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系统发生分析研究进展
达尔文的进化论出现以后,人类开始认识到生物界各类群之间可能存在某种关联,并希望尝试通过各种方法去发现并解释这种关联.DNA测序技术的发现使人类从形态学水平转变为从序列水平研究种群间的关联,而计算机技术的发展也开始为这一领域服务,生物信息学(bioinformatics)便应运而生.系统发生分析是生物信息学的一部分,是根据现有生物基因或物种多样性来重建生物的进化树,让人们比较形象的用进化树来代表基因序列间的进化关系.
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浙江省啮齿动物携带心病毒的遗传特征研究
目的 了解我国浙江省的啮齿动物携带心病毒情况,并分析其遗传特征.方法 用反转录-聚合酶链反应选啮齿动物粪便标本中的心病毒,扩增其全基因组;利用Lasergene软件分别对多聚蛋白、P1蛋白、2C+ 3CD蛋白序列与GenBank下载的序列进行同源性分析;分析其基因组与多聚蛋白的特征;利用PhyML软件构建系统发生树.结果 浙江省啮齿动物携带心病毒.毒株Ruian-Rn93-1、Longquan-Aa3-1、Ruian-Rn93-3的多聚蛋白、P1以及2C+ 3CD蛋白与心病毒B的同源性分别为71.9％ ～ 85.4％、65.2％ ～89.8％与78.3％ ～ 95.4％,属于心病毒B;毒株Wencheng-Rn416的多聚蛋白、P1以及2C +3CD蛋白与Boone心病毒的同源性分别为92.5％ 、85.3％与96.9％,属于心病毒C.系统发生分析也表明毒株Ruian-Rn93-1、Longquan-Aa3-1、Ruian-Rn93-3与心病毒B的亲缘关系近,Wencheng-Rn416与Boone心病毒的亲缘关系近.系统发育分析发现啮齿动物在心病毒的起源与进化过程中起着重要的作用,并且可能发生跨种间传播而感染人.结论 我国浙江省啮齿动物携带心病毒,并可能跨种间传播到人.
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浙江省龙泉市汉坦病毒宿主动物自然感染状况研究
目的 调查浙江省龙泉市肾综合征出血热(HFRS)疫源地小动物中汉坦病毒(HV)的自然感染情况及其流行的基因型.方法 用鼠笼在龙泉市查田镇、小梅镇、小梅镇黄南村捕鼠.捕获的小动物进行分类鉴定并解剖取肺脏,用间接免疫荧光法(IFA)检测肺组织中HV抗原,用RT-PCR对HV抗原阳性的样本扩增部分S片段核苷酸序列并测序,构建系统发生树进行基因分型.结果 共捕获小动物319只,其中野外312只,室内7只.黑线姬鼠和东方田鼠为野外优势鼠种.肺组织标本中共检测到9份抗原阳性,带病毒率为4.97%,用部分S片段(620～999nt)的核苷酸序列构建系统发生树,结果表明均为汉滩病毒(HTNV),并与Z251分离株的亲缘关系近.结论 龙泉市野外主要存在以黑线姬鼠为宿主的HTNV感染,且携带率较高.
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湖北省武汉地区啮齿动物汉坦病毒S基因的特征分析
目的 了解湖北省武汉地区啮齿动物自然感染汉坦病毒(HV)情况以及流行的基因型和亚型.方法 2000-2003年、2009-2011年秋冬季在武汉地区新洲、江夏区野外及居民区采用夹夜法捕鼠.对捕获的动物进行分类鉴定并取肺脏用间接免疫荧光法检测病毒抗原.抗原阳性的样本,采用RT-PCR方法扩增部分S片段核苷酸序列,构建系统发生树并进行基因分型.结果 2000-2003年捕获啮齿类动物437只,HV抗原阳性鼠肺标本24份,病毒携带率为5.49％.2009-2011年捕获啮齿类动物173只,HV抗原阳性鼠肺标本7份,病毒携带率为4.05％.褐家鼠为当地的优势鼠种.22份标本成功地用汉滩病毒(HTNV)、汉城病毒(SEOV)特异引物扩增部分S基因片段并测序.17只(13只褐家鼠,4只黑线姬鼠)鼠肺标本中扩增出SEOV部分S基因片段(nt 588～1147),分别属于第3亚型和2个新的基因亚型.5只黑线姬鼠的鼠肺标本中扩增出HTNV部分S基因片段(nt615- 1141),分别属于第7亚型和1个新的亚型.结论 武汉地区流行的HV为SEOV和HTNV,并发现新的基因亚型,SEOV可能“溢出”感染黑线姬鼠.
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浙江省丽水地区2株汉坦病毒分离株的型别鉴定和基因差异研究
目的 从浙江省丽水地区肾综合征出血热(HFRS)疫区阳性鼠肺标本中分离汉坦病毒(HV),并对丽水分离株进行分子生物学鉴定,分析M和S片段基因序列以确定毒株的型别和基因差异程度.方法 收集宿主动物标本,采用直接免疫荧光检测鼠肺标本HV抗原.将HV抗原阳性的鼠肺标本接种Vero-E6细胞,分离HV.提取病毒总RNA,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒M和S基因全片段,克隆入质粒载体,纯化后测定序列,并同HV其他病毒株进行比较.结果 成功分离到2株HV,扩增出2株病毒的M和S全片段并测定了序列,经对核苷酸序列分析表明,2株病毒与现有的HTNV有高的同源性,均为HTNV,但与国内外其他的HTNV核苷酸差异高达13.4%～20.7%和10.3%～16.1%.用M和S片段核苷酸序列所构建的系统进化树显示,2毒株分在HTNV发生群,与HTNV的Z10、A9、Z5病毒株亲缘关系近,但独自构成一进化支.结论 浙江丽水分离株可以定型为HTN型病毒,与国内外其他的HTN型病毒基因差异较大.
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浙江省慈溪市啮齿动物中汉坦病毒分子流行病学研究
目的 研究浙江省慈溪市啮齿动物中汉坦病毒(HV)流行情况及病毒型别.方法 采用间接免疫荧光法(IFA)检测鼠肺中HV抗原;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增阳性样品中HV的部分S片段;构建系统发生树进行系统发生分析及分型.结果 在慈溪市肾综合征出血热(HFRS)疫点共捕获啮齿动物243只,在7份鼠肺样品中检测到HV抗原,其中4只为褐家鼠,3只为黄胸鼠,病毒携带率为2.88%.用汉城型病毒(SEOV)特异性引物从6份HV抗原阳性样品中扩增出部分S片段(620～999 nt)并测定了序列.对扩增出的部分S片段核苷酸序列分析表明,6株病毒与现有的SEOV有高的同源性,均为SEOV.用部分S片段核苷酸序列所构建的系统进化树显示,6株病毒构成两个单元支,其中由褐家鼠携带的3株病毒与BjHD01株病毒的亲缘关系近,分在同一分支,由黄胸鼠携带的3株病毒构成另一分支,与L99、R22及Hb8610株的亲缘关系较近.结论 慈溪市的褐家鼠与黄胸鼠分别携带一种不同亚型的SEOV,表现出SEOV在同一地区的遗传多样性,并支持宿主与汉坦病毒共进化的理论.
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湖南省啮齿动物携带汉坦病毒的分子流行病学研究
目的 研究湖南省啮齿动物中汉坦病毒(HV)流行情况及病毒型别.方法 采用IFA法检测鼠肺中HV抗原;用RT-PCR法扩增阳性标本中HV的部分S和M片段;构建系统发生树进行系统发生分析及分型.结果 在湖南省HV流行的地区共捕获啮齿动物344只,其中6份标本HV抗原阳性,病毒携带率为1.74%.对扩增出的部分S与M片段的核苷酸序列分析表明,5份标本中的病毒为汉城型HV(SEOV),1份为汉滩型HV(HTNV).用S(620～990 nt)与M片段G2区(2001～2301 nt)核苷酸序列所构建的系统进化树显示,湘乡褐家鼠、黄胸鼠及黄毛鼠携带的病毒均为SEOV的S4亚型;宁远褐家鼠携带的病毒为SEOV的一个新亚型;石门小家鼠携带的病毒为HTNV的H4亚型.结论 湖南省为混合型HV疫区,以汉城病毒为主,并具有宿主多样性.
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辽宁省葫芦岛地区鼠类汉坦病毒的分离与鉴定
目的研究葫芦岛地区鼠类中汉坦病毒的感染流行情况以及病毒的型别.方法采用夹夜法捕捉鼠类,间接免疫荧光法检测鼠肺中的汉坦病毒抗原,阳性较强的标本接种到Vero E6细胞分离病毒,RT-PCR对分离的病毒与阳性样品扩增核苷酸片段并测序,构建系统发生树进行分型与系统发生分析.结果在200份鼠肺标本中共检测到11个样品阳性,阳性率为5.5%.选择阳性较强的标本,接种到Vero E6细胞并连续传代后分离到3株病毒.用S片段(620～999 nt)与M片段G1区(180～580 nt)的核苷酸构建的系统发生树,结果表明葫芦岛分离的3株病毒均为S3亚型.用G2区的2003～2302 nt的核苷酸序列构建的系统发生树将来自不同地区的SEO型病毒可分为7个亚型,其中从葫芦岛地区分离的3株病毒与北京地区分离株CP211、ch302、dc501和山东省分离株SD10、SD227株的亲缘关系近.结论葫芦岛地区鼠类中汉坦病毒的携带率较高,主要流行S3亚型SEOV.
关键词： 汉坦病毒 病毒分离 逆转录-聚合酶链反应 系统发生分析 -
浙江省温州市啮齿动物中汉坦病毒的分子流行病学研究
目的 研究浙江省温州市啮齿动物中汉坦病毒(HV)流行情况及病毒型别,为该地区肾综合征出血热(HFRS)的预防控制提供科学依据.方法 采用间接免疫荧光法(IFA)检测鼠肺中HV抗原;用RT-PCR法扩增阳性样品中HV的部分S片段及部分M片段;构建系统发生树进行系统发生分析及分型.结果在温州市HFRS疫区共捕获啮齿动物96只,在6份鼠肺样品中检测到HV抗原,其中4只褐家鼠,1只黄胸鼠与1只黄毛鼠,病毒携带率为6.3%.用汉城病毒(SEOV)特异引物从其中5份HV抗原阳性样品中扩增出部分S片段(620～999nt)及部分M片段(2001～2301nt)并测定序列.对扩增出的部分S及M片段的核苷酸序列分析发现,5株病毒与现有的SEOV有高同源性,均为汉城型HV.但在用部分S片段及部分M片段核苷酸序列所构建的系统进化树上,5株病毒的聚集模式不同.结论温州市的褐家鼠、黄胸鼠、黄毛鼠均携带汉城型HV,并可能发生基因片段的重排.
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广西毛南族6个短串联重复序列的遗传多态性
目的 调查广西毛南族人群6个短串联重复序列的群体遗传分布资料,探讨7个民族的遗传关系.方法 应用荧光标记STR基因扫描技术分析200名广西毛南族无关个体.以遗传距离和系统发生树来分析7个民族间的遗传关系.结果 6个STR基因座平均观察杂合度0.7825,平均多态信息总量分别为0.7324,累积个体识别力达0.99999951,累积非父排除率达0.994575.鄂伦春族、东乡族、锡伯族3个民族聚为一支,金秀瑶族、融水苗族、罗城仫佬族、毛南族4个少数民族聚成另一支.结论 D3S1358的等位基因16、D5S818的等位基因11、D7S820的等位基因11、D13S317的等位基因8、vWA的等位基因14、FGA的等位基因22可能是广西毛南族群体中相应STR基因座原始的等位基因.广西毛南族的6个STR基因座属高度遗传多态性标记,广西毛南族与罗城仫佬族的遗传关系近,其次分别为融水苗族、金秀瑶族、锡伯族、东乡族、鄂伦春族.
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辽宁省普马拉病毒检测及基因特征分析
目的 研究辽宁省境内棕背(鼠平)体内普马拉病毒(PUUV)的基因特征及分布情况.方法 收集辽宁省抚顺和本溪地区棕背(鼠平)的肺组织标本,采用间接免疫荧光法(IFA)检测PUUV抗原,RT-PCR方法扩增标本中PUUV S基因片段,并测序,进行同源性比对和系统发生分析.结果 共采集38份棕背(鼠平)肺组织标本,IFA检测PUUV抗原阳性2份,RT-PCR扩增PUUV S基因阳性4份,测序表明均为PUUV特异性序列.系统进化分析显示,本次检出的抚顺和本溪病毒株与吉林省的抚松株属于同一亚型,核苷酸同源性为95.2％～96.9％,在进化树上形成一个新的分支,在亲缘关系上与日本PUUV株较近.结论 辽宁省可能存在PUUV的一个新亚型.
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云南省褐家鼠与黄胸鼠中汉坦病毒的流行病学研究
目的 研究云南省褐家鼠、黄胸鼠中汉坦病毒的感染情况及其型别,以明确基因亚型及其地理分布,为该地区肾综合征出血热(HFRS)的预防控制提供科学依据.方法 捕捉鼠类取鼠肺,冷冻切片后以间接免疫荧光法检测鼠肺中汉坦病毒抗原,从阳性鼠肺标本中提取病毒RNA,利用RT-PCR扩增汉坦病毒S和M基因部分片段并测序分型,构建系统发生树进行系统发生分析.结果 共捕获褐家鼠和黄胸鼠307只,检测到阳性样品14份,阳性检出率为4.56%.分析部分S片段(600～999nt)与M片段G1区(140～640nt)、G2区(2003～2302nt)的核苷酸序列,及用部分S及G2核苷酸序列构建的系统发生树,将来自云南省8个地区的汉城病毒分为2个亚型:S1和S3亚型.结论 云南省主要为家鼠型HFRS疫区,汉城病毒有2个亚型,地理分布较广.
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黑龙江及吉林省边境口岸与境外全沟硬蜱线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因序列的比较研究
目的 利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ (COⅠ)基因对我国黑龙江省绥芬河、吉林省延边口岸全沟硬蜱的COⅠ基因序列和国外全沟硬蜱COⅠ序列进行分析对比研究,为了解蜱媒病及其防控奠定基础.方法 2013年6月至2016年8月从黑龙江省绥芬河口岸和吉林省延边口岸共采集全沟硬蜱106只,选取31只样本提取基因组DNA,采用PCR方法从蜱基因组中扩增COⅠ基因进行同源性分析,然后构建系统发生树,并对2个地理种群的全沟硬蜱进行遗传距离分析.结果 我国黑龙江省绥芬河口岸和吉林省延边口岸的全沟硬蜱COⅠ基因序列与俄罗斯多个地区同源性为99％～100％,与哈萨克斯坦边境口岸阿尔泰地区的全沟硬蜱COⅠ序列同源性也达到99％～100％;绥芬河口岸和延边口岸全沟硬蜱的遗传距离≤0.003.结论 我国绥芬河口岸和延边口岸的全沟硬蜱与周边邻近国家的全沟硬蜱COⅠ基因序列高度一致,可能存在极高的基因交流或迁移.
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辽宁省汉滩型汉坦病毒基因特征及分布研究
目的 探讨辽宁省汉滩型汉坦病毒(HTNV)的基因特征及其分布情况.方法 在辽宁省肾综合征出血热(HFRS)主要流行地区收集鼠肺和HFRS患者标本,采用间接免疫荧光法检测鼠肺中HV抗原,以RT-PCR方法扩增标本中M和S基因片段的特异性核苷酸序列,将HTNV的阳性产物测序,并进行同源性比对和系统发生分析.结果 辽宁省HFRS疫区HTNV主要为黑线姬鼠所携带；从鼠肺标本中扩增出M片段4份,患者标本中扩增出M片段5份,S片段1份；M片段的核苷酸同源性分析表明,辽宁株与Bao14、CJAp267等株同源性高,为95％～97％,与HTNV原型株76-118同源性为87.4％～89.0％；系统发生分析显示辽宁株均分布于同一支内,与Bao14、CJAp267等株构成一个独立的支系,同属于H4亚型；TL2 S基因片段与YaluRiver13核苷酸同源性高(97.1％),与HTNV原型株76-118同源性为91.2％；推导的S片段氨基酸同源性,TL2与Bao14、CJAp93同源性较高,为93.0％～96.2％,与其他代表株同源性多在74.1％～81.6％；而且基于S片段的系统发生分析提示与M片段的分型结果基本一致,与Bao14、CJAp93等株位于同一分支内,为H4亚型.结论 目前辽宁省流行的HTNV主要为H4基因亚型,基因亚型的分布相对比较单一.
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人冠状病毒 NL63中国株的全基因组克隆与序列分析
目的：对来自北京儿童医院的两份人冠状病毒NL63（human coronavirus NL63， HCoV-NL63）阳性样本进行病毒全基因组序列测定和分析。方法以荷兰株（NL63_Amsterdam 1）为参考株，设计18对包含重叠区域的、覆盖全长基因组的引物，采用病毒RNA提取、RT-PCR分段克隆测序的方法获得NL63国内株全长基因组序列；通过与其他毒株的比对分析，构建其系统发生树。结果NL63国内株基因组全长27538 bp，与参考株核苷酸相似性为99．1％，其中在1a区有连续15个碱基的缺失。系统发生分析表明，NL63目前可分为A型、B型、C型和D型共4个基因型，而国内株处在新的基因型（ D型）。结论本研究首次获得了两株NL63国内分离株的全基因组序列，进一步阐明了基因组的结构特征，对其遗传进化作了系统分析，为国内NL63病毒的分子流行病学研究提供参考。
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河南省HIV-1流行毒株pol基因的分型与系统发生分析
目的了解河南省艾滋病病毒1型(HIV-1)流行毒株pol基因的亚型及其系统发生情况.方法采集河南省20名艾滋病病人的抗凝全血,分离血浆,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增pol基因部分序列(PR与RT的p55区)并直接进行序列测定,登陆Web站点http://hiv-web.lanl.gov确定毒株亚型.用BioEdit和DNASTAR软件的MegAlign模块进行系统发生分析,SPSS软件包对数据进行统计学分析.结果20份标本的pol基因序列系统发生分析显示均为B亚型,且具有较高的系统发生同源性,与东北地区流行毒株的相似度≥97%,PR基因离散率＜0.2%,RT基因平均离散率为3.15%(0.7%～5.1%).PR和RT基因遗传变异的差异具有显著的统计学意义(P＜0.001).结论pol基因的系统发生分析可以作为河南省HIV-1毒株亚型确定的方法.河南与东北两地pol基因相似性以及PR与RT基因进化差异的意义,有待进一步研究.
关键词： 艾滋病毒1型(HIV-1) 基因亚型 系统发生分析 -
辽宁省汉城型汉坦病毒基因亚型分析
目的 分析辽宁省汉城型汉坦病毒(HV)的基因亚型及其分布情况.方法 收集辽宁省内主要肾综合征出血热(HFRS)流行地区的鼠肺和病人血清标本,采用间接免疫荧光法(IFA)检测鼠肺中HV抗原,应用HV特异性引物以RT-PCR方法扩增标本中M和S基因片段的特异性核苷酸序列,测序后与已知病毒序列进行比较分析,构建系统发生树,以明确其型别和亚型及其地理分布情况.结果 辽宁省HFRS疫区褐家鼠携带的病毒均为汉城型病毒(SEOV);对鼠肺及病人携带HV的部分M片段及部分S片段进行核苷酸序列分析表明,发现SEOV的同源性较高,变异较小,稳定性较高,而且地理位置相近地区基因组核苷酸序列的同源性很高(＞98.8％),具有小范围的地理聚集现象.结论 辽宁省流行的SEOV均为S3亚型,基因亚型分布比较单一.
关键词： 汉坦病毒(HV) 汉城型病毒(SEOV) 基因亚型 系统发生分析 分布 -
锦州市啮齿动物汉坦病毒分子流行病学特征分析
目的 了解辽宁省锦州市啮齿动物中鼠种构成、带毒率、汉坦病毒(HV)流行情况及病毒分型.方法 采用间接免疫荧光法(IFA)检测鼠肺中HV抗原;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增阳性样品中的部分M片段;构建系统发生树进行系统发生分析及分型.结果 2008-2013年锦州市出血热疫区捕鼠1 838只,分属2科4属5种,病毒携带率为4.24％ (78/1 838);各年之间鼠肺带毒率有统计学意义(x2=13.579,P =0.019,P ＜0.05);部分M片段序列分析表明,1 1株病毒与汉城病毒(SEOV)核苷酸序列同源性为96.2％～100％,而与汉滩型病毒(HTNV)同源性仅为70.6％ ～71.2％,系统进化树显示检测阳性的11株SEO起源相同,与BjHD01株病毒的亲缘关系近.结论 锦州地区HV优势毒株为SEO型,变异较小,基因型别较为稳定,并有明显的地区聚集性.
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吉林省普马拉病毒的RT-PCR检测与序列分析
目的 建立检测普马拉病毒的RT-PCR方法,确认吉林省存在普马拉病毒,并对病毒的基因片段进行分析.方法 采用RT-PCR方法,对吉林省抚松地区棕背( )鼠肺标本进行检测.对S片段核蛋白基因编码序列进行序列比较分析,绘制系统发生树.结果 研究表明在吉林省抚松地区存在普马拉病毒,采集于2005年和2006年的标本阳性率分别为7.34%和14.29%,呈逐年上升趋势.序列分析表明与其他普马拉病毒核苷酸序列同源性只有81.1%～83.3%.系统发生分析揭示,该病毒与在日本、韩国分离的普马拉病毒亲缘关系相对接近,并且在进化过程中处于更古老的节点.结论 在吉林省抚松地区可能存在普马拉病毒的一个新亚型.
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MATLAB 7.X生物信息工具箱的应用--系统发生分析(五)
MATLAB 7.X生物信息工具箱为广大用户提供了一个用于系统发生分析的综合环境,它能利用数据库资源,方便获取DNM蛋白质序列数据,所有操作简单高效,结果可视化程度高.在工具箱提供的开放环境里,用户还可以根据自己的目标来设计和利用分析工具.本文介绍MATLAB7.X生物信息工具箱在构建系统发生树方面的应用,以人科线粒体基因序列作为分子标记构建一株人科系统发生树为例,说明在MATLAB环境下对系统发生树的分析和处理.
