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2011-2014年青岛地区甲型H3N2流感病毒基因进化分析
目的 了解2011-2014年青岛地区人群甲型H3N2流感病毒流行株基因进化及抗原变异趋势.方法 选取2011-2014年间青岛地区流行的甲型H3N2流感病毒64株,提取病毒RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HA、NA、MP 3个基因片段,并进行序列测定,对各基因片段进行系统发育分析及基因和氨基酸位点变异分析.结果 HA进化树分析表明,甲型H3N2流感病毒基本上分为三大分支,并且每个分支与当年的疫苗株都不在同一分支上;HA1蛋白抗原决定簇共有8个位点发生了变化;NA蛋白酶活性中心及周围相关位点氨基酸组成保守,未检测到耐奥司他韦和扎那米韦的变异位点.M2蛋白均发生S31N突变.结论 2011-2014年青岛地区流行的H3N2流感病毒在持续不断地发生基因变异而产生抗原漂移;毒株全部为烷胺类药物耐药株,但对神经氨酸酶抑制剂敏感.
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2013年宜春市甲型H1N1流感病毒分离鉴定及HA基因分子进化分析
目的 对2013年江西省宜春市甲型H1N1流感病毒HA基因序列及其编码的氨基酸序列进行分子进化分析,为防控甲型H1N1流感大流行和常规监测提供科学根据.方法 随机选择11株2013年宜春市疾病预防控制中心流感监测实验室分离到的甲型H1N1流感病毒毒株,提取病毒RNA,One-step RT-PCR扩增HA基因并双向测序.以世界卫生组织疫苗推荐株A/California/07/2009(H1N1)(GenBank:CY121680)和几株国内外近几年分离的流感甲型H1N1毒株的HA基因为参考序列,采用DNAStar7.0和Mega 5.0软件对HA基因及其编码的氨基酸序列进行比对,绘制分子进化树,进行HA变异分析.结果 2013年宜春市11株所测甲型H1N1流感病毒与疫苗推荐株亲缘性较近,进一步参考几株国内外近几年分离到的流感甲型H1N1毒株,HA没有发生较大变异;其HA基因序列二硫键、糖基化位点未发生变异;尽管有7株毒株同时在抗原决定簇区A区和受体结合位点130环或其附近发生单个位点氨基酸替换变异,但未形成流行病学变异新种.结论 目前的甲型H1N1流感疫苗仍对人群有保护作用,而抗原决定簇和受体结合位点的变异提示仍需要密切关注甲型H1N1流感的再次流行.
关键词： 甲型H1N1流感病毒 HA基因 序列分析 分子进化 -
2005-2009年大连市流感病毒血凝素基因遗传特性分析
目的 分析大连市2005- 2009年流感病毒血凝素(HA)基因变异情况.方法 采用MDCK细胞分离培养季节流感H1N1亚型28株;H3N2亚型9株;B型(Yamagata系)24株,采用RT-PCR法分节段扩增各毒株血凝素基因,并进一步对各片段进行核苷酸和氨基酸序列测定分析.结果 2005-2009年,大连市分离到的甲型H1N1病毒变异较大,其中2009年分离的一株H1N1亚型毒株A/liaoningxigang/136/2009 (H1)与该年WHO推荐的疫苗株相比,抗原决定簇B区上有4个位点发生了突变,属于新的变种.2005、2007年分离的H3N2流感病毒株,与疫苗株相比序列同源性较高,并未发生大的变异;2007-2008年流行的B型Yamagata系病毒与疫苗株B/Shanghai/361/02相比,有7个氨基酸位点发生改变,其中两个位于抗原决定簇,并于196位增加一个糖基化位点.结论 各年度WHO推荐的疫苗株与流行株之间匹配性不完全一致,每年由于核苷酸序列的变化而引起了不同程度的抗原性漂移.
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广东地区流感H3N2毒株血凝素基因特征、进化和变异分析
为揭示广东地区2007～2010年甲型H3N2毒株血凝素(HA)基因特征和变异,采用时空抽样方法抽样,检测广东2007～2010年甲型H3N2毒株HA基因核苷酸序列,同时检索全球HA基因序列作为对照,采用Lasergene 7.1和Mega 5.05软件对HA基因核苷酸序列进行比对和分析；并结合流行病学资料,对变异毒株进行进化速度分析；同时进行抗原分析.结果发现,广东2007～2010年H3N2毒株HA基因同义进化(Ks)和错义进化(Ka)速度分别为2.06×10-3～2.23×10-3核苷酸/年和1.05×10-3～1.21× 10-3核苷酸/年,HA1较HA2的错义突变速率要高3.13倍.与疫苗株A/Perth/16/2009的HA基因比较,2009年广东毒株同源性达到98.8％～99.7％、2010年同源性达到98.0％～98.4％.在广东2007～2010年毒株中,HA1五个抗原表位均有氨基酸位点变异,尤其是2010年毒株B区(N160K)和D区(K174R/N)的变异；此外,广东2010年毒株受体结合部位(RBS)还发生K189E/N/Q和T228A置换变异；两个糖基化位点变异影响到抗原性；目前使用的H3N2疫苗株与目前流行毒株的抗原性有差异.广东地区2007～2010年的毒株中,血凝抑制抗体的抗原分析结果有差异.结果提示,目前广东乃至全球甲型H3N2毒株HA1B区和D区均有氨基酸位点变异,RBS的两个位点发生置换,糖基化位点变异影响到表位A区和B区抗原性；与WHO推荐2011年流感H3N2毒株疫苗株比较,目前流行毒株HA基因有抗原位点变异.
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辽宁省1997～2014年H1a基因亚型麻疹野病毒流行株血凝素(H)基因特征分析
了解辽宁省1997～2014年流行麻疹野病毒血凝素(Hemagglutinin,H)基因特征,为控制和消除麻疹提供依据.本研究选用1997～2014年分离的63株H1a基因亚型麻疹病毒(Measles,MEV),应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别扩增麻疹病毒(MEV)血凝素(H)基因全长和N基因的450个核苷酸片段,对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析.将辽宁省63株MEV序列与GenBank中收录的1993～1994年麻疹病毒H基因型代表株、中国疫苗株沪191(S-191)和长春47(C-47)基于H全长构建基因亲缘性关系树,进行核苷酸和氨基酸变异分析.结果显示辽宁省1997～2014年63株MEV均属于H1基因型的H1a亚型,并分为两个簇(cluster 1和2).H基因的进化速度低于N基因的进化速度.所有63株MeV在H基因第240位均由丝氨酸(Ser S)突变为天冬酰胺酸(Asn N),在243位由精氨酸(Arg R)突变成甘氨酸(Gly G),第481位由酪氨酸(Tyr Y)突变为天冬酰胺酸(Asn N),另外在397位上cluster 2毒株均由脯氨酸(Pro P)突变成亮氨酸(Leu L),其他具有生物学和免疫学活性的位点未发生改变.
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山东省甲型H1N1流感病毒病原学及基因特性研究
在2009～2010年监测年度开展甲型H1N1流感病毒学监测并进行病原学分离鉴定,以及对血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)特性分析,研究其基因变异情况.采集了17126份发热患者的鼻、咽拭子标本,采用逆转录实时荧光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)进行核酸检测,其中甲型H1N1流感病毒核酸检测阳性4004份,总阳性率为23.38%.对阳性标本开展病毒分离,并对分离的甲型H1N1流感病毒的HA、NA基因序列进行测序.利用DNAStar软件对序列进行同源性分析发现与WHO推荐的疫苗株相比,山东省甲型H1N1流感流行株HA、NA基因同源性分别为96.9%～99.3%和99.1%～99.6%;利用Mega 4.0软件进行基因进化分析和氨基酸进化分析发现,与WHO推荐的疫苗株相比,山东省甲型H1N1流感流行株有21个血凝素基因的氨基酸发生替换,其中11个氨基酸位点位于抗原决定簇区,一个糖基化位点发生改变;有16个神经氨酸酶基因的氨基酸发生了替换,一个糖基化位点发生改变;未发生神经氨酸酶蛋白275位H→Y的替换.结果显示山东省甲型H1N1流感暴发流行株HA基因和NA基因均具有高度同源性,HA蛋白和NA蛋白均存在不同程度的氨基酸替换,部分流行株抗原决定簇和糖基化位点发生改变,所有病毒均对达菲类药物敏感.
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HA基因322位和329位氨基酸对H5N1亚型禽流感病毒毒力的影响
A/mallard/Huadong/S/2005(S,IVPI=2.65)和A/mallard/Huadong/Y/2003(Y,IVPI=O),是对麻鸭具有不同致病力的病毒.两病毒的HA裂解位点区有2个氨基酸差异,S病毒在HA裂解位点区322是Leu(L322),329位缺失(-329),而Y病毒322位是Gin(Q 322),329位是Lys(K329).根据这两个位点的差异,利用反向遗传系统,以S和Y病毒各自为骨架,拯救HA基因突变病毒,检测获救的突变病毒对麻鸭的毒力.可以得知,以S病毒为骨架,将S病毒HA基因322位Leu替换为Gln和(或)在329位添加Lys,以及用Y病毒的HA(Q322L,K329-)替换S病毒HA,获救的重组病毒对麻鸭亦完全无致病力;但以Y病毒为骨架,将Y病毒HA基因322位Gln替换为Leu和(或)在329位缺失Lys后,Y重组病毒对麻鸭的毒力上升.结果提示,S和Y病毒HA基因裂解位点区322和329氨基酸残基突变或缺失均影响病毒对麻鸭的致病力,且HA基因与其它基因的匹配性显著影响病毒对麻鸭的致病力.
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抗体选择压作用下H9N2亚型禽流感病毒NA基因的变异
将LG1株H9N2亚型禽流感病毒在带有抗LG1株母源抗体的鸡胚中分4个独立系列连续传40代后,有3个系列从10～20代起在NA基因的#99位发生了可稳定遗传的碱基“G”到“A”的突变,并使氨基酸由蛋氨酸变为异亮氨酸；有2个系列从20～30代起在#473位发生了可稳定遗传的由“A”到“G”的碱基突变,导致相应的氨基酸由天冬酰胺变为丝氨酸,另一个传代系列在50代时也发生了同样的突变.在无抗体的鸡胚上的2个独立对照系列同样传了80代,在这2个位点没有发生突变,表明这2个突变与抗体的选择压相关.在抗LG1母源抗体阳性鸡胚的连续40代传代过程中,NA基因在有抗体组的四个传代系列碱基的非同义突变(NS)与同义突变(S)比为4.6(321/7),而在无抗体组NS/S比为2.0(16/8).有抗体组NS/S值显著高于无抗体组,也显示出抗体的选择压作用.
关键词： H9N2亚型禽流感病毒 HA基因 NA基因 抗体选择压 基因变异 -
甲型H1N1流感病毒HA蛋白结构和功能研究进展
自2009年3月,甲型H1N1流感疫情相继在包括中国在内的许多国家暴发,对人体健康和社会经济发展造成了严重危害.血凝素(HA)蛋白是重要的病毒表面糖蛋白,主要有3种功能:①与宿主细胞表面受体结合；②引起病毒包膜与靶细胞间的膜融合；③刺激机体产生中和性抗体.本文综合了近年来的研究成果,对甲型H1N1流感病毒HA蛋白结构、主要功能、进化、抗原性的研究进展进行了综述.
关键词： 甲型H1N1流感病毒 HA基因 进化 抗原性 -
禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/SS/94(H9N2)HA基因的克隆及序列分析
禽流感是由A型流感病毒引起的禽的一种疾病综合症.1878年首次在意大利爆发流行,当时称该病为"鸡瘟".之后,许多国家和地区都有该病的报道,包括美国、英国、澳大利亚、爱尔兰、比利时、荷兰、法国、俄罗斯、加拿大、以色列、匈牙利、日本、中国(包括香港)等[1-3].
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山东地区16株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析
为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)山东分离株的遗传变异情况,采用RT-PCR技术对16株从山东不同地区分离的H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进行扩增、克隆和测序,并对所获得的HA全序列进行同源性和遗传进化分析.结果显示,16个分离株的裂解位点均为RSSR↓ GLF,符合低致病性禽流感病毒的分子特征；有7～9个潜在糖基化位点;受体结合位点除198位有变异,其他位点均较保守；234位氨基酸均为L,具有与哺乳动物唾液酸α,2-6受体结合的特征；16个分离株HA基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为96.3％～99.9％和97.1％～99.6％；16个分离株同属于欧亚分支中的A/Duck/Hong Kong/Y280/97亚群.
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2016～2017年江苏省人感染H7N9禽流感病毒HA和NA基因分子进化分析
本研究对2016～2017年江苏省23株人感染H7N9禽流感病毒的HA基因和NA基因分子进化特征进行分析,为更好的预防和治疗人感染H7N9禽流感病例提供科学依据.通过RT-PCR方法扩增23株病毒的HA和NA基因,采用Sanger测序法进行测序,序列分析采用Mega6.0等软件.结果显示:23株H7N9病毒的HA和NA基因与WHO新推荐的候选疫苗株A/Hunan/2650/2016同源性较高(HA基因核苷酸与推导氨基酸序列同源性分别为99.1％～99.4％,99.5％～100％;NA基因核苷酸与推导氨基酸序列同源性分别为97.7％～98.0％,98.2％～98.5％).23株病毒HA蛋白裂解位点序列均为PEIPKGR/GL,未出现多个碱性氨基酸,属于低致病性禽流感病毒分子特征.HA蛋白受体结合位点出现了G186V、Q226L、A134V氨基酸位点的变化,保留双受体结合特性.其中一株病毒A/Suzhou/88/2016的NA蛋白发生H276Y变异,表明对神经氨酸酶抑制剂产生抗性.2016～2017年江苏省禽流感H7N9病毒株HA基因和NA基因处于不断的点突变当中,提示我们需要加强对江苏省H7N9禽流感病毒进行持续的病原学监测.
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H9亚型禽流感病毒HA基因的克隆与序列分析
目的 扩增、克隆H9N2 HA基因,并进行序列分析,为H9N2流感病毒种间及跨种传播机制研究奠定基础.方法 设计特异性引物,扩增克隆H9N2亚型禽流感病毒,测序后进行序列分析.结果 成功克隆出4株H9N2亚型禽流感病毒,全长均为1.7 kb,ORF为1 683 bp,编码560个氨基酸;联机检索,与参考毒株比对核苷酸和氨基酸同源性均在90%以上.结论 成功克隆4株H9N2亚型禽流感病毒,序列分析显示其核苷酸和推导氨基酸与参考毒株高度同源.
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2014-2017年盐城地区甲型H1N1流感病毒HA、NA基因变异分析
目的 研究盐城地区2014-2017年甲型H1N1血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)分子遗传进化特征.方法 将盐城地区2014-2017年流感监测哨点医院以及流感暴发点采集的流感样病例标本进行核酸、病毒分离检测,选取2014-2017年甲型H1N1毒株,采用一步法RT-PCR方法扩增HA1和NA基因,扩增产物经测序,采用相应的生物信息软件进行核苷酸和氨基酸位点变异及基因种系进化特征分析.结果 2014-2017年抽取的17株甲型H1N1毒株HA1和NA基因各自分支的聚类关系基本一致,分为4个进化分支.与疫苗株A/California/07/2009(H1N1)相比,盐城地区毒株HA1基因编码区共涉及3个抗原表位(Ca、Sa、Sb)和6个抗原位点(K154R、S162N、K163Q、S185T、L191I、S203T)变异;受体结合位点220环中有3个位点(D222G/N、G223R和E224K)发生变异,190螺旋中涉及1个位点(L191I)的变异;2017年两株毒株(A/Jiangsu-YC/SWL1540/2017、A/Jiangsu-YC/SWL1545/2017)增加了1个162NQS糖基化位点.抗原表位、受体结合位点、糖基化位点发生了一定程度变异,导致在基因层面上A/California/07/2009(H1N1)疫苗株产生的保护效果有限,而2017年分离的两株毒株(A/Jiangsu-YC/SWL1540/2017和A/Jiangsu-YC/SWL1545/2017)与疫苗株A/Michigan/45/2015(H1N1)具有较好的保护效果.17株分离株未发生NA蛋白酶活性位点以及耐药位点的变化,部分毒株NA基因编码糖基化位点有一定变化.结论 2014-2017年盐城地区流行的甲型H1N1毒株HA1和NA基因正逐渐发生变异,这些变异位点的积累很可能会导致流感病毒发生实质性的抗原性的漂移.
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2016-2017年苏州市人感染H7N9禽流感病毒HA基因进化分析
目的 监测分析2016-2017年苏州市第五波H7N9禽流感疫情中病毒分子流行特征,为本地区H7N9流感病毒感染防控提供科学依据.方法 采集疑似急重症呼吸道感染病例咽拭子标本并提取病毒核酸,应用实时荧光定量-聚合酶链反应(Real-time PCR)方法检测甲/乙型流感病毒核酸,阳性标本继续进行各亚型分型检测(H1N1,H3N2,H5N1).H7N9阳性标本进一步进行病毒分离和血凝素HA基因测序分析.结果 2016年10月至2017年5月间苏州人感染H7N9病毒总体病死率为40％(22/55).检出高峰在12月份至次年2月,以60岁以上老年人居多,患者中位年龄为58岁.超过80％ 的确诊患者发病前有活禽暴露史.序列分析表明血凝素HA基因同源性为98.7％ ～100％.受体结合位点中的关键氨基酸也没有发生突变.此外,HA基因血凝素连接肽位置也没有发生多个碱性氨基酸插入.结论 目前H7N9病毒不会在人群中持续传播,直接接触活禽或被病毒污染的环境是人感染H7N9病毒的主要途径;在苏州流行的H7N9病毒对禽类仍然是低致病性的.
关键词： 禽流感 HA基因 急重症呼吸道感染 Real-timePCR H7N9病毒 -
2016年盐城地区麻疹病毒分子分型及血凝素蛋白基因特征分析
目的 鉴定2016年流行于盐城地区的麻疹野病毒的基因型别,并对血凝素蛋白基因进行分子进化特征分析.方法 通过实时荧光RT-PCR方法对2016年盐城市疑似麻疹病例咽拭子标本进行核酸检测,对麻疹病毒核酸阳性标本RT-PCR扩增核蛋白、血凝素蛋白基因并测序,采用相应的生物信息软件对核苷酸及氨基酸序列比对及基因亲缘关系进化特征分析.结果 2016年盐城地区麻疹病毒经基因型分型为H1a基因亚型和D8基因型.5株H1a代表株与江西代表株(KJ136545)聚集成簇形成独立的进化小分支,属H1a-1进化基因群分支;7株D8代表株与2009年美国代表株(JN635404)聚集成簇,属D8-3-2小分支基因群毒株.与疫苗株沪S191相比,盐城地区5株H1a基因亚型代表株240位氨基酸发生了S240 N的变异,丢失了238位N-连接的糖基化位点,7株D8基因型代表株未发生N-糖基化位点的变化.结论 2016年盐城地区麻疹病毒流行株主要为中国本土H1a优势基因亚型和D8输入基因型;除5株H1a基因亚型代表株丢失了238位N-连接的糖基化位点,盐城地区12株麻疹病毒HA基因大部分重要中和抗原位点未发生变异.
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1995-2007年深圳市H1N1流感病毒血凝素基因的序列分析
目的 研究1995-2007年深圳市流行的H1N1流感病毒血凝素(HA)的基因特性.方法 选取在该期间分离培养到的64株H1N1流感病毒,对其进行HA片段核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,用Simmonic软件和Mega软件对其进行分析.结果 深圳市H1N1流感毒株在进化树上可以划分为A、B、C三个分枝.部分2005-2006年毒株与2001年毒株在同一分枝上.通过同源性分析发现部分WHO所推荐的疫苗株在时间上滞后于深圳株.深圳H1N1株的4个抗原决定簇及受体结合位点均发生了氨基酸的替换.除1995年外其余年份的毒株均在137位上发生了氨基酸的缺失.结论 1995-2007年深圳市H1N1毒株氨基酸的变异主要集中在抗原决定簇及受体结合部位.并且抗原决定簇的变异活跃区域随时间的推移发生了转移.
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一起甲型H1N1流感疫情病原检测及其HA与NA基因特性研究
目的 确认引起一起流感暴发疫情的病原,阐明该病原的血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)的特性.方法 疫情中早出现流感样症状病例的咽拭子样本用real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感病毒核酸,采用鸡胚分离法进行病毒培养,选取两病毒分离株进行HA和NA核苷酸序列测定,并进行基因特性分析.结果 此次流感疫情是由甲型H1N1流感病毒引起的,其HA和NA基因均与参比毒株的HA和NA基因高度同源,NA基因没有发生H274Y突变.结论 本研究的甲型H1N1流感病毒分离株为疫苗亲本株和中国分离株的类似株,对神经氨酸酶抑制剂类药物(如达菲)敏感.
关键词： 甲型H1N1流感 Real-time RT-PCR HA基因 NA基因 -
鼠痘病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究
目的 建立快速、敏感、特异检测鼠痘病毒的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法.方法 针对鼠痘病毒血凝素HA基因设计特异性引物和探针,构建含有HA基因的标准质粒进行定量分析,建立TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,评价其敏感性、特异性和稳定性.对临床标本中的鼠痘病毒进行检测.结果 研究结果显示,建立的鼠痘病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法特异性为100％,与其他正痘病毒属病毒、非正痘病毒属病毒、细菌、真菌、寄生虫和细胞均无交叉反应.该技术灵敏度高,能精确定量检测鼠痘病毒DAN线性范围达10个数量级(100-109拷贝),低检测限度为4拷贝.该方法重复性非常好,组内变异系数和组间变异系数均小于3％.测试中相关系数、斜率和效率测量线性没有显著变化,表明该方法准确度高、精密度好.将其成功应用于临床标本中鼠痘病毒载量的定量检测,用普通PCR和测序进行确证.整个检测过程可在2h内完成,可以用作快速诊断方法.结论 本研究新建立的鼠痘病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,具有快速简便、特异性强、灵敏度高的特性,适用于动物源性产品中鼠痘病毒检测、食品和药品安全检查、环境监测、流行病毒调查,为临床标本中鼠痘病毒的快速定量检测提供了一种特异有效的评价工具,值得推广应用.
关键词： 鼠痘病毒 HA基因 Taqman MGB探针 实时荧光定量PCR 快速检测 -
青海省3株乙型流感病毒的基因序列分析
目的 了解青海省2010年3株乙型流感毒株血凝素HA抗原性和基因特性.方法 用MDCK细胞分离培养流感病毒,提取流感病毒核酸,采用RT-PCR方法扩增病毒HA基因,纯化产物进行氨基酸序列测定,用MEGA 4.0分析软件对基因种系进行特性分析.结果 青海省2010年人群中监测到的为B型Yamagata系毒株,与WHO推荐的疫苗株B/California/01/2009相比,其核苷酸和氨基酸序列未发生明显改变.结论 青海省乙型流感病毒优势流行株其抗原性未发生明显改变,提示2010年WHO推荐的乙型流感疫苗对青海省人群有明显的保护效果.
