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DNA指纹技术检测耐多药结核分枝杆菌的应用研究
目的 应用结核分枝杆菌DNA指纹技术,了解耐多药结核分枝杆菌的基因型状况并探讨耐多药结核病的分子流行病学.方法 以结核分枝杆菌插入序列IS6110序列为模板,设计一对特异外向引物,建立一种结核分枝杆菌DNA指纹技术方法,对临床标本中分离的220株耐多药结核分枝杆菌进行DNA指纹基因分析.同时对实验数据进行聚类分析,进行耐多药结核病分子流行病学研究.结果 根据结核分枝杆菌DNA指纹图谱分析,220株耐多药结核分枝杆菌均产生特征DNA指纹图谱,DNA指纹图谱变异很大.每一菌株DNA指纹的拷贝数介于3至18之间.其中大部分菌株,即205株(93.2%)包含6～13个拷贝,平均为11个带.这205株DNA指纹图谱中,162株为特异的,提示它们在流行病学上是独立的.有58株(26.4%)指纹图谱组成了15个簇,每簇2～8株,它们的IDNA指纹图谱相同,可能代表了近期的传播.尤其是在此DNA指纹图谱中,其中分子量为200 bp扩增带频率大,在220株耐多药结核分枝杆菌均出现.结论 结核杆菌DNA指纹技术检测可应用耐多药结核分枝杆菌DNA指纹图谱分型,并可用于耐多药结核病分子流行病学调查.
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山东省1例HIV长期不进展感染者的确证过程及随访情况
目的 描述山东省1例HIV长期不进展感染者的确证过程及随访期内实验结果的变化.方法 研究对象为1例27岁男性HIV感染者,2013年8月7日首次ELISA检测HIV抗体阳性;密切接触者为研究对象确证感染前接触过的3个同性性伴,其中第一个性伴已无法取得联系.采用中国艾滋病综合防治信息系统首次流行病学调查问卷,由调查员对研究对象的一般人口学特征及行为学特征等内容进行面对面调查.在首次ELISA检测结果呈阳性后,对研究对象进行了4次随访(2013年8月14、21、30日和9月16日),每次随访均进行胶体硒法快速检测、ELISA、Western blot、CD4+T淋巴细胞和病毒载量检测;在确证感染后,对其进行长期随访检测CD4+T淋巴细胞和病毒载量,观察研究对象的病程进展.结果 研究对象与性伴一维持性行为时间为2011—2012年,其间连续多次HIV抗体ELISA检测结果均阴性;与性伴二维持性行时间为2013年1—4月,且在2013年4月发生后1次无保护同性性行为,经溯源调查,性伴二为艾滋病综合防治信息系统抗病毒治疗模块中已进行抗病毒治疗的艾滋病患者;与性伴三维持性行为时间为2013年5—10月,性伴三的两次ELISA检测均阴性.2013年8月7日因需医院手术,研究对象进行了HIV抗体ELISA检测,结果呈阳性,而Western blot检测确证结果为HIV-1抗体不确定(带型为gp160/gp120/p24).随后4次随访,HIV抗体快速检测均为阳性,ELISA检测均为阳性,Western blot确证结果均为HIV-1抗体阳性(带型均为gp160/gp120/gp41/p24/p17).连续随访观察5年的结果显示,第1~4次CD4+T淋巴细胞检测结果分别为520、613、834、879个/μl,后续随访22次CD4+T检测结果持续维持在高水平,中位数为895个/μl;除有2次随访未检测病毒载量,共有5次随访检测病毒载量超过1 000拷贝/ml,其余19次检测结果均低于1 000拷贝/ml.同源性分析结果显示,研究对象与性伴二感染的HIV型别均为HIV-1 CRF_01AE型,gag基因的相似度是97.5%,推断其为传染源,而研究对象约在2013年4月底与传染源后1次无保护同性性行为时感染.结论 该感染者被发现时为HIV早期感染者;持续随访检测结果提示,该感染者属于长期不进展者.
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针刺对快速老化小鼠SAMP10转录调节因子NF-E2、YB-1、LRG47的影响
目的:探讨针刺延缓衰老的机制.方法:采用快速老化小鼠(SAMP10)、正常老化小鼠(SAMR1)为模型,运用地高辛标记的非放射性Northern blot技术,观察8月龄SAMR1对照组、SAMP10对照组、SAMP10针刺组及SAMP10非穴位刺激组全脑、皮层和海马NF-E2、YB-1、LRG47基因表达的变化.结果:SAMP10对照组小鼠NF-E2、YB-1、LRG47在全脑、皮层、海马中的表达下调,针刺后表达上调并趋向于正常组.结论:SAMP10小鼠脑衰老与NF-E2、YB-1、LRG47基因表达异常有关,针刺可以通过调节NF-E2、YB-1、LRG47基因表达增强红细胞系统功能和细胞增殖,提高细胞抗菌免疫,从而起到延缓衰老的作用.
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γδT细胞的扩增及其信号转导分子ζ链相关蛋白-70的免疫印迹检测
目的 检测人外周血γδT细胞的信号转导分子ζ链相关蛋白-70 (ZAP-70)的表达.方法 应用淋巴细胞分离液常规分离获取健康人外周血单个核细胞(PBMC),用结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)刺激PBMC增殖培养,10d后收集细胞,用免疫磁珠阳性分选法分离获取高纯度的γδT细胞；采用免疫印迹方法检测γδT细胞内的ZAP-70分子.结果 新鲜分离的PBMC中γδT细胞的比例仅为4.9％,Mtb-Ag刺激培养10d后升为69.2％,免疫磁珠阳性分选后达99.3％.免疫印迹显示检测到γδT细胞内相对分子质量为70 000的ZAP-70分子的表达.结论 ZAP-70分子在活化增殖的人外周血γδT细胞内高表达.
关键词： γδT细胞 ZAP-70蛋白酪氨酸激酶 结核杆菌低分子多肽抗原 印迹法 蛋白质 -
siRNA干扰跨膜转运蛋白21的表达对KO小鼠胚胎成纤维细胞γ分泌酶活性的影响
目的 探讨跨膜转运蛋白21(TMP 21)对γ分泌酶活性的影响.方法 将淀粉样前体蛋白基因缺陷型KO小鼠胚胎成纤维细胞[MEF(KO)]分为转染组(T)和对照组(C),转染组转染载有TMP 21小分子干扰RNA(siRNA)的质粒,对照组转染空质粒.每组均制备包含细胞全膜蛋白的样品(T1、C1),经CHAPSO进一步溶解后超速离心制备所得纯化全膜蛋白样品(T2、C2),用γ分泌酶组分早老蛋白1(PS-1)特异性抗体免疫沉降C2或T2后获得的γ分泌酶样品(IPT2、IPC2).蛋白质印迹法检测各类样品中γ分泌酶重要组分TMP 21、PS-1和Nicastrin(NCT)蛋白表达量;应用ELISA法检测β淀粉样肽40和β淀粉样肽42的生成总量.结果 蛋白质印迹法检测显示,TMP 21蛋白表达量在转染组样品IPT2中为5294±247 ng/ml,在对照组样品IPC2中为19110±579 ng/ml,组间差异有统计学意义(P<0.05);各类样品中PS-1与NCT蛋白表达量无明显变化;TMP21可与PS-1共沉降.ELISA法检测显示,转染组样品IPT2与饱和浓度底物C99反应生成的β淀粉样肽40和β淀粉样肽42总量为348±18 pg/ml,对照组样品IPC2为与饱和浓度底物C99反应生成的β淀粉样肽40和β淀粉样肽42总量为342±18pg/ml,组间差异有统计学意义(P<0.01).结论 TMP 21可能为γ分泌酶的组分之一.在TMP21蛋白低表达状态下γ,分泌酶活性升高,提示TMP 21为γ分泌酶的负调控因子之一.
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BRAF 野生型及 BRAFV600 E 突变型的黑色素瘤细胞中 Mps1基因对 BRAF WT／MEK／ERK 通路的影响
目的：研究野生型BRAF及突变型BRAFV600E背景下Mps1激酶对BRAFWT／MEK／ERK通路的影响。方法（1）在BRAF野生型背景的黑色素瘤细胞中单独或联合转染pBabe－puro－GST－BRAF－WT／pBabe－puro－GST－BRAFV600E、pBabe－puro－GFP－Mps1－WT 及空载体，应用 Western blot方法来检测 Mps1及 p－ERK 表达水平。（2）用 pSUPER－Mps1反转录病毒感染 BRAF 野生型及BRAFV600E突变型背景黑色素瘤细胞，敲低内源性Mps1，Western blot法检测Mps1及p－ERK表达水平。（3）在BRAFV600E突变型背景的黑色素瘤细胞中转染pBabe－puro－GFP－Mps1，Western blot法检测Mps1及p－ERK表达水平。结果（1）在BRAF野生型背景的黑色素瘤细胞中转染pBabe－puro－GST－BRAF－WT及pBabe－puro－GFP－Mps1－WT，与未处理组及转染空载体组相比，p－ERK水平显著降低（ P＜0．01）；在BRAF野生型背景的黑色素瘤细胞中转染pBabe－puro－GST－BRAFV600E及pBabe－puro－GFP－Mps1－WT，与未处理组及转染空载体组相比，p－ERK表达水平未发生明显变化。（2）在BRAF野生型背景的黑色素瘤细胞中敲低内源性Mps1后，与对照组相比p－ERK含量增多；而在BRAFV600E突变型黑色素瘤细胞中敲低内源性Mps1后，与对照组相比p－ERK含量未发生明显变化。（3）转染Mps1的BRAFV600E突变型细胞中 p－ERK 水平较对照组及空载体组没有发生显著变化。结论Mps1激酶和BRAFWT／MEK／ERK通路之间存在一条自动调节的负反馈回路，而癌基因BRAFV600E表现出对该负反馈回路的抵抗作用。
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miR－93对骨肉瘤细胞株增殖和凋亡的影响
目的：探讨miR－93对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响及其可能的机制。方法采用即时定量PCR法检测骨肉瘤细胞株143B、HuO9、Saos2、MG63、U2OS和G292和人成骨细胞系hFOB1．19中miR－93的表达水平，免疫印迹法检测裸露角质蛋白2（ NKD2）的表达水平。脂质体转染构建miR－93低表达的143B和HuO9细胞，四甲基偶氮唑盐比色法检测转染后细胞的增殖情况，流式细胞术检测其凋亡情况。利用荧光素酶报告基因实验检测miR－93对NKD2的靶向作用，过表达NKD2，分析NKD2对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响。结果 miR－93在骨肉瘤细胞系中明显高表达，NKD2显著低表达。转染miR－93抑制剂后明显抑制了143B和HuO9细胞的增殖，促进其凋亡。荧光素酶实验证实NKD2是 miR－93的直接靶基因， NKD2过表达抑制骨肉瘤细胞增殖，促进其凋亡。结论miR－93通过靶向抑制NKD2的表达促进骨肉瘤细胞增殖，抑制其凋亡，这对更深入探索骨肉瘤的诊断和治疗有着重要意义。
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中国慢性疲劳综合征患者血浆中BDV-p24抗体的检测
目的检测博尔纳病病毒(BDV)对中国慢性疲劳综合征(CFS)患者和健康对照者感染的情况,探讨CFS与BDV感染之间的相关性.方法按美国CDC 1994年标准,搜集来自全国十一省市的CFS患者61例和健康对照73例,使用蛋白印迹法(WB)对其血浆进行BDV-p24抗体检测.结果病例组有7例为阳性结果(11.48%),对照组均为阴性(0%),统计学处理两组间差异有显著意义(P<0.010).结论中国CFS患者存在BDV感染,病例组感染率明显高于对照组,CFS与BDV感染存在相关性.
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重组汉滩病毒核蛋白的纯化及鉴定
目的纯化重组表达的汉滩病毒核蛋白.方法重组菌经IPTG诱导后,表达的目的蛋白为带有谷胱甘肽转硫酶(GST)标签的融合蛋白,并以包涵体形式存在.将包涵体变性、复性后,采用Glutathione Sepharose 4B 亲和色谱对核蛋白进行纯化,并用夹心ELISA和Western blot检测纯化蛋白.结果表达产物第一次过柱亲和层析后可去除杂蛋白,获得纯化的核蛋白与谷胱甘肽转硫酶的融合蛋白,再经凝血酶酶切,第二次过柱亲和层析后获得的穿过峰为核蛋白,洗脱峰为GST.纯化的融合蛋白和纯化的核蛋白均为SDS-PAGE单点纯,并具有良好的抗原活性.结论 Glutathione Sepharose 4B亲和色谱纯化重组汉滩病毒核蛋白是一种较为有效的方法.
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人血管抑素A K(1-3)基因的克隆表达、纯化及活性鉴定
目的 克隆人Angiostatin K(1-3)基因,获得有活性的重组人血管抑素蛋白,为进一步开发应用奠定基础.方法 以人新鲜肝脏组织为材料,通过RT-PCR得到人Angiustatin基因的AK(1-3)片段.构建重组质粒pET30a-Angiostatin,转化表达菌Rosetta(DE3),对转化子进行诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化目的 产物,并验证其活性.结果 获得了人Angiostatin基因AK(1-3)片段的正确序列,表达和纯化了人血管抑素蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%,纯化后证明表达产物具有较高纯度(达到90%).结论 Anginstatin K(1-3)可在原核融合蛋白表达载体中表达,且得到有活性的目的 蛋白.
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大鼠β防御素2基因慢病毒载体的构建及功能检测
目的 构建大鼠β防御素2(rBD2)基因慢病毒表达载体,并转染培养细胞检测其表达,为rBD2研究及大鼠体内实验奠定基础.方法 提取大鼠上皮细胞总RNA,PCR扩增获得rBD2基因,双酶切PCR产物和慢病毒载体Lentivirus[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)],连接构成rBD2基因慢病毒表达载体LV-rBD2,行测序鉴定.用慢病毒包装系统对LV-rBD2进行慢病毒颗粒包装并梯度稀释法测定病毒滴度,病毒液感染培养细胞,RT-PCR和Western Blot检测rBD2表达.结果 凝胶电泳和测序结果表明rBD2基因克隆到慢病毒载体中,序列正确.完成慢病毒颗粒包装,调整病毒滴度至1×105ifu/μl.RT-PCR和Western-Blot显示rBD2基因获得表达.结论 rBD2基因慢病毒表达载体LV-rBD2被成功构建,能转染细胞并获得有效表达.
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用蛋白印迹试验检测精神分裂症患者血清中博尔纳病病毒-p24抗体的研究
目的探讨博尔纳病病毒(BDV)感染在我国的流行情况及其与精神分裂症的相关性.方法在对优化表达的GST-BDV-p24融合蛋白进行特异性鉴定的基础上,通过确定融合蛋白与第一抗体、第二抗体间的佳反应条件,建立可行的检测BDV-p24特异抗体的蛋白印迹(Western-blot)方法,进而对黑龙江地区精神分裂症患者和正常人对照血清中BDV-p24特异性抗体进行了检测,并通过血清-GST蛋白吸收后Western-blot实验对阳性血清进行了确认.结果 116例精神分裂症患者中检出BDV-p24阳性血清10例,阳性检出率为8.6%,而正常人血清标本中未检出阳性.结论我国存在博尔纳病病毒的感染,博尔纳病病毒的感染可能与精神分裂症的发生有关.
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HIF-1α与COX-2在银屑病皮损中的表达及相关性研究
目的：检测低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和环氧合酶-2（COX-2）在寻常型银屑病皮损及正常人皮肤组织中的表达水平，探讨HIF-1α和COX-2在银屑病发病机制中的作用。方法收集30例寻常型银屑病和20例正常人的临床资料以及皮损和皮肤组织。（1）用半定量RT-PCR检测银屑病皮损和正常皮肤组织中HIF-1α和COX-2 mRNA表达情况；（2）用Western blot检测银屑病皮损和正常皮肤组织中HIF-1α和COX-2蛋白表达情况。结果HIF-1α和COX-2 mRNA相对表达量在寻常型银屑病组（1.32±0.04和1.21±0.04）的表达显著高于正常对照组（0.49±0.03和0.31±0.03），两组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；且HIF-1α mRNA相对表达量与COX-2 mRNA相对表达量呈正相关（r＝0.664，P＜0.05）；HIF-1α和COX-2蛋白在寻常型银屑病组（0.76±0.03和0.62±0.03）的表达显著高于正常对照组（0.44±0.05和0.28±0.06），两组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）；且HIF-1α蛋白表达量与COX-2蛋白表达量呈正相关（r＝0.601，P＜0.05）。结论 HIF-1α和 COX-2在银屑病皮损中异常高表达且呈正相关，可能在银屑病的发生发展过程中起着重要作用。
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膀胱癌组织中KIAA0101的表达和临床意义
目的 检测膀胱尿路上皮癌组织中KIAA0101的表达情况,探讨KIAA0101的表达与膀胱尿路上皮癌生物学行为的相关性.方法 采用RT-PCR检测63例膀胱癌组织和癌旁组织中KIAA0101的mRNA水平表达情况,采用Western blot方法 检测上述癌组织中KIAA0101的蛋白表达水平.将KIAA0101基因表达水平与患者临床病理学特征及预后进行相关性分析.结果 癌组织中KIAA0101的转录和翻译水平均高于正常组织,两者有统计学差异(P<0.01).KIAA0101的表达与肿瘤临床分期和浸润深度有关,KIAA0101高表达者预后较差(P<0.001).结论 KIAA0101基因的表达水平增高可能与膀胱尿路上皮癌的发生、临床分期及其浸润深度有关,且有望成为判断膀胱尿路上皮癌预后的一个重要指标.
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全反式维甲酸对人卵巢癌细胞株COC2中β-连环蛋白表达的影响
目的 检测全反式维甲酸(ATRA)干预前后人卵巢上皮性癌细胞株COC2中β-连环蛋白(β-catenin)的表达情况,探讨ATRA对卵巢上皮性癌细胞β-catenin的作用.方法 利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Western blot)检测经1、5、10 μmol/L ATRA干预前后COC2细胞株中β-catenin mRNA及蛋白的表达水平.结果 (1)ATRA干预COC2细胞后影响细胞增殖,10 μmol/L ATRA组未见细胞增殖,并见少量细胞碎片.(2)β-catenin mRNA及蛋白的表达水平均有降低,并呈现ATRA浓度依赖性.结论 ATRA作用于卵巢上皮性癌细胞株COC2后可降低细胞中β-catenin的表达,进而抑制细胞增殖,达到抗卵巢上皮性癌的作用.
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人核小体结合蛋白1小分子干扰RNA重组慢病毒抑制非激素依赖性前列腺癌体内生长的实验研究
目的 探讨重组慢病毒介导的人核小体结合蛋白1(NSBP1)基因沉默对非激素依赖性前列腺癌细胞系DU145移植瘤生长的抑制作用及机制.方法 慢病毒lentivirus-NSBP1 转染非激素依赖性前列腺癌细胞系DU145.用转染细胞成瘤,观察抑瘤效果.运用实时RT-PCR 和Western blot 方法检测移植瘤中NSBP1、cyclinB1 与Bcl-2 的mRNA 和蛋白的表达.结果 体内实验证实NSBP1 表达水平的降低,对肿瘤细胞在裸鼠体内成瘤率没有影响,但对肿瘤的生长有明显抑制作用.同时随着NSBP1 表达水平的降低,cyclinB1 和Bcl-2 的mRNA 及蛋白的表达也降低.结论 NSBP1-RNAi-lentivirus 重组慢病毒能有效抑制DU145 细胞移植瘤的生长,NSBP1 可能通过调控cyclinB1、Bcl-2 基因的变化影响肿瘤细胞的生长.
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膜联蛋白A2在人乳腺癌组织中的差异表达及意义
目的 研究人乳腺癌组织中膜联蛋白A2(Annexin A2)的表达情况,阐明Annexin A2蛋白与乳腺癌发生发展的关系.方法 运用蛋白质印迹(Western Blottin8)和免疫组织化学技术检测人乳腺癌组织和癌旁组织中Annexin A2蛋白的表达情况,并分析Annexin A2与临床分期的关系.结果 在相同上样量的情况下,Annexin A2在乳腺癌组织中表达明显高于癌旁组织.乳腺癌组织及癌旁组织中Annexin A2蛋白的阳性表达率分别为89.47%(34/38)和42.10%(16/38),两者比较差异有统计学意义(P<0.05),其表达水平与TNM分期有关(P<0.05).结论 Annexin A2蛋白的高表达可能与乳腺癌的发生、发展有关.
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Survivin siRNA沉默对非小细胞肺癌细胞生物学的影响
目的：探讨凋亡抑制蛋白（Survivin）对非小细胞肺癌（NSCLC）H1299细胞株的生物学影响。方法通过脂质体介导将 Survivin 基因 siRNA 瞬时转染 H1299细胞。采用 RT-PCR及Western blot 检测转染后H1299细胞内Survivin 基因的表达水平。MTT比色法、流式细胞术（FCM）及Western blot观察细胞增殖、凋亡、周期及Caspase-9蛋白表达变化情况。结果 RT-PCR及Western blot证实，siRNA沉默的H1299细胞中Survivin mRNA、蛋白的表达水平较未转染组明显降低（t＝10.970，P＝0.000；t＝9.192，P＝0.003）。MTT、细胞凋亡及周期结果表明，siRNA 沉默的 H1299细胞其增殖能力明显减弱、细胞凋亡明显升高，G2/M期阻滞，Caspase-9蛋白表达增加（t＝8.162， P＝0.001；t＝10.800，P＝0.000；t＝9.192，P＝0.003）。结论 Survivin参与NSCLC细胞增殖、凋亡、周期这一生物学过程。
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IL-1β对小鼠软骨细胞中 c-myc 蛋白表达的影响
目的：通过观察不同浓度IL-1β对软骨细胞c-myc蛋白表达的影响，探讨IL-1β在骨关节炎软骨损伤中的作用及机制并寻找有效治疗骨关节炎的方法。方法选用20只C57BL/6小鼠，体外进行关节软骨细胞的分离及原代培养；将原代培养的软骨细胞分为4组：A 组为空白对照组，采用含10% FBS 的RPMI-1640常规培养基培养；B、C、D组为IL-1β处理组，分别用含有1、10和100 ng/ml IL-1β的常规培养基培养，12 h后进行实验分析。采用Western blot和流式细胞仪检测法，观察各组c-myc蛋白表达情况及细胞凋亡情况。结果原代培养细胞24 h后开始贴壁，呈圆形或多角形，传至第4代、第5代细胞体积变大，逐渐成为梭形，甲苯胺蓝染色为软骨细胞内见蓝紫色异染颗粒。与对照组相比较，不同浓度IL-1β处理组软骨细胞 c-myc 蛋白表达水平逐渐增高，呈剂量依赖性（P＜0.05）；与对照组相比较，不同浓度 IL-1β处理组软骨细胞凋亡率逐渐增高，呈剂量依赖性（P＜0.05）。结论实验体外分离小鼠关节软骨，可成功获得高纯度，且传至3代以内活性率超过90%的软骨细胞；IL-1β可以按照剂量依赖方式上调软骨细胞c-myc蛋白的表达，同时增加软骨细胞凋亡率，说明IL-1β可能通过c-myc蛋白诱导软骨细胞凋亡。
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NSBP1调节非激素依赖性前列腺癌DU145细胞的凋亡和增殖
目的探讨重组慢病毒介导的人核小体结合蛋白1（NSBP1）基因沉默对非激素依赖性前列腺癌细胞系DU145凋亡和增殖的调控机制。方法慢病毒lentivirus-shRNA-NSBP1转染非激素依赖性前列腺癌细胞系DU145，MTT法检测细胞生长活性，流式细胞技术检测细胞凋亡和细胞周期。 Western blot 方法检测敲减NSBP1蛋白后细胞中cyclinB1与BCL-2蛋白的表达。结果体外实验证实NSBP1表达水平的降低，对肿瘤细胞的生长有明显抑制作用，96 h细胞生长抑制率为22.6％。同时随着NSBP1表达水平的降低， cyclinB1和BCL-2的蛋白的表达也降低。结论 NSBP1-RNAi-lentivirus 重组慢病毒能有效抑制DU145细胞的生长，NSBP1可能通过调控cyclinB1、BCL-2基因的变化影响肿瘤细胞的生长。
