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尖音库蚊复组有机磷抗性相关酯酶B2基因杂合型的分子特征
目的 研究自然种群尖音库蚊复组有机磷抗性相关酯酶B2基因EstB2杂合型的分子特征.方法 采集杭州市自然种群库蚊,提取单蚊DNA基因组,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法进行抗性相关酯酶的基因分型.对酯酶B2基因Estβ2型蚊虫的PCR产物,进一步选用Bfm Ⅰ内切酶进行酶切,确定酯酶B2基因Estβ2纯合犁及Estβ2杂合型.本次研究共提取207只单蚊DNA,156份PCR样本阳性,阳性率75.36%(156/207).结果 在156份PCR样本阳性,酯酶B2基因Estβ2型占28.20%(44/156);对该基因型进一步分型,其中Estβ2纯合型占90.90%(30/33),EstB2杂合型占9%(3/33);Estβ2杂合型是以Estβ2和一种亚型杂合(Estβ2/Estβ2<'1>)形式存在.结论 建立了在自然种群尖音库蚊复组中酯酶B2基因分型方法,研究证明了杭州自然种群库蚊存在一种有机磷抗性相关酯酶B2基因Estβ2杂合型.
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基因优化对基因工程丁型肝炎小抗原蛋白表达和纯化的影响
目的 探讨基因优化对基因工程丁型肝炎(丁肝)小抗原蛋白表达和纯化的影响.方法 依据GenBank上的丁肝小抗原原始基因,参照大肠埃希菌优势密码子谱进行优化;再分别将优化前后的两组基因进行常规原核表达,用SDS-PAGE电泳比较目的蛋白表达量及优势表达方式;进一步以柱层析进行纯化,再以Image Lab软件分析SDS-PAGE电泳条带,比较两组目的蛋白的纯度.结果 SDS-PAGE显示,两组表达的目的蛋白均与预期相对分子质量大小一致,优化基因组的蛋白表达量高于原始基因组,且更倾向于可溶性表达;经柱层析纯化后,前者的目的蛋白纯度也明显高于后者,可达96.3％.结论 基因优化可提高基因工程丁肝小抗原蛋白表达量,增加可溶性蛋白的比例;且表达产物更易纯化至较高纯度以供诊断使用.
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对流感病毒神经氨酸酶N1亚型抗体筛选体系的评价
目的 比较真核表达、活病毒感染、酵母展示系统用于流感病毒神经氨酸酶(NA) N1亚型抗体筛选的差别,寻找合适的抗体筛选系统.方法 将pVRC-VN NA-HAtag质粒转染入293T,通过酵母展示获得重组NA.通过反向遗传学获得重组病毒A/Sichuan/1/2009.用荧光发光法检测NA性能,用流式细胞仪检测NA与5种候选抗体结合情况.结果 真核表达、酵母展示系统均可以使NA在表面展示,且具有与活病毒NA相似的特性.在候选的5种抗体中,真核表达以及病毒的NA可与抗体1、5结合,病毒的NA还能与抗体4结合；而酵母展示系统的NA与5种抗体均不能结合.结论 真核表达、真病毒感染系统适合NA抗体的筛选,酵母展示系统表达的NA其表面抗体识别的表位有差异.
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高致病性禽流感病毒H5N1安徽株A/Anhui/1/2005感染人肺癌上皮细胞(A549)的差异表达分析
目的 筛选人细胞中与高致病性禽流感病毒致病相关的基因,探讨高致病性禽流感病毒的致病机理.方法 分别用高致病性禽流感病毒安徽株和普通人流感病毒H1N1株分别感染人肺癌上皮细胞,通过人类全基因表达谱芯片技术对不同时段感染细胞进行差异表达分析,筛选出与高致病性禽流感病毒感染相关的候选基因,以实时定量荧光PCR法验证差异表达基因.结果 获得了不同致病性流感病毒感染细胞后的差异表达谱,验证了细胞凋亡通路、mTOR通路中以及与免疫相关的16个基因的差异表达.结论 H5N1感染后与普通人流感病毒H1N1相比具有促进细胞凋亡的趋势.
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携带乙型肝炎病毒感染性克隆的四种转基因载体在体内外抗原表达分析
目的 构建四种不同结构的1.3倍全基因乙型肝炎病毒(HBV)转基因载体,观察HBV抗原在体内外表达水平的差异.方法 克隆1.3倍的HBV基因至慢病毒转基因质粒pCS-CG并取代其中的EGFP表达盒,构建四种结构的pCS-HBV1.3质粒,体外转染Huh 7细胞和尾静脉高压水动力法注射C57BL/6小鼠后,ELISA方法分别检测细胞上清和小鼠血清中HBsAg和HBeAg的表达.结果 成功构建了四种不同结构的pCS-HBV1.3质粒,四种质粒HBV S抗原与e抗原在体内外的表达趋势一致,即乙肝抗原表达水平在正向插入的转基因质粒中高于反向插入；HBV抗原表达水平还与载体序列中RRE调控元件和cPPT调控元件前的基因序列长度有关.结论 筛选获得了可在体内外高效表达HBV抗原的转基因载体可应用于乙肝病毒体内外感染模型的建立与应用.
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丁型肝炎病毒抗原的原核表达及抗原性分析
目的利用含T7启动子和His纯化标签pRSET B质粒构建丁型肝炎病毒抗原(HDAg)重组表达质粒(pRSETB-HDAg),转化宿主菌,表达并纯化,获得生物活性高抗原性强的基因工程重组抗原.方法将中国河南株HDAg基因片段插入pRSET B表达质粒,转化BL21宿主菌,经IPTG诱导表达.表达产物经Chelating亲和层析纯化后,采用EIA方法分析HDAg的抗原性.结果重组HDAg稀释1000倍(10 ng/ml)仍与抗体有较强的反应.经与美国HDAg和华美公司生产的HDV诊断试剂同时检测26份HDV阳性参比血清,三者结果比较,除美国抗原漏检1份,检出率为96.15%(25/26份)外,病毒CDC和华美试剂均无漏检,检出率为100%,三者检测结果具有很高的符合率.结论成功构建了丁型肝炎病毒抗原重组表达质粒(pRSETB-HDAg),在原核细胞获得稳定高效表达,EIA 检测证明HDAg抗原性好,可用于组装HDV诊断试剂,用于临床丁型肝炎患者的诊断和我国丁型肝炎病毒感染流行病学的调查.
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重组8型腺相关病毒介导双荧光素酶基因在小鼠体内的表达
目的 利用共表达的分泌型荧光素酶Gluc(gaussia princeps luciferase)和非分泌型荧光素酶Fluc(firefly luciferase)研究重组8型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus type 8,rAAV8)介导的转基因在小鼠体内的表达特点.方法 制备携带双荧光素酶基因的重组8型腺相关病毒rAAV8-Gluc/Fluc,体外感染HEK293细胞并检测上清和胞内Gluc和Fluc活性；将不同剂量的rAAV8-Gluc/Fluc尾静脉注射或肌内注射至BALB/c小鼠,通过尾静脉采血检测Gluc活性,通过活体成像和裂解组织检测Fluc活性.结果 成功制备了rAAV8-Gluc/Fluc,可以有效感染HEK293细胞,同时分泌表达Gluc和胞内表达Fluc；尾静脉注射或肌内注射rAAV8-Gluc/Fluc至小鼠后,外周血Gluc活性均在注射后10 ～20 d达到高峰并稳定持续120 d以上,Gluc活性随注射剂量增加而增高；静脉注射rAAV8-Gluc/Fluc时Fluc主要在肝脏表达,在骨骼肌和心肌有少量表达,而肌内注射时Fluc既在肌内注射局部表达同时也在肝脏中表达.结论 本研究成功制备了携带双荧光素酶基因rAAV8-Gluc/Fluc,研究了其介导的转基因在小鼠体内的表达特点,为rAAV8的临床前应用打下基础.
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HPV31和52 L2融合蛋白的原核高效表达及免疫效果评价
目的 高效表达HPV31和52型L2融合蛋白疫苗,并评价其免疫效果.方法 根据GenBank上公布的HPV31、52型L2蛋白11-200位氨基酸序列,设计合成两个型别L2该区域对应的优化密码子基因融合序列,并将其克隆至原核表达载体中.利用原核表达系统表达HPV31和52 L2融合蛋白,纯化目的蛋白后免疫小鼠,用血清抗体检测及HPV假病毒体外中和试验评价融合蛋白疫苗的免疫效果.结果 HPV31和52 L2融合蛋白在原核表达体系中呈高效表达,表达量约占全菌20％.融合蛋白加铝佐剂免疫小鼠后,血清中能检测到高滴度的总抗体及一定水平的中和抗体和交叉中和抗体.结论 HPV31和52 L2融合蛋白能够刺激机体产生广谱中和抗体,为高危型广谱HPVL2蛋白疫苗研发提供了实验室依据.
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人博卡病毒VP2蛋白的原核表达及血清学检测方法的建立
目的 获得高表达量的人博卡病毒( HBoV1、HBoV2) VP2蛋白,建立血清学检测方法.方法 按照大肠埃希菌密码子使用偏性,对HBoV1、HBoV2 VP2衣壳蛋白基因编码区序列进行优化合成.将合成的目的基因克隆至表达载体pET30a,构建重组表达质粒pET30a-VP2,转化大肠埃希菌BL21 (DE3),使用IPTG诱导表达并摸索佳表达条件;粗提取蛋白进行Ni亲和层析纯化后建立间接酶联免疫吸附试验( ELISA),进行临床血清标本筛查,分析人群HBoV1、HBoV2感染情况.结果 优化合成的HBoV1、HBoV2 VP2基因正确连接至pET30a载体,开放阅读框正确,用1 mmol/L IPTG过夜诱导表达(25℃)得到高表达量的VP2蛋白,目的蛋白主要以包涵体的形式存在.粗提取蛋白经NiNTA亲和层析,在pH4.5时获得较理想的纯化蛋白,以其为抗原建立ELISA检查方法,筛查临床血清标本IgG抗体水平,结果显示健康儿童HBoV1阳性率为62.2％,HBoV2阳性率为55.5％,混合感染率为37％.结论 本研究成功将HBoV1、HBoV2 VP2衣壳蛋白基因编码区序列进行优化,得到了较高的蛋白表达量,所建立的ELISA法可以应用于HBoV1、HBoV2人群血清流行病学调查.
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H5N1禽流感病毒headless HA基因在杆状病毒中的表达
目的 建立能有效表达禽流感病毒A/Hubei/1/2010( H5N1)无头HA( headless HA)的杆状病毒系统.方法 利用RT-PCR扩增获得headless HA基因,克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1,命名为pFastBac1headless HA.将pFastBac1headless HA转化到DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒Headless HA-Bac.利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,并进行Western Blot和红细胞凝集试验检测.结果 Headless HA在Sf9细胞中能有效表达,不能使红细胞发生凝集.结论 本研究为利用headless HA表达蛋白研制广谱流感疫苗奠定了基础.
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甲3型流感病毒M基因披甲RNA的研制
目的 研制内含甲3型流感病毒M基因RNA的披甲RNA.方法 将MS2噬菌体基因组中编码成熟酶蛋白、包膜蛋白和pac位点的DNA片段克隆到表达质粒pET30b中,构建重组质粒pAR-1.将甲3型流感病毒M基因连接到pAR-1 pac位点的下游,诱导表达出内含M基因RNA的披甲RNA AR-2,并进行纯化、定量和稳定性研究.结果 成功构建和表达了耐核糖核酸酶、内含M基因RNA的披甲RNA,每1 ml LB培养基可诱导表达出约8.9×1011个拷贝的AR-2.结论 制备的AR-2稳定,无生物传染危险性,可作为甲型流感病毒M基因核酸检测的标准品和质控品.
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登革Ⅰ型病毒E蛋白在293T细胞中的分泌表达
目的 分泌表达登革Ⅰ型病毒prM/E基因,为研究该蛋白的免疫学功能和特性奠定基础.方法 用RT-PCR法获得登革Ⅰ型病毒广州分离株全长prM/E基因,在prM基因前添加乙型脑炎病毒的信号肽或同时替换E基因羧基末端的20%为乙脑病毒E基因相应的部分,分别将其克隆入真核表达载体pcDNAS/FRT中,获得三种重组质粒DlprME-pc5,D1JsprME-pc5,D1JsprM80E20JE-pc5.用脂质体法分别将重组质粒DNA转入293T细胞,通过免疫荧光、Western印迹检测外源基因在真核细胞中的分泌表达.结果 用免疫荧光法检测到分别转染了三种重组质粒的293T细胞的胞质中均有登革Ⅰ型病毒蛋白的表达.Western印迹检测转染了D1prME-pc5重组质粒的293T细胞上清中没有特异蛋白条带,转染了经基因改造的重组质粒D1JsprME-pc5和D1JsprM80E20JE-pc5的细胞上清中均存在登革Ⅰ型病毒的特异蛋白条带.结论 转染了三种重组质粒的293T细胞均可表达登革Ⅰ型病毒prM/E蛋白,只有在prM基因前添加了信号肽的重组质粒转染后蛋白才获得分泌表达.
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H5N1亚型流感病毒M2与NA基因真核表达载体的构建与鉴定
目的 构建表达H5N1亚型流感病毒M2和NA基因的多种真核表达载体.方法 以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)作为研究对象,PCR扩增全长M2与NA基因.将M2基因克隆入真核表达载体pStar的IRES上游或下游的MCS,构建重组pStar-M2/和pStar-/M2.将NA基因克隆人pStar载体IRES上游或下游的MCS,构建重组pStar-NA/和pStar-/NA.将M2和NA基因先后克隆到pStar载体IRES序列的上游和下游MCS,分别构建双基因共表达重组pStar-M2/NA和pStar-NA/M2.将重组质粒转染293细胞,使用IFA方法 检测各重组质粒相应外源基因的表达.结果 通过酶切鉴定,各重组质粒构建正确.将其转染293细胞后,使用IFA方法 检测到了各重组质粒中相应外源基因的表达.结论 构建了多种表达H5NI亚型流感病毒M2和(或)NA基因的真核表达载体,为研究开发流感DNA疫苗奠定了基础.
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大鼠β防御素2基因慢病毒载体的构建及功能检测
目的 构建大鼠β防御素2(rBD2)基因慢病毒表达载体,并转染培养细胞检测其表达,为rBD2研究及大鼠体内实验奠定基础.方法 提取大鼠上皮细胞总RNA,PCR扩增获得rBD2基因,双酶切PCR产物和慢病毒载体Lentivirus[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)],连接构成rBD2基因慢病毒表达载体LV-rBD2,行测序鉴定.用慢病毒包装系统对LV-rBD2进行慢病毒颗粒包装并梯度稀释法测定病毒滴度,病毒液感染培养细胞,RT-PCR和Western Blot检测rBD2表达.结果 凝胶电泳和测序结果表明rBD2基因克隆到慢病毒载体中,序列正确.完成慢病毒颗粒包装,调整病毒滴度至1×105ifu/μl.RT-PCR和Western-Blot显示rBD2基因获得表达.结论 rBD2基因慢病毒表达载体LV-rBD2被成功构建,能转染细胞并获得有效表达.
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乙型肝炎病毒外膜蛋白和核壳蛋白双表达质粒的构建和表达
目的 构建同时表达乙型肝炎病毒外膜蛋白和核心蛋白的真核表达质粒并研究其表达效果.方法 利用DNA重组技术,构建由两个CMV启动子分别表达乙型肝炎病毒外膜蛋白和核心蛋白的双表达真核质粒VR-SC,体外真核表达后ELISA检测HBsAg和HBeAg.结果 在乙肝病毒外膜蛋白表达质粒上插入多克隆位点,并插入乙肝病毒核心蛋白的完整表达调控单元,体外真核表达后成功检测到HBsAg和HBeAg.结论 成功构建双表达质粒vR-sc,其表达效果良好,为进一步改造成HBV DNA疫苗打下了基础.
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乙型脑炎病毒prM蛋白单克隆抗体的制备
目的 克隆日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)前膜蛋白(prM)编码基因,原核表达、纯化prM蛋白,以纯化产物为免疫原制备单克隆抗体(mAb);方法从感染JEV病毒的鼠脑中克隆编码JEV prM蛋白的基因并将其克隆入原核表达载体pET32a,转化大肠埃希菌BL21(DE3)LvsS后以IPTG诱导表达.表达产物经Ni-NTA纯化后进行SDS-PAGE分析.用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合和亚克隆后筛选出能分泌识别prM蛋白的mAb的杂交瘤细胞株.用Western Blot和免疫组化方法检测单克隆抗体的特异性.结果 从鼠脑中克隆出约500 bp的JEV prM基因,将其克隆入原核表达载体中,在大肠埃希菌中获得了较好表达.纯化的prM蛋白免疫BALB/c小鼠,经传统细胞融合及筛选方法制备出单克隆抗体,抗体滴度为105.ELISA、Western Blot和免疫组化检测结果证实该株单抗具有较好的特异性.结论 成功的表达和纯化了日本乙型脑炎病毒的prM蛋白,并完成了单克隆抗体的制备,为乙型脑炎病毒感染的早期诊断及预防的研究奠定了良好的基础.
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一个唐氏综合征下调表达基因片段的克隆、鉴定及细胞定位分析
目的:克隆唐氏综合征(Down syndrome,DS)相关新基因,并对其进行组织表达谱和细胞定位分析,探索其在DS脑病变发生中可能参与的环节.方法:在分析前期基因芯片结果的基础上,选取在正常和DS胎儿大脑皮层中差异表达的表达序列标签(expression sequence tags,EST) AI480014,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA end ,RACE)对其进行末端延伸;利用多组织Northern印迹技术分析其在组织中的表达谱和剪接体情况,用半定量RT-PCR进一步验证其组织表达谱的结果;通过细胞原位杂交技术,对其进行体外原代培养的混合胶质细胞表达定位分析;后用半定量RT-PCR分析其在DS和正常胎儿脑皮层表达情况.结果:成功地将AI480014的3'端延伸232 bp,得到一个3'端完整、长682 bp的新基因片段(Genbank序列号DQ275636);Northern印迹表明分析其在心、肝、脾、肾、脑组织均有表达,且在脑组织中的表达量高,而在脑组织中又以额叶、海马的表达量高,各组织无可变剪接体的存在;在混合培养的胶质细胞中检测到该基因的表达;DQ275636染色体定位为5q14.结论:得到一个新基因片段(DQ275636);其组织来源和在脑组织中的表达特性提示其可能参与DS脑病变发生的某个环节.
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IRM-2小鼠全长cDNA编码蛋白质分析
目的 分离和鉴定IRM-2小鼠辐射抗性相关基因.方法 以IRM-2小鼠的21条表达序列标签为模板进行PCR扩增,从IRM-2小鼠全长cDNA文库中测定cDNA克隆的序列,通过与GenBank进行同源序列信息比对,对全长cDNA编码的蛋白质进行分析.结果 从IRM-2小鼠全长cDNA文库中获得5条全长cDNA序列,与小鼠已知基因不同源,得到了可能编码蛋白质的氨基酸序列和蛋白质的理化性质等信息.结论 通过对全长cDNA编码的蛋白质进行分析,提示IRM-2小鼠体内可能存在目前尚未发现的辐射抗性相关基因.
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双阳型梅花鹿脾脏细胞cDNA文库的构建和四个EST的发现
目的:开发和利用中国梅花鹿的基因资源,以期拥有一批梅花鹿基因的专利,并在专利保护下生产具有自己知识产权的基因工程药物.方法:用Trizol试剂提取梅花鹿脾脏细胞中的总RNA,分离得到mRNA后,用逆转录方法合成与mRNA互补的cDNA单链,再以此cDNA单链为模板,得到与该cDNA互补的另一条DNA链,将得到的DNA双链分子通过合适的Adapter连入pSPORT1质粒,将此重组质粒通过电转化方法导入E.coliDH5α菌,得到脾脏细胞的cDNA文库.筛选出阳性重组子,测序并分析得到的ESTs序列.结果:成功地构建了双阳型梅花鹿脾脏细胞cDNA文库;并对部分库容cDNA进行了克隆和测序,在这一过程中发现4个与已知基因同源的表达序列标签(ESTs),其中2个EST分别是梅花鹿视网膜母细胞瘤的同源基因和梅花鹿维生素K依赖性蛋白前体cDNA的部分序列.结论:通过构建cDNA文库的方法成功地得到了一批有价值的梅花鹿的基因片段.
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日本血吸虫EST序列的电子延伸及结果分析
目的建立日本血吸虫表达序列标签(SjEST)序列自动分析系统,筛选新基因、分析其表达谱.方法建立本地化日本血吸虫专业数据库,整合序列同源性比较软件(BLAST)及片段整合分析软件(PHRAP),运用生物信息学策略编写程序控制EST自动延伸.建立本地化蛋白库,对延伸结果进行蛋白库同源性分析.实现对成批数据大规模自动分析,筛选出可能的新基因全长cDNA序列,并进行基因表达谱分析.结果延伸系统规则有效,延伸结果序列与原始序列高度同源.对552条EST进行自动分析,487条得到不同程度的延长,其中有104条EST原始序列检索无同源性,但经过延伸后获得高度同源性的联配序列信息.根据延伸结果尝试分析基因表达谱,筛选出27个可能新基因.结论建立了本地化的有效的SjEST序列自动分析系统.该系统为新基因的筛选及基因表达谱的分析提供了重要的参考信息.
