析.结果 共采集38份棕背(鼠平)肺组织标本,IFA检测PUUV抗原阳性2份,RT-PCR扩增PUUV S基因阳性4份,测序表明均为PUUV特异性序列.系统进化分析显示,本次检出的抚顺和本溪病毒株与吉林省的抚松株属于同一亚型,核苷酸同源性为95.2％～96.9％,在进化树上形成一个新的分支,在亲缘关系上与日本PUUV株较近.结论 辽宁省可能存在PUUV的一个新亚型.
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吉林省普马拉病毒的RT-PCR检测与序列分析
目的 建立检测普马拉病毒的RT-PCR方法,确认吉林省存在普马拉病毒,并对病毒的基因片段进行分析.方法 采用RT-PCR方法,对吉林省抚松地区棕背( )鼠肺标本进行检测.对S片段核蛋白基因编码序列进行序列比较分析,绘制系统发生树.结果 研究表明在吉林省抚松地区存在普马拉病毒,采集于2005年和2006年的标本阳性率分别为7.34%和14.29%,呈逐年上升趋势.序列分析表明与其他普马拉病毒核苷酸序列同源性只有81.1%～83.3%.系统发生分析揭示,该病毒与在日本、韩国分离的普马拉病毒亲缘关系相对接近,并且在进化过程中处于更古老的节点.结论 在吉林省抚松地区可能存在普马拉病毒的一个新亚型.
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普马拉病毒核蛋白基因片段原核表达及产物纯化
目的 通过原核表达获得普马拉病毒重组核蛋白.方法 采用RT-PCR方法,从感染普马拉病毒的鼠肺标本中扩增得到编码核蛋白1-117aa的基因片段.将截短的核蛋白基因片段插入原核表达载体PQE30构建重组质粒,转化至大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,利用Ni-NTA Agarose对表达产物进行纯化.结果 重组蛋白得到了高效表达.表达产物分子量15 000,在菌体中主要以可溶性蛋白形式存在.通过亲和层析,得到了纯化的重组蛋白.结论 普马拉病毒重组核蛋白基因片段得到了有效表达.
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吉林省肾综合症出血热流行趋势分析
目的分析吉林省肾综合症出血热流行趋势.方法根据疫情资料和对全省部分疫源地的鼠密度、优势鼠种、鼠带毒率、带毒鼠流行型、恢复期患者血清标本、健康人群隐性感染情况等因素的监测数据综合分析.结果吉林省肾综合症出血热疫源地和城市的家鼠型病例逐年增加,以家鼠型为主的混合型疫源地逐年扩大,健康人群抗体水平与全国数据相近,延边地区疫源地检测到普马拉型病毒基因.结论目前我省肾综合症出血热的流行趋势是由山区向平原、由农村向城市、由东向西逐渐扩延;流行型别由单一的姬鼠型向以家鼠型为主的混合型演变,呈现由逐变到突变的过程,全省疫源地型别已趋向多元,出现新型病原体存在的迹象.
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普马拉病毒重组核蛋白用于流行性出血热病人IgG抗体检测
目的:检测出血热病人的IgG抗体及发现在我国可能存在的普马拉病毒感染者.方法:用普马拉病毒重组核蛋白作抗原建立间接ELISA法,检测出血热病人血清中特异性IgG.结果:检测了吉林省抚松地区37份临床诊断出血热患者血清,4份血清抗普马拉病毒核蛋白IgG抗体阳性.结论:我国有可能存在普马拉病毒感染者.
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湖北地区汉滩病毒与普马拉病毒及多布拉伐病毒的血清学交叉反应研究
目的 研究湖北地区汉滩病毒(hantaan virus,HTNV)与普马拉病毒(Puumaa virus,PUUV)、多布拉伐病毒(Dobrava virus,DOBV)血清学交叉反应.方法 以酵母菌表达的PUUV、DOBV、HTNV重组核衣壳蛋白(recombinant nucleocapsidprotein,rNP)为包被抗原,ELISA法定性、定量分析湖北地区HTN型急性,恢复期血清中IgA、IgG、IgM抗体,比较疾病早晚期血清学交叉反应变化.结果 DOB-rNP与HTN型血清中IgA、IgG、IgM抗体交叉反应性较高,PUU-rNp对HTN型血清交叉反应很低;IgA、IgG抗体交叉反应在恢复期血清中均增高,且IgA抗体交叉反应更多更强.结论 湖北地区HTN型血清与DOBV存在广泛交叉反应,与PUUV交叉反应少.各交叉反应在恢复期增高对汉滩病毒血清学研究具重要意义.
