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中和试验发现西安地区为肾综合征出血热混合型疫区
目的 调查陕西西安地区汉坦病毒感染现状,分析当地肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)疫源地性质.方法 根据HFRS发病报告数据,分析西安HFRS的发病特点.通过荧光定量RT-PCR方法,检测西安HFRS疫区家鼠和野鼠携带汉坦病毒情况及病毒型别.微量中和试验确定西安本地HFRS病人、HFRS疫苗接种者和隐性感染者血清中的汉坦病毒中和抗体水平并分型,回顾性调查阳性感染者.结果 西安地区HFRS发病每年均有6-7月份的小高峰和10-12月份的大高峰;在当地642只家鼠和1 546只野鼠肺组织中检出汉滩病毒RNA136份;143份人血清中123份检测到汉坦病毒中和抗体,未检测到中和抗体的有20份.中和抗体阳性者中判定为汉滩病毒感染者92人,占74.80％;判定为汉城病毒感染者3人,占2.44％;不能区分病毒感染型别者28人,占22.76％,3例感染汉城病毒者分别为HFRS病人、疫苗接种者和隐性感染者,调查显示3例均为本地感染.结论 实验室和现场调查证实当地存在汉城型病毒本地感染,陕西西安地区是以汉滩病毒型为绝对优势的HFRS混合型疫区.
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对分离自褐家鼠的汉滩型和汉城型病毒的毒力测定
目的 比较分离自褐家鼠的汉滩病毒(HTNV)CGRn5310株和汉城病毒(SEOV)HR54株的毒力差异,探索汉坦病毒(HV)"溢出"到非宿主动物后的毒力变化.方法 选取从贵州省褐家鼠中分离的CGRn5310株HTNV和从河南省褐家鼠分离的HR54株SEOV,用不同稀释度的病毒悬液经脑内接种于昆明乳鼠,观察小鼠发病症状,测定其半数致死量(LD_(50)),并用免疫荧光法检测脑与肺组织内HV特异抗原.结果 接种2株病毒后的小鼠生长缓慢,均出现不同程度的神经症状.CGRn5310株的LD_(50)是10~-6.42,HR54株的LD_(50)是10~-4.51.在死亡小鼠的脑与肺组织中均能检测到HV特异抗原,而对照组脑与肺组织内未检测到病毒抗原.结论 从褐家鼠中分离到的CGRn5310株HTNV的毒力大于从褐家鼠中分离到HR54株SEOV,这可能意味着HV"溢出"到非宿主动物后毒力变化较小.
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汉滩病毒84Fli株DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的初步研究
为了加强我国病毒性出血热的防治,本研究将汉滩病毒84Fli株核蛋白S和糖蛋白M编码片段分别克隆至pcDNA3.0载体,构建了pcDNA3/84S和pcDNA3/84M重组质粒,等量混合采用肌肉注射途径免疫C57BL/6小鼠,免疫3次,每次间隔2周,同时与双价出血热病毒灭活疫苗进行对比.ELISA及免疫荧光(IFA)分别检测小鼠血清中汉滩病毒核蛋白及糖蛋白特异性抗体,流式细胞仪和ELISPOT方法分析小鼠免疫后的细胞免疫水平.微量中和试验检测小鼠血清抗体的的中和活性.结果显示,DNA疫苗免疫组C57BL/6小鼠在初次免疫2周后即能检测到汉滩病毒核蛋白与糖蛋白的特异性抗体,与灭活疫苗组相比,重组质粒诱导的抗体滴度高,产生时间早,产生的抗体具有中和活性;同时可诱导产生特异性细胞免疫应答.研究表明,汉滩病毒pcDNA3/84S和pcDNA3/84M重组质粒能有效刺激小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫应答.
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长白县黑线姬鼠携带汉坦病毒的S基因特征研究
为了解长白县黑线姬鼠中汉坦病毒流行情况及病毒型别,采用巢式RT-PCR方法筛查鼠肺RNA,并对PCR阳性样本进行全S基因的扩增、克隆及测序；构建系统发生树并进行分子进化分析.结果显示:共捕获黑线姬鼠58只,共检测出4份阳性标本,阳性率6.90％.经过序列测定及进化分析显示黑线姬鼠所携带的病毒与汉滩病毒第6基因亚型标准株核苷酸的同源性为95.8％～96.3％,氨基酸同源性为98.6％～99.5％.同时发现,长白县黑线姬鼠携带的汉滩病毒的NP蛋白共有1个特异性氨基酸位点为S387.
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汉滩病毒S基因的分段表达及其线性和构象型抗原表位分析
构建汉滩病毒76-118 N蛋白及其分别从N-端和C-端缺失的共6个突变体,在大肠杆菌BL-21中进行表达,并对其中一些蛋白进行了纯化.通过Western blot、酶联免疫吸附试验(ELISA)进行汉滩病毒N蛋白的抗原表位分析,N蛋白及6个缺失突变体都与组特异性抗体L13F3呈阳性反应,而缺失突变体与型特异性抗体AH30呈阴性反应.构建汉滩病毒76-118 N蛋白及其6个缺失突变体的真核表达载体,并在COS7细胞中进行表达.通过间接免疫荧光试验(IFA)进行汉滩病毒N蛋白的抗原表位分析,病人血清与真核表达的N蛋白及6个缺失突变体呈阳性反应.而仅有N蛋白及缺失N端1～30位氨基酸序列的NPN30与型特异性抗体AH30呈阳性反应.证实组特异性抗体L13F3结合的抗原表位位于N端1～30位氨基酸;而C端抗原表位对于型特异性抗体AH30与N蛋白的识别和结合具有重要意义,缺失N端100位氨基酸序列可能破坏羧基端构象型表位,也可以影响N蛋白与AH30的结合.
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汉滩病毒S基因免疫小鼠的细胞免疫应答的初步观察
将汉滩病毒S片段编码区基因插入到含CMV启动子/增强子(promoter/enhancer)的真核表达载体pVR1012中,构建成真核表达质粒pVRS22.质粒DNA经纯化后,注射经布比卡因预处理的Balb/c小鼠的股四头肌,多次免疫后,免疫小鼠淋巴细胞增殖功能的检测结果显示:免疫鼠的脾细胞能够对体外抗原刺激产生增殖反应;CTL活性检测结果表明:靶细胞51Cr的释放是效应细胞依赖性的,并且与病毒感染组的淋巴细胞的细胞毒活性相似.结果显示,用重组质粒pVRS22免疫小鼠,能够诱导小鼠产生特异性淋巴细胞增殖反应和细胞毒性T淋巴细胞活性(CTL).
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重组汉滩病毒核蛋白的纯化及鉴定
目的纯化重组表达的汉滩病毒核蛋白.方法重组菌经IPTG诱导后,表达的目的蛋白为带有谷胱甘肽转硫酶(GST)标签的融合蛋白,并以包涵体形式存在.将包涵体变性、复性后,采用Glutathione Sepharose 4B 亲和色谱对核蛋白进行纯化,并用夹心ELISA和Western blot检测纯化蛋白.结果表达产物第一次过柱亲和层析后可去除杂蛋白,获得纯化的核蛋白与谷胱甘肽转硫酶的融合蛋白,再经凝血酶酶切,第二次过柱亲和层析后获得的穿过峰为核蛋白,洗脱峰为GST.纯化的融合蛋白和纯化的核蛋白均为SDS-PAGE单点纯,并具有良好的抗原活性.结论 Glutathione Sepharose 4B亲和色谱纯化重组汉滩病毒核蛋白是一种较为有效的方法.
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TLR4介导汉滩病毒感染的血管内皮细胞转录因子NF-κB和IRF-3的细胞核移位
目的 观察汉滩病毒(HTNV)感染的TLR4基因沉默的EVC304细胞(TLR4~-EVC304)转录因子NF-κB和IRF-3的细胞核移位情况,为抗HTNV固有免疫及其信号转导研究提供新资料.方法 用汉滩病毒76-118株分别感染TLR4~-和TLR4~+EVC304细胞,同时以LPS作为阳性对照组,无任何刺激作为阴性对照组,6 h后用间接免疫荧光方法检测NF-κB和IRF-3的细胞核移位现象.结果 汉滩病毒76-118株刺激6 b后,在TLR4~+EVC304细胞中,NF-κB和IRF-3发生细胞核移位,而在TLR4~- EVC304细胞中未出现细胞核移位现象.结论 TLR4可能介导了HTNV感染的EVC304细胞中NF-κB和IRF-3的细胞核移位.
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汉滩病毒Z10株G1糖蛋白编码区克隆及序列分析
目的 汉滩病毒浙10(Z10)株G1糖蛋白编码区的克隆、核苷酸序列分析,提供我国应用为广泛的肾综合征出血热(HFRS)疫苗株序列资料.方法 反转录PCR法扩增G1基因片段,克隆入pGEM-T载体,双脱氧链终止法测定核苷酸序列.结果 测定1449个核苷酸,可编码483个氨基酸.与Ⅰ型76/118、Lee、Hojo株比较核苷酸同源性分别为87%、86%、86%,与Ⅱ型R22株同源性为67%.比较氨基酸序列Z10株与Ⅰ型、Ⅱ型病毒的同源性分别为(94～95)%,(77～80)%.Z10与76/118 G1编码的氨基酸变异多发生于N′端,大的变异区是第84～93位氨基酸的10个连续变异.结论 Z10株病毒和其它汉滩病毒在核苷酸序列虽有较大差异,但在氨基酸水平上的同源性仍较高,可能是Z10株沙鼠肾疫苗具有较好免疫保护作用的原因.
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HFRS患者汉滩病毒核蛋白特异性T细胞克隆及其靶细胞的建立
目的建立肾综合征出血热(HFRS)患者汉滩病毒(HTNV)核衣壳蛋白(NP)特异性CTL克隆,为HTNV NP T细胞表位鉴定及HFRS患者T细胞免疫功能研究奠定基础.方法采用Ficoll密度梯度离心法分离HFRS患者外周血单个核细胞(PBMC),用灭活HTNV和IL-2体外刺激,有限稀释法建立T细胞克隆,流式细胞术鉴定克隆表型.并用EB病毒(EBV)转化B淋巴细胞,建立B淋巴母细胞样细胞系(B-LCL),以含HTNV S 基因的重组痘苗病毒感染B-LCL作靶细胞,以CTL 克隆作效应细胞进行细胞毒杀伤试验,测定T细胞克隆的抗原特异性.结果 T细胞克隆能特异性识别表达NP的B-LCL.在5名患者中,3名有较高的杀伤率,并自2名患者建立了5株HTNV特异性CTL克隆,其表型为CD8+均大于60%.结论成功建立了HFRS患者HTNV NP特异性CTL克隆及其靶细胞.NP是HFRS患者HTNV特异性CTL应答的主要靶抗原之一.
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RT-PCR扩增汉滩病毒及其核苷酸序列的发生树分析
目的用RT-PCR方法扩增肾综合征出血热病人血样品中的汉滩病毒RNA,对扩增产物进行测序并分析汉滩病毒基因组的变异. 方法用引物PⅠ/PⅡ对22例血样品中的汉滩病毒RNA进行第一次PCR扩增,PⅠ/PⅡ扩增样品再用PⅠ1/PⅡ2引物进行槽式RT-PCR扩增,将扩增效果良好的PCR产物进行测序,对测序结果用生物化学软件进行同源性比较和进化树分析.其中HV226样品用引物P1/P2进行RT-PCR扩增. 结果 22例肾综合征病人血样品用PⅠ/PⅡ和P1/P2引物扩增有19例阳性,其中编号 W613、W1141样品用PⅠ1/PⅡ2进行槽式扩增后对其扩增产物直接进行测序.HV226 号样品用引物P1/P2进行扩增后,其扩增产物也直接进行测序.对该3株序列测定结果进行比较分析发现,编号W613、W1141样品核苷酸序列与HV114株的同源性为84%,而与HTN76-118株的同源性为99%.HV226号样品与HV114有95%的同源性,而与HTN76-118有82%的同源性.进化树分析表明, W613, W1141与HTN76-118株位于同一分枝,而HV226与HV114、A9株处于同一分枝. 结论湖北地区汉滩病毒至少存在2个亚型,其中W613、W1141与HTN76-118的核苷酸序列高度同源, 属于同一亚型.而HV226与HV114属于另一亚型.
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肾综合征出血热病人恢复期血清对汉滩病毒感染体外培养神经元的保护作用
目的 用体外培养的昆明小鼠胚胎脑皮质神经元,感染汉滩病毒后,加入肾综合征出血热(HFRS)病人恢复期血清,观察病毒感染神经元后细胞的变化以及HFRS病人恢复期血清对神经元的保护作用.方法 将病毒感染的神经元加入不同浓度的HFRS病人恢复期血清(同时设立阴性血清对照组及正常细胞对照组和感染病毒对照组),使用MTT比色试验检测神经元存活情况.结果 各组神经元活性的MTT比色试验显示,病毒感染组与未感染对照组比较差异有非常显著性(P＜0.001),阴性血清对照组与正常细胞对照组比较,差异也有统计学意义(P＜0.01).HFRS病人恢复期血清保护组与阴性血清对照组各小组间比较差异也都有非常显著性(P＜0.001).结论 HFRS病人恢复期血清具有一定的中和病毒保护培养的神经元作用.
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汉滩病毒核衣壳蛋白C-端T细胞表位鉴定
目的鉴定汉滩病毒核衣壳蛋白(HTNV NP) C-端T细胞表位,为肾综合征出血热(HFRS)发病机理、疫苗研制及抗病毒免疫反应研究奠定基础.方法采用Ficoll密度梯度离心法分离HFRS恢复期患者外周血单个核细胞(PBMC).用IFN-γ ELISPOT实验和T细胞增殖实验,测试7名患者PBMC对23条NP C-端合成多肽的T细胞应答.结果 IFN-γ ELISPOT实验结果表明,2名供体(3、4)可分别检测到对51、70号2条多肽特异性T细胞应答.在供体3,70号肽特异性T细胞频率为45 SFC/106PBMC;在供体4,51号肽特异性T细胞频率为82 SFC/106PBMC.T细胞增殖实验与ELISPOT结果基本一致,但53号肽和64号肽还可分别刺激供体1和供体4的T细胞增殖,而未能诱导IFN-γ分泌.结论 51号和70号多肽可能是NP C-端较强的T细胞表位.
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应用噬菌体肽文库筛选McAb F3特异性结合肽
目的应用噬菌体展示肽文库筛选可与抗汉坦病毒囊膜蛋白单抗F3特异性结合的配体肽. 方法采用protein-A亲和层析纯化的F3 单抗为筛选配基,对噬菌体展示的随机12肽文库进行生物亲和淘洗;夹心ELISA、竞争ELISA鉴定筛选克隆的结合特性,并进一步对阳性克隆进行序列测定和分析. 结果通过3轮生物淘洗,能被抗体捕获的噬菌体克隆为91.7%(11/12);ELISA测定显示筛选到的噬菌体短肽能与F3单抗特异性结合;序列分析表明7个阳性克隆氨基酸序列相同,均为-MHGPTKNQMWHT,同源性分析显示该序列与HTNV/SEOV M蛋白G2区第750～759位氨基酸有较高的同源性. 结论获得了具有良好结合活性的模拟表位肽,为基于表位水平的HFRSV(肾病综合征出血热病毒)特异性分子多肽疫苗的设计提供了重要依据.
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我国疫区HFRS患者汉滩病毒核蛋白特异性CTL克隆的建立
目的探讨汉滩病毒核衣壳蛋白(HTNV-NP)诱生的特异性细胞免疫的分子基础,阐明HFRS的发病机理. 方法分离HFRS患者的PBMC,建立HTNV-NP特异性的CTL克隆,同时将克隆有HTNV S基因不同片段的真核表达载体转染患者自身的B淋巴母细胞系(BLCL),建立CTL靶细胞系,并进行细胞杀伤试验. 结果建立的特异性CTL克隆对表达完整NP、NP羧基和氨基端肽段的靶细胞均有比较明显的杀伤效应,平均杀伤率分别为50.2%、39.0%和25.4%. 结论 HTNV-NP优势T细胞表位可能主要位于病毒核蛋白的羧基端.
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汉滩病毒S基因真核表达载体的构建及免疫小鼠的初步研究
目的 研究汉滩病毒S片段编码区基因免疫小鼠的作用.方法 利用基因重组技术,构建含汉滩病毒S片段编码区基因的真核表达质粒.用此质粒直接注射到BALB/c小鼠骨骼肌内进行DNA免疫,用间接免疫荧光法检测免疫小鼠血清中汉滩病毒抗体.结果 在初次免疫的小鼠血清中检测出有低滴度的汉滩病毒抗体.加强免疫后,抗体水平显著上升,免疫荧光抗体(IFAT)滴度高达1:640.约87%的免疫动物发生了血清抗体阳转.抗体水平及小鼠血清抗体阳转率与注射的质粒DNA剂量及注射次数有关.结论 应用基因免疫技术能够诱导机体产生针对汉滩病毒的特异性免疫应答.
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汉滩病毒S基因0.7kb片段真核载体的构建与鉴定
目的:克隆汉滩病毒76-118株S基因0.7kb片段,用瞬时表达了解其在真核细胞中的表达.方法:从质粒pcDNA3.1～S1.3双酶切0.7kbs基因,并装到质粒pEGFP-N1的多克隆位点上,用脂质体法转染VERO-E6细胞,荧光显微镜下观察.结果:目的基因片段已插入质粒载体,并在转染的真核细胞内成功表达.结论:构建了pEGFP-Nl-SO.7重组表达质粒,为汉滩病毒S基因的动物免疫奠定了基础.
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抗汉滩病毒McAb可变区基因克隆及序列分析
目的克隆和分析抗汉滩病毒单克隆抗体(McAb)H7可变区基因.方法根据鼠源抗体可变区(V)氨基酸序列,设计合成一组抗体重、轻链可变区(VH/VK)简并引物.采用一步法提取McAb H7细胞总RNA,通过RT-PCR扩增V基因,并进行核苷酸序列测定和分析.结果通过RT-PCR成功克隆了H7可变区重轻链基因,序列分析表明均为开放阅读框,符合小鼠抗体框架结构,含有明确的4个骨架区和3个抗原决定簇互补区,与抗体二硫键形成有关的两个特征性半胱氨酸亦高度保守.同源对比表明,H7-VK长357 bp,编码119个氨基酸,属JK4重排;H7-VH长360 bp,编码120个氨基酸,属JH4重排.经GenBank查询证实为新基因,登记号为AY245601和AY245602.结论 McAb H7可变区基因的获得,为有目的地开展HFRSV基因工程抗体的遗传改造及体外亲和力成熟等研究奠定了基础.
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汉滩病毒包膜糖蛋白糖基化位点突变体重组假病毒的构建及初步鉴定
目的:为进一步研究汉坦病毒包膜糖蛋白的糖基化与病毒的感染性和免疫原性等的关系,构建含有汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白(GP)糖基化位点突变体的重组假病毒.方法:利用定点突变的方法,分别突变了HTNV 76-118株的5个N-糖基化位点并克隆入慢病毒表达载体,与包装质粒共转染293T细胞,构建5株重组假病毒.感染HEK293细胞后,进行RT-PCR鉴定及免疫荧光检测.结果:经测序显示构建的含有N-糖基化位点突变体的5个重组假病毒原序列中的天冬酰胺(N)均被置换为谷氨酰胺(Q).RT-PCR结果显示5个重组假病毒均有HTNV GP基因的表达.免疫荧光检测5个重组假病毒均可表达HTNV的Gn和Gc蛋白.结论:成功构建了含有HTNV包膜糖蛋白糖基化位点突变体的5个重组假病毒,分别命名为rLV-M1、rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4和rLV-M5.本研究为明确N-糖基化对汉坦病毒生物学活性的影响提供了有利的研究工具,并为汉坦病毒疫苗及致病机理的进一步研究打下了一定的基础.
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汉滩病毒感染血管内皮细胞后上调HLA I类分子的表达
目的:观察汉滩病毒感染血管内皮细胞(EVC304)前后,HLA-I类分子中HLA-A、HLA-B、HLA-Cw3、HLA-Cw5表达上的差异.方法:以汉滩病毒76-118株感染EVC304细胞作为实验组,以无任何刺激的EVC304细胞作为阴性对照组.6h后用RT-PCR的方法对HLA-A、HLA-B、HLA-Cw3、HLA-Cw5的mRNA进行反转录和基因片段的扩增,在mRNA水平上检测其表达差异.结果:在HTNV感染以后,EVC304细胞中HLA-A、HLA-B、HLA-Cw3、HLA-Cw5 mRNA表达均呈升高现象,其中HLA-A、HLA-B和HLA-Cw5的mRNA表达与未感染细胞相比明显升高.结论:HTNV感染血管内皮细胞后,可以诱导HLA-A、HLA-B、HLA-Cw3、HLA-Cw5的表达升高,从而诱发机体特异性免疫应答,导致免疫损伤的发生.这或许是肾综合症出血热的发病机制之一.
