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  • 发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立

    作者:吕燕宁;王全意;窦相峰;王小梅;庞星火

    目的 建立新型发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒的TaqMan探针实时荧光RTPCR检测方法并进行评估,为发热伴血小板减少综合征监测中新型布尼亚病毒感染的排查提供实验室检测依据.方法 利用新型布尼亚病毒S片段基因的特异性序列设计引物和探针,探针5'端标记FAM,3'端标记TAMRA,优化反应体系与反应条件,并对不同浓度含有.目的 基因的质粒以及在发热伴血小板减少综合征监测中收集的32份样本和流行性出血热病毒阳性样本进行核酸检测,验证该方法的特异性、敏感性和重复性.结果 该方法所检测的32份可疑病例的临床样本中,3份为阳性,与国家疾病预防控制中心下发的试剂以及商品化试剂盒的检测结果一致;流行性出血热病毒检测结果为阴性.对.目的 基因的检测灵敏度达4×102拷贝/ml;重复性实验中,变异系数为0.125%~0.28%.全部检测过程从样本的核酸提取至检测完成仅需2.5h左右.结论 本文建立的TaqMan探针实时荧光RT-PCR法是一种检测新型发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒的特异、快速、敏感的方法.该方法的建立将有益于今后开展发热伴血小板减少综合征监测以及应急临床样本中新型布尼亚病毒感染的排查和快速检测.

  • 2011-2013年深圳市福田区轮状病毒感染情况分析

    作者:张海龙;叶郁辉;陈小珍;吴延杰;杨洪;姚相杰;陈龙;何雅青

    目的 了解深圳市福田区轮状病毒的感染情况,为制定预防轮状病毒感染的策略提供依据.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)对2011-2013年深圳市福田区1728例疑似病毒性腹泻患者粪便标本进行轮状病毒的核酸检测.结果 2011-2013年福田区轮状病毒的总体检出率为18.29%(316/1728),2011-2013年检出率起伏较大,分别为22.16% (115/519)、13.13% (73/556)和19.60%(128/653);男性检出率为18.53%(184/993),女性检出率为19.96%(132/735);轮状病毒在冬季的检出率高(34.79%,167/480),秋季次之(20.67%,87/421),春季、夏季的检出率较低.0~5岁年龄组患者的检出率(21.01%,232/1104)显著高于5岁以上年龄组患者的检出率(13.46%,84/624),差异有统计学意义,(x2=29.5786,P<0.05).结论 轮状病毒是福田区病毒性腹泻的重要病原体之一,2011-2013年检出率呈较大起伏;冬季是轮状病毒感染的高发季节;0~5岁婴幼儿患者是轮状病毒感染的重点人群;应加强对轮状病毒腹泻的监测,尤其应加强对婴幼儿轮状病毒感染的预防控制.

  • 2008年深圳市感染性病毒性腹泻中诺如病毒的感染分析

    作者:张海龙;杨洪;阳帆;冼慧霞;姚相杰;杨冬燕;何雅青

    目的 了解广东省深圳市感染性病毒性腹泻中诺如病毒的感染情况.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time RT-PCR)对2008年深圳市606例疑似腹泻患者粪便标本进行诺如病毒的检测.结果 诺如病毒感染率为24.26%(147/606),其中男性感染率为22.49%(74/329),女性为26.36%(73/277).0~2岁年龄组诺如病毒感染率为11.54%(9/78),3~4岁为0%(0/5),5~14岁为31.25%(5/16),15~19岁为22.86%(8/35),≥20岁为26.48%(125/472).结论 诺如病毒感染全年均可发生,冬季感染率较高.各年龄组男女性人群都可感染,但在本次监测中3~4岁年龄组无感染.应加强对诺如病毒引起感染的监测.

  • 广东省肇庆市2014-2015年登革病毒分子分型及初步溯源研究

    作者:谭翰清;谭海芳;朱颖梅;程洁萍;苏乐斌;林凤;邓廷国;黄强;黎碧坚

    目的 了解广东省肇庆市2014-2015年登革病毒(DENV)的基因型别和可能的输入来源.方法 收集登革热临床诊断病例急性期血清,对实时荧光反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测阳性标本进行病毒培养,分离株进行E基因扩增与序列测定,用Mega 5.1软件进行分子分型和系统进化树构建.结果 4 09份样品中147份实时荧光RT-PCR检测阳性(35.94%),其中2014年阳性144份(39.99%),以DENV 1(139/361)为主;2015年阳性3份(6.25%),以DENV 3 (2/48)为主.共获得22株DENV分离株,其中20株为2014年DENV 1型的genotype Ⅰ和Ⅲ,与2013-2014年广州、佛山市分离株核苷酸同源性分别为99.40% ~ 100.00%和99.20%~100.00%,与新加坡、泰国、马来西亚和印度尼西亚分离株亲缘关系次之;2株为2015年DENV 3的genotypeⅢ,与近年新加坡和印度尼西亚分离株的核苷酸同源性为98.20% ~99.70%.结论 广东省肇庆市2014年暴发流行的DENV 1为genotype Ⅰ和Ⅲ,可能由广州市和佛山市输入,2015年散发的DENV 3为genotypeⅢ,由佛山市输入,疫情毒株可能源于新加坡、印度尼西亚等东南亚流行株.

  • 辛德比斯病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

    作者:洪烨;袁帅;戴俊;郑夔;黄吉城;师永霞;李小波;苏锦坤

    目的 建立辛德比斯病毒的实时荧光RT-PCR检测方法.方法 人工合成辛德比斯病毒特异性核酸序列作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR引物、探针并构建反应体系,对反应条件进行优化,验证该方法的特异性、灵敏度.结果 建立的辛德比斯病毒实时荧光RT-PCR检测方法对辛德比斯病毒核酸检测有高度特异性,与1~4型登革病毒、流行性乙型脑炎病毒和基孔肯雅病毒均无交叉反应,检测灵敏度为103拷贝/反应.结论 该方法灵敏度高、特异性强,适用于对辛德比斯病毒的快速检验.

  • 克里米亚-刚果出血热病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立

    作者:袁帅;郑夔;黄吉城;戴俊;丁国允;师永霞;李晓波;李淑芬;黎东红

    目的 建立一种快速、敏感检测克里米亚-刚果出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法.方法 分析克里米亚-刚果出血热病毒S基因片段核酸序列的保守性,设计实时荧光RT-PCR引物和探针,优化引物和探针浓度,确定佳反应体系,并进行灵敏性、重复性、特异性检测.结果 建立的克里米亚-刚果出血热病毒实时荧光RT-PCR方法的检测灵敏性为7.26× 102 copies/μ1,重复性好,与汉坦病毒等无交叉反应.结论 建立的克里米亚-刚果出血热病毒实时荧光RT-PCR法能准确、快速地检测克里米亚-刚果出血热病毒.

  • 马尔堡病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

    作者:洪烨;郑夔;相大鹏;黄吉城;戴俊;师永霞;李小波;幸芦琴;郭波旋;邓燕凤

    目的 建立马尔堡病毒的实时荧光RT-PCR检测方法.方法 人工合成马尔堡病毒特异性核酸序列作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR引物、探针并构建反应体系,对反应条件进行优化,验证该方法的特异性、灵敏度.结果 建立的马尔堡病毒实时荧光RT-PCR检测方法对马尔堡病毒核酸检测有高度特异性,与1型~4型登革病毒、日本脑炎病毒和基孔肯雅病毒均无交叉反应,检测灵敏度为102拷贝/反应.结论 该方法灵敏度高、特异性强,适用于对马尔堡病毒的快速检验.

  • 普马拉病毒实时荧光定量RT-PCR方法的建立

    作者:杨鹏飞;燕清丽;张丽萍;徐焕洲;王玉春;甄维;胡孔新

    目的 建立一种适应国境口岸地区特定鼠种中普马拉病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法.方法 利用Beacon Designer7.0软件设计引物和探针,以人工合成普马拉病毒S基因的片段作为模板,进行实时荧光定量RT-PCR检测,并验证该方法的灵敏度及特异性.结果 模板的Ct值与模板稀释浓度的对数存在良好的线性关系,标准曲线y=-3.122x+ 38.605,R2=0.995,PCR扩增效率为109.1%,其低检出限为31.6 copies/μl.结论 建立的实时荧光定量RT-PCR方法特异性好、灵敏度高,适合于普马拉病毒的快速检测.

  • 2017年河南口岸2例输入性登革热病例回顾分析

    作者:王永亮;李帅;高志华

    目的 对2017年河南口岸2名疑似为输入性登革热病例的入境人员进行实验室鉴定,为口岸实施精准检疫提供依据.方法 2名疑似病例分别从斯里兰卡和泰国旅游归国,入境时间分别为2017年1月和12月.根据流行病学调查,怀疑其在境外感染登革病毒,采集血清样本用实时荧光RT-PCR进行登革病毒检测.结果 2个病例样本均为登革病毒通用型核酸阳性,分型鉴定均为登革病毒Ⅱ型,Ct值为19.确定为输入性病例.结论 应根据国际疫情动态变动形势,加强输入性疫情的早期预警,实施口岸输入性传染病精准防控.

  • 实时荧光RT-PCR方法检测水及水产品中霍乱弧菌

    作者:王云华;罗诗龙;伍朝晖;林娜

    [目的]探索实时荧光RT-PCR方法在霍乱弧菌检验方面是否比传统方法有优势.[方法]用深圳太太基因工程有限公司提供的霍乱弧菌实时荧光RT-PCR试剂盒方法进行检验.[结果]用实时荧光RT-PCR方法从样品的2次增菌液中检出2个样品为霍乱弧菌通用型阳性.用传统的微生物生理、生化培养法,从上述2个样品中分离出3株菌株.根据血清分型、API鉴定和荧光RT-PCR,确认所分离的菌株有2株是国际检疫传染病的病原-O1群霍乱弧菌;1株是非O1/非O139群霍乱弧菌.[结论]实时荧光RT-PCR方法在霍乱弧菌的检验方面具有快速、灵敏、特异性强等优势,有利于提高霍乱弧菌的检出率.

  • 随机引物在黄热病毒核酸检测中的应用

    作者:田茵;刘翌;王飞;孙福军;张绍福;刘建礼;王正;乌日嘎;祁晓丽

    目的 将随机引物应用于黄热病毒核酸检测,为口岸快速准确地检测黄热病毒提供技术支持.方法 采用随机引物和特异性引物进行逆转录,分别用自行设计的引物、探针和参考文献的引物、探针,用实时荧光PCR方法对6份黄热病毒阳性尿液样本进行黄热病毒核酸检测,并对检测结果进行比较.结果 与特异性引物逆转录相比,随机引物逆转录的实时荧光PCR Ct值差别不显著(F值=0.11,P>0.05).结论 随机引物可直接应用于黄热病毒检测,也可在口岸传染病监测中发挥其他作用.

  • 广州天河铁路口岸173例输入性流感病例实验室检测结果分析

    作者:洪烨;戴俊;师永霞;苏锦坤;郑夔;相大鹏;幸芦琴;黄吉城;李小波;郭波旋

    [目的]监测广州天河铁路口岸入境旅客中甲型H1N1流感和季节性流感的流行情况.[方法]采集天河铁路口岸1 240名入境发热旅客的鼻咽拭子,利用实时荧光RT-PcR法对样本进行检测,并对不同型别流感阳性病例人群的分布特征及其构成特点进行分析.[结果]在天河铁路口岸1 240名发热旅客中共检出173例输入性流感病例,其中新型甲型H1N1流感53例,季节性甲、乙型流感120例.[结论]新型甲型H1N1流感病例主要易感人群为年轻人,其在输入性流感病例中的构成比例不断增加,提示输入性风险日益增大.

  • 江门口岸首例输入性甲型H1N1流感病例实验室检测结果分析

    作者:幸芦琴;李小波;丁国允;黄吉城

    [目的]江门国境口岸检出的首例甲型H1N1流感病例的实验室检测.[方法]利用本实验室自己设计合成的引物、探针,结合WHO提供的实验方法,运用实时荧光RT-PCR方法,对江门口岸送检的入出境发热患者鼻咽拭子样本进行甲型H1N1流感检测.[结果]2009年7月6日在江门口岸发现首例输入性甲型H1N1流感病例.[结论]检测结果证实,本实验室研制的甲型H1N1流感病毒检测新方法的特异性与WHO提供的方法相当,灵敏度高于后者;二者结合能大大提高甲型H1N1流感检测的灵敏度和准确性.

  • 甲型H1N1流感病毒快速检测方案的建立与应用

    作者:郑夔;李小波;师永霞;洪烨;苏锦坤;黄吉城;幸芦琴;相大鹏;郭波旋

    [目的]制定一套甲型H1N1流感病毒检测方案,用于广东出入境检验检疫局各口岸送上的可疑标本的快速检测.[方法]根据GISAID平台上发布的第1株甲型H1N1流感病毒A/California/04/2009的序列,设计合成4套实时RT-PCR引物和探针,结合WHO推荐的甲型H1N1流感病毒实时RT-PCR操作指南,制定一套新的甲型H1N1流感病毒的快速检测方案.[结果]应用此方案,2009年5月17日,发现了广东省首例甲型H1N1流感病毒感染者,截止10月18日,从各分支局口岸送上的3 262份入出境人员鼻咽拭子标本中先后检出甲型H1N1流感病毒202份.[结论]新方案是一套灵敏、快速、准确、可靠的甲型H1N1流感病毒检测方法,这套方案在广东省甲型H1N1流感的预防控制中发挥了重要作用.

  • 广州白云国际机场口岸输入性甲型H1N1流感检测结果分析

    作者:师永霞;洪烨;幸芦琴;苏锦坤;郑夔;李小波;黄吉城;相大鹏;郭波旋

    [目的]对从广州白云国际机场入境的1 037名发热患者进行甲型H1N1流感病毒检测,分析输入性甲型H1N1流感的流行状况.[方法]采集机场入境发热患者的咽拭子,使用美国CDC公布和实验室自研的引物和探针进行实时荧光RT-PCR检测,并对甲型H1N1流感疫情的流行地区和流行时间等进行分析.[结果]经实验室实时荧光RT-PCR检测,共有84份临床标本为甲型H1N1流感病毒核酸阳性.机场口岸从6月份检出输入性甲型H1N1流感病例,7月份达到高峰,9月份阳性率大幅度降低;阳性病例主要来自墨西哥、美国、加拿大和澳大利亚等甲型H1N1流感疫情爆发的国家.[结论]实时荧光RT-PCR是快速、准确、高效的甲型H1N1流感检测方法,对在口岸及时发现可疑病例,防止输入性病例在国内的扩散和对国外第二波疫情的检测具有重要意义.

  • 茂名市首例甲型H1N1流感病例的实时荧光RT-PCR检测

    作者:廖国东;陈家图;罗光毅;何展;杨适乡;胡乐

    [目的]对茂名市首例甲型H1N1流感病例进行病毒核酸检测,为甲型H1N1流感疫情的防控提供参考.[方法]采用实时荧光逆转录PCR法对采集的病人咽拭子标本进行甲型H1N1流感病毒核酸检测.[结果]共采集病人2份咽拭子标本,其中1份咽拭子标本的实时荧光RT-PCR检测结果显示H1及N1的RT-PCR反应体系扩增曲线有明显对数增长且Ct值分别为25.21(H1)和25.07(N1),为甲型H1N1流感病毒核酸阳性;另1份咽拭子标本则呈阴性.后采集第3份咽拭子标本连同第1分标本送广东省疾控中心复检,结果2份标本的甲型H1N1流感病毒核酸检测均为阳性.[结论]这名病人为福建省第2例甲型H1N1流感病毒感染者的密切接触者,由于及时采用灵敏度高,特异性强,检测时间短的实时荧光逆转录PCR方法检测,快速确诊了病例,为疫情的控制争取了时间,防止了2代病例的出现.

  • 三种实时荧光RT-PCR试剂在检测甲型H1N1流感病毒中的应用

    作者:黄宗炎;朱玉兰;刘胜牙;王佃鹏;高朝贤;董瑞玲;黄彤文;李政良;胡孔新

    [目的]结合WHO公布的甲型H1N1流感病毒的检测引物和探针,探索合适的实时荧光RT-PCR试剂应用于国境口岸甲型H1N1流感病毒疑似标本的检测.[方法]通过对连续梯度稀释阳性对照品进行检测,从而分析AB AgPath-ID、Qiagen QuantiTect和Takara One Step PrimeScript 3种常用实时荧光RT-PcR试剂的灵敏度、信号强度、反应效率等因素.[结果]3种试剂的检测下限均为1:1000倍稀释阳性对照品;AB AgPath-ID、Qiagen QuantiTect和Takara One Step PrimeScript检测的线性斜率分别为-5.517、5.214和-4.600;信号强度上Qiagen QuantiTect相对于其他2种明显偏弱.[结论]为国境口岸输入性甲型H1N1流感病例的检测和监控提供了有力的技术保障.

  • 慈溪市2010-2011年手足口病病原学检测分析

    作者:岑迪;陈国华;吴建根;叶建杰;罗莹;陈坤;许国章

    目的:通过对2010-2011年手足口病(HFMD)病原学检测结果的分析,了解慈溪市HFMD流行特征.方法:收集监测哨点医院上送的临床诊断为HFMD病例标本,应用实时荧光(Real-time) RT-PCR法检测标本中的人肠道病毒(HEV)、肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CVA16)特异性核酸.结果:443例标本中检出总肠道病毒阳性病例394例(88.94%),其中CVA16占总阳性率的22.34%,EV71占总阳性率的56.09%.病例年龄集中在1~5岁;男女性阳性比例为1.51:1;住院病例EV71阳性率为68.97%.结论:CVA16和EV71为该地手足口病的主要病原体,EV71是引起重症和住院病例的优势毒株型,在局部区域内CVA16型占主导.

  • 检测鲜草莓中GⅡ型诺如病毒的两种富集方法比较

    作者:李楠;王佳慧;李凤琴;徐进;江涛

    目的 建立鲜草莓中GⅡ型诺如病毒(NoV GⅡ)的实时荧光RT-PCR检测方法,评价磁珠富集法和PEG(聚乙二醇)沉淀法对检测草莓中NoV GⅡ的适用性,对北京地区采集的18份草莓样品进行检测.方法 参照ISO/TS 15216-1《实对荧光RT-PCR方法测定食品中甲型肝炎病毒和诺如病毒水平方法》合成检测NoV GⅡ的特异性引物和探针,分别采用磁珠富集法和PEG沉淀法富集病毒,然后提取RNA,建立实时荧光RT-PCR检测方法,并对提取条件进行优化.结果 磁珠富集法的高回收率为1.730%(PBS缓冲液),PEG沉淀法的高回收率为1.682%(TGBE缓冲液),18份草莓样品均未捡出NoV GⅡ.结论 通过磁珠富集法和PEG沉淀法建立的病毒检测的富集方法均适用于鲜草莓中NoV GⅡ的检测.

  • 北京市市售贝类、蔬菜、浆果、即食海产品中诺如病毒污染状况检测及检测方法探析

    作者:骆海朋;高飞;于海瑶;仝伟健;任秀;余文;崔生辉

    目的 对北京市市售贝类(牡蛎、贻贝、扇贝、文蛤、毛蚶)、蔬菜(苗菜、生菜)、浆果(草莓、蓝莓)、即食海产品(三文鱼、即食虾)进行诺如病毒检测.方法 贝类、蔬菜、浆果类样品参照ISO/TS 15216-1方法进行前处理,虾类检测参照贝类、三文鱼参照蔬菜的方法并进行改良.病毒RNA提取参照罗氏High pure viral RNA Kit试剂盒方法对样品前处理后的提取液进行提取.实时荧光逆转录聚合酶链反应(实时荧光RT-PCR)的检测使用罗氏LightMix(R) noroviurus GⅠ-GⅡ于Lightcycler(R) 480 Ⅱ进行检测,并进行GⅠ-GⅡ分型.诺如病毒阳性样品,参照SN/T2626-2010《国境口岸诺如病毒检测方法》,使用JV12、JV13进行扩增,将获得的DNA扩增片段进行测序并分型.结果 经罗氏试剂盒检测贝类食品478份(40份阳性)、蔬菜62份(1份阳性)、浆果84份(0份阳性)和即食海产品51份(1份阳性).有42份为GⅠ-GⅡ,其中37份为GⅡ型,4份为GⅠ型.在42份阳性样品中,有29份GⅡ型阳性样品对RNA聚合酶区域扩增成功,通过序列分析,27份为GⅡ.17,1份为GⅡ.12,1份为Hawaii.calicivirus.结论 通过对北京市市售食品样品中诺如病毒检测发现,贝类食品呈现较明显的季节分布,在冬季检出率较高,贝类食品是诺如病毒污染率高的食品.

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