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精子顶体相关基因SPACA7的转录活性研究
目的 研究精子顶体相关基因SPACA7转录起始位点上游-2000bp至下游+84bp范围内启动子活性.方法 利用启动子截短实验获得人类SPACA7基因转录起始位点上游-2000bp与下游+84bp序列的系列不同长度的启动子共16个,以人肾上皮细胞293T基因组DNA为模板,进行PCR反应,将不同长度的启动子重组至荧光素酶表达载体pGL3 basic中并转染细胞,转染24h后收集细胞加入裂解液,收集细胞裂解液,利用多功能酶标仪测定荧光素酶活性.结果 我们研究了SPACA7启动子-2000bp至+84bp序列,构建了16个不同长度的promoter::Luciferase,荧光素酶活性检测结果发现各个启动子都具有一定的活性,其中-1500bp至+84bp序列启动子活性高.结论 初步证明精子顶体相关基因SPACA7启动子在-1500bp至+84bp区域具有较强转录活性.
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黄芩水提液对3T3-L1脂肪细胞增殖、诱导分化及脂联素启动子荧光素酶活性的影响
目的:本研究旨在观察黄芩水提液(Scutellaria BaicalensisWater Extract,SBWE)对3T3-L1前体细胞增殖、分化,对脂肪细胞因子脂联素表达以及脂联素(Adiponectin,ADP)启动子荧光素酶活性的影响,从分子生物学角度阐述SBWE降脂作用的可能机理.方法:通过体外培养3T3-L1细胞,采用MTT法检测SBWE对3T3-L1细胞增殖能力的影响;通过诱导脂肪细胞分化成为成熟脂肪细胞,观察SBWE对脂肪形成的影响;化学发光法检测脂联素启动子双荧光素酶报告基因活性;荧光定量PCR法检测脂联素mRNA(Adipoq)表达.结果:与正常组相比,给予3T3-L1细胞0.01、0.1、1 mg?mL-1浓度的SBWE 24 h,可显著抑制细胞的增殖活性(P＜0.05);0.1、1 mg?mL-1浓度的SBWE能够降低3T3-L1细胞分化为脂肪细胞的数量,并减少细胞内脂滴聚集,但无明显剂量依赖性;0.01、0.1 mg?mL-1浓度SBWE能显著提高脂联素基因启动子荧光素酶活性,与空载体比较差异有统计学意义(P＜0.05);与正常组相比,给予3T3-L1细胞0.1 mg?mL-1SBWE 24 h,诱导前后的脂肪细胞Adipoq表达均明显增加(P＜0.05).结论:SBWE可有效抑制3T3-L1脂肪细胞的增殖、分化,同时增加脂联素基因表达,这可能是通过增强脂联素基因启动子荧光素酶活性实现,这些为黄芩水提液减肥的作用机制提供一定的基础.
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报告基因的选择及其研究趋向
报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质或酶的基因,通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控.由于具有灵敏度高、检测方便等特点,报告基因技术在转基因、启动子分析以及药物筛选等领域有了广泛的应用.近年来,随着荧光分析方法和技术的进步,荧光素酶和绿色荧光蛋白成为众多报告基因中的后起之秀,本文以这两个报告基因为重点,综述了报告基因的特点、应用、近年来的进展以及未来发展方向.
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MISⅡR启动子的克隆及其组织特异性鉴定
目的 克隆苗勒氏管抑制物Ⅱ型受体启动子(mullerian inhibiting substance type Ⅱ receptor promoter,MISⅡRpr)并鉴定其在卵巢器官中的特异性表达活性.方法利用PCR从C57BL/6小鼠基因组中扩增苗勒氏管抑制物Ⅱ型受体启动子并将其克隆入载体pMD18-T,测序正确后将其亚克隆入pGL_3-Basic荧光素酶报告基因载体.将重组质粒pGL_3-Basic/MISⅡRpr分别转染卵巢癌细胞系SKOV3、HT-8910,宫颈癌细胞系Hela、SiHa,绿猴肾细胞系COS-7,乳腺癌细胞系MDA-MB-231和结肠癌细胞系HT-29,通过双荧光素酶检测系统检测荧光素酶在上述细胞系中的活性,以确定克隆的苗勒氏管抑制物Ⅱ型受体启动子是否具有卵巢特异性活性.结果 构建的pGL_3-Basic/MISⅡRpr质粒用SacⅠ和EcoRⅠ双酶切,片段大小分别为600 bp和1 000 bp,证明MISⅡRpr插入正确.重组质粒转染卵巢细胞系SKOV3、HT-8910,荧光素酶高表达;对照细胞HT-29等转染后,荧光素酶低表达.结论 克隆得到的MISⅡRpr具有明显的卵巢特异性活性.可以利用MISⅡRpr进行相关基因的卵巢特异性表达.
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活体成像技术在实验脑型疟中的应用研究
目的 构建表达Luciferase的伯氏疟原虫ANKA株(Plasmodium berghei ANKA),感染昆明小鼠并于实验脑型疟发生时对小鼠进行活体成像,建立实验脑型疟活体成像平台,为脑型疟发病机理及疟疾疫苗和药物评价研究奠定基础.方法 大量制备重组质粒p10027并酶切使其线性化.复苏冻存原虫并于体外培养富集成熟裂殖体.收集成熟裂殖体与线性化的质粒混匀后进行电转化,对构建的虫株进行药物筛选;提取疟原虫基因组,进行PCR鉴定.构建的伯氏疟原虫ANKA-Luciferase疟原虫采用常规方法感染昆明小鼠,当小鼠于感染6d后出现偏瘫、昏迷及视网膜病变等典型脑型疟症状时,采用活体成像技术观察疟原虫增殖及分布情况;解剖分离感染小鼠各脏器组织并成像,观察疟原虫在各器官组织粘附情况.结果 PCR检测两端插入序列及Luciferase序列均能获得预期片段,提示重组质粒成功整合入伯氏疟原虫ANKA基因组内.活体成像观察感染小鼠在小鼠脑型疟发生时体内原虫水平较高,且随血流呈全身性分布;器官成像观察原虫在小鼠各重要脏器均有粘附,特别是脑部聚集了大量的感染疟原虫的红细胞.结论 成功构建了伯氏疟原虫ANKA-Luciferase疟原虫,并利用此原虫感染小鼠建立了实验脑型疟活体成像平台.
关键词： 伯氏疟原虫ANKA株 荧光素酶 实验脑型疟 活体成像 -
荧光素酶标记A20鼠B细胞淋巴瘤移植模型的建立
目的:建立荧光素酶标记A20鼠B细胞淋巴瘤移植模型,为后期异基因造血干细胞移植中移植物抗肿瘤作用的研究提供实验工具.方法:将萤火虫荧光素酶作为标记基因导入A20鼠B细胞淋巴瘤细胞株,建立稳定表达荧光素酶的A20细胞株;将其与C57BL/6小鼠骨髓经尾静脉共同接种于辐射后的BALB/c小鼠体内,建立移植肿瘤模型;用活体荧光成像系统检测肿瘤的发生发展,并观察小鼠的活存,体重变化以及成瘤部位;取肿瘤组织和动物脏器行石蜡包埋、病理切片、HE染色观察其组织学特点.结果:经慢病毒转染和嘌呤霉素筛选获得了稳定表达荧光素酶基因的A20细胞株.活体荧光成像观察发现,在A20细胞接种第8天,即可观察到肿瘤发光,随着观察天数的增加荧光强度增强.相比较于骨髓移植(BMT)组,BMT+ A20-Luc+组小鼠存活率下降,体重降低明显.大体解剖显示,成瘤部位主要波及肝脏和脾脏,成瘤组织特征类似人弥漫大B细胞淋巴瘤.结论:成功构建了荧光素酶标记A20鼠B细胞淋巴瘤移植模型,为探讨异基因造血干细胞移植中移植物抗肿瘤作用提供了研究平台.
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生物发光共振能量转移技术在蛋白酶活性检测中的应用
生物发光共振能量转移（BRET）是20世纪中叶在海洋生物，例如维多利亚水母和软体珊瑚虫海肾中发现的一种自然现象[1]，能量从生物发光蛋白如荧光素酶（供体）转移到荧光物质（受体）。在软体珊瑚虫海肾中海肾荧光素酶将腔肠素氧化，发出波长为480 nm的光，与近距离的海肾绿色荧光蛋白之间发生一个非辐射的能量转移，发出509 nm的光[1-3]。实际上，共振能量转移理论早在1948年就已经被 F?rster提出并被称为共振能量转移（F?rster resonance energy transfer，FRET）[4]。根据供体不同，共振能量转移分为以荧光物质如荧光蛋白[5]、有机分子[6-7]、纳米无机荧光材料等为供体的 FRET以及荧光素酶或者发光蛋白为供体的 BRET[8]。共振能量转移发生时，供体发出的部分光转移到受体荧光蛋白，受体发出波长更长的光。共振能量转移只有在受体分子的吸收光谱与供体分子的发射光谱有效重叠后才能发生。其发生取决于供体分子与受体分子的距离（一般在1~10 nm）和两者的相对方向[9-10]。
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重组8型腺相关病毒介导双荧光素酶基因在小鼠体内的表达
目的 利用共表达的分泌型荧光素酶Gluc(gaussia princeps luciferase)和非分泌型荧光素酶Fluc(firefly luciferase)研究重组8型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus type 8,rAAV8)介导的转基因在小鼠体内的表达特点.方法 制备携带双荧光素酶基因的重组8型腺相关病毒rAAV8-Gluc/Fluc,体外感染HEK293细胞并检测上清和胞内Gluc和Fluc活性；将不同剂量的rAAV8-Gluc/Fluc尾静脉注射或肌内注射至BALB/c小鼠,通过尾静脉采血检测Gluc活性,通过活体成像和裂解组织检测Fluc活性.结果 成功制备了rAAV8-Gluc/Fluc,可以有效感染HEK293细胞,同时分泌表达Gluc和胞内表达Fluc；尾静脉注射或肌内注射rAAV8-Gluc/Fluc至小鼠后,外周血Gluc活性均在注射后10 ～20 d达到高峰并稳定持续120 d以上,Gluc活性随注射剂量增加而增高；静脉注射rAAV8-Gluc/Fluc时Fluc主要在肝脏表达,在骨骼肌和心肌有少量表达,而肌内注射时Fluc既在肌内注射局部表达同时也在肝脏中表达.结论 本研究成功制备了携带双荧光素酶基因rAAV8-Gluc/Fluc,研究了其介导的转基因在小鼠体内的表达特点,为rAAV8的临床前应用打下基础.
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AAV载体质粒介导的荧光素酶shRNA抑制其在哺乳动物细胞中的表达
目的构建荧光素酶短发夹环产生质粒在BHK-21细胞中抑制荧光素酶的表达. 方法从人基因组DNA中用PCR方法调出人U6 snRNA启动子,接以被9 bp序列间隔的21 bp荧光素酶靶序列的反向重复序列,置于AAV载体质粒pSNAV中,构建成荧光素酶短发夹环RNA(shRNA)产生质粒pSNAV/U6/Luc.与pMAMneoLuc质粒共转染BHK-21细胞,检测其对荧光素酶表达的影响.并且单独转染荧光素酶细胞株,检测其抑制荧光素酶表达的效果.结果 pSNAV/U6/Luc对共转染的pMAMneoLuc中荧光素酶的表达抑制50%,而对荧光素酶细胞株中荧光素酶的表达抑制70%.结论实验表明荧光素酶shRNA产生质粒能够有效抑制荧光素酶在BHK-21细胞中的表达.
关键词： RNA干扰 荧光素酶 短发夹环RNA U6 snRNA启动子 -
介导RNAi的tRNAVal启动子质粒载体的建立
目的构建以tRNAVal启动子控制shRNA转录引发RNAi的质粒载体. 方法从人基因组中用PCR方法扩增出tRNAVal基因片段,人工突变去除3′末端数个碱基,连以Linker序列,用此经过改造的tRNAVal启动子,构建控制针对荧光素酶的shRNA转录载体pUC-tRNAVallucRi,与pMAMneoLuc共转染BHK-21细胞,观察对荧光素酶表达的影响.结果 pUC-tRNAVallucRi可以高效特异性抑制pMAMneoLuc中荧光素酶的表达,效率达97.1%～99.5%.结论 tRNAVal启动子载体可以高效转录shRNA,引发哺乳动物细胞RNAi现象.
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丙型肝炎病毒5'端非编码区结构域Ⅱ在其翻译启动活性中的作用
目的 分析丙型肝炎病毒(HCV)5'端非编码区(NCR)的结构域Ⅱ序列(nt44-118)在其翻译启动活性中的作用.方法 用PCR扩增技术获得缺失5'端118 nt的截短型HCV 5'NCR片段,并以之替换萤火虫荧光素酶(Flue)真核表达质粒pCMVNCRluc中的完整HCV 5'NCR,构建截短型HCV 5'NCR调控Fluc基因表达的真核表达质粒pCN1-d3.将pCN1-d3、pCMVNCRluc和pCMVNCRhc缺失HCV5'NCR nt1-43后的重组质粒pCN1-d2以脂质体方法 分别转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测Fluc相对表达活性,RT-PCR检测Flue mRNA的相对表达水平.结果 酶切和测序结果 表明,重组质粒构建成功.各质粒转染细胞后Fluc mRNA的相对表达水平差异无统计学意义(P0.05);pCN1-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无统计学意义(P0.05),pCN1-d3的Fluc活性显著低于pCMVNCRIuc(P<0.01).结论 HCV 5'NCR的结构域Ⅱ(nt44-118)含有其发挥翻译启动功能的重要序列.
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NanoLuc标记的重组克里米亚-刚果出血热病毒及其初步用于抗病毒药物筛选
目的 为了构建可分泌表达NanoLuc荧光素酶的重组克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV)并探讨其用于抗病毒药物高通量快速初筛的可行性.方法 将NanoLuc基因与CCHFV M节段上的mucin编码框融合,拯救重组病毒,并以利巴韦林为阳性对照,评估Furin抑制剂在体外对重组病毒的抑制效果.结果 成功获得可分泌表达NanoLuc荧光素酶的重组CCHFV(rCCHFV mucin NLuc),且在感染细胞上清中,表示NanoLuc活性的相对光单位(relative light unit,RLU)与病毒半数组织感染剂量(TCID50)呈显著正相关性(cor=0.998,P=0.001).10μmol/L浓度下,Furin抑制剂处理后1～3 d感染细胞上清中NanoLuc荧光素酶活力与利巴韦林处理组无明显差异(P>0.1),但第4天Furin抑制剂处理组上清中RLU值显著高于利巴韦林处理组(P=0.001),且与未处理病毒对照组无明显差异(P>0.1).结论 成功构建1株NanoLuc标记的rCCHFV并可用于抗病毒药物的体外快速初筛.
关键词： 荧光素酶 克里米亚-刚果出血热病毒 抗病毒药物 筛选 -
重组分枝杆菌噬菌体检测分枝杆菌活力的研究
重组的可表达荧光素酶的分枝杆菌噬菌体,由于可特异地感染宿主菌--分枝杆菌并在宿主菌中快速增殖,同时表达荧光素酶,因此通过检测荧光素酶的浓度即可快速检测分枝杆菌的活力.
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HCV5'NCR片段调控荧光素酶表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的表达
目的 构建HCV 5'NCR片段调控荧光素酶表达质粒,并在HepG2细胞中表达.方法 通过PCR扩增,获得中国人HCV基因组5'非编码区(noncoding region, NCR)完整序列与C区部分序列的目的基因片段(5'NCR-C片段).将此片段插入pGL3荧光素酶报告载体的荧光素酶基因起始密码上游,构建受5'NCR 片段调控的荧光素酶表达质粒.应用脂质体介导基因转染技术将8个质粒转染HepG2肝癌细胞.结果 经鉴定获得8个均为正向插入的阳性克隆.序列分析结果表明插入片段与中国人HCV(Ⅱ型)序列基本一致,其荧光素酶基因起始密码子已去除且未改变编码框.有一个质粒能够表达荧光素酶活性,其绝对值达1141.9±151.1 mV,是pGL3报告载体荧光素酶活性的20%.结论 当质粒1μg、Lipofectin 6μl,Lipofectin-质粒复合物与细胞孵育4小时时可获得佳转染效果.
关键词： 肝炎病毒 丙型 荧光素酶 pHCV-luc09 HepG2肝癌细胞 -
HCV IRES介导荧光素酶小鼠体内表达模型的建立
HCV内部核糖体起始位点 (internal ribosomal entry site, IRES)含有40S核糖体的有效结合部位和与内部翻译起始因子eIF-3的结合部位,以内部起始方式调控介导HCV蛋白的翻译启动,在翻译调控中具有重要作用[1],是反义寡核苷酸、核酶和siRNA等药物治疗的重要靶位.王小红等[2]曾构建了CMV启动子启动转录的HCV IRES调控荧光素酶表达载体pHCV-neo4,建立了转基因细胞模型.获得了在细胞水平上对HCV有明显抑制作用的反义寡核苷酸.而在动物水平上的评价却无合适的模型.我们进一步采用水动力转染法将pHCV-neo4表达载体转染到小鼠体内,在小鼠肝脏检测到荧光素酶的高水平表达,可作为体内瞬时评价以HCV IRES为靶位的抗HCV药物活性的小鼠模型.
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丙型肝炎病毒与荧光素酶融合基因细胞模型的初步建立
目的 建立容易检测的丙型肝炎病毒(HCV)细胞模型.方法 利用基因重组技术,构建HCV cDNA与荧光素酶(luc)融合基因可调控逆转录病毒载体;通过脂质体介导方法转染人肝癌细胞(HHCC),观察luc基因的表达.结果 ①成功地将luc基因融合于HCV C区和大部分E1区基因的下游,构建了带HCV-luc融合基因的真核表达载体(pBPST-HCV-luc);②该载体在细胞内有效表达luc活性,puromycin筛选可提高luc的表达水平,并可受四环素的调节.结论 初步建立了表达HCV C-E1和luc融合基因的可调控转染细胞模型,为以HCV C-E1为靶的基因治疗提供研究工具.
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重型肝炎相关的人纤维介素基因启动子的克隆及功能分析
目的 明确在病毒蛋白HBc和HBx作用下,hfgl2基因5'端非编码区对转录激活起重要作用的转录调控序列.方法 运用基因重组的方法,构建一系列5'端缺失而保留共同3'端的hfgl2基因启动子虫荧光素酶报告质粒,将其分别与病毒蛋白HBc和HBx真核表达质粒共转染CHO细胞和HepG2细胞,检测各组细胞的相对荧光素酶活性.结果 酶切鉴定以及DNA测序等证实一系列hfgl2基因启动子虫荧光素酶报告基因质粒构建成功,系列启动子缺失试验证实:在hfgl2基因启动子-817位至-467位(相对于转录起始点)之间存在着激活该基因的调控序列.结论 在HBV病毒蛋白HBc及HBx作用下,hfgl2基因的启动子区存在一个与其转录表达有关的调控序列,探讨了重型肝炎相关的hfgl2基因高度表达的分子机制,为下一步研究相关的顺式作用元件及反式作用因子奠定了基础.
关键词： 重型肝炎 人纤维介素基因(hfgl2) 基因表达调控 荧光素酶 -
利用荧光素酶标记的肿瘤细胞建立活体成像动物模型
目的 建立稳定表达荧光素酶的人乳腺癌细胞株并构建适用于小动物活体成像系统观察的裸鼠皮下移植瘤模型.方法 采用脂质体将携带荧光素酶基因的质粒转染到人乳腺癌细胞株MCF-7中,G418筛选出稳定表达荧光素酶的单克隆细胞株.扩增后接种于裸鼠,建立裸鼠皮下移植瘤模型,通过活体动物成像系统监测肿瘤的生长过程.结果 获得了高水平稳定表达荧光素酶的乳腺癌单克隆细胞株,该单克隆细胞株与母细胞系MCF-7具有相似的生长特性.将稳定表达荧光素酶的克隆接种于裸鼠皮下可成瘤,小动物活体成像系统能准确监测肿瘤细胞在体内的生长过程.结论 成功建立了稳定表达荧光素酶的乳腺癌单克隆细胞株.采用活体动物成像系统构建的裸鼠皮下移植瘤模型是拓展肿瘤体内生长、转移及治疗相关研究的理想模型.
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诱导型一氧化氮合酶基因启动子-969G→C多态性的功能
目的:探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子-969G→C多态性的功能意义.方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增已知的iNOS基因启动子-969G→C多态性的GC和GG基因型启动子DNA序列,再采用基因重组技术将获得的启动子与PGVB-2-E荧光素酶载体质粒连接,构建新的重组质粒pPGV-iNOSmt和pPGV-iNOSwt,并进行酶切图谱分析和测序分析.然后将重组质粒分别在脂质体的介导下转染HepG2细胞,检测荧光素酶的表达水平,分析不同基因型启动子的活性差异.结果:成功构建iNOS基因-969G→C多态性的GC和GG基因型启动子荧光素酶载体重组质粒pPGV-iNOSmt和pPGV-iNOSwt,发现iNOSmt启动子的活性比对照启动子的活性显著升高,升高132.1%,差异有显著性(P＜0.05),iNOSwt启动子的活性比对照启动子的活性升高14.3%,差异无显著性(P＞0.05).iNOSmt启动子活性升高的百分率是iNOSwt启动子的9倍.结论:iNOS基因启动子-969G→C的多态性改变导致该启动子的活性增强.
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IRES特异性IRNA对HCV IRES启动蛋白翻译细胞内抑制作用
目的:研究核糖体内部进入位点(internal ribosome entry site,IRES)特异性抑制性RNA(inhibitor RNA,IRNA)细胞内对丙型肝炎病毒(HCV)IRES介导蛋白翻译的抑制作用.方法:体外应用脂质体细胞转染法,将IRNA及其突变体mIRNA真核表达载体pcRz-IRNA/pcRz-mIRNA转染人肝癌细胞株(HHCC),经G418筛选4 wk后建立IRNA及mRRNA表达株;以相同的方法构建pcHCVcluc转染株;以脂质体介导细胞转染法将pCMVNCRLuc转染IRNA及mIRNA细胞株,于转染后48 h检测荧光素酶表达量;将IRNA及mIRNA真核表达体转染pcHCVcLuc表达株,于转染后不同时间检测荧光素酶表达量.结果:HCVIRES介导蛋白翻译在IRNA表达株明显受到抑制,同样IRNA对HCV翻译复制子的蛋白翻译作用有明显抑制性;突变体mIRNA表达株和空载体对照株中未见相似的抑制性.结论:pcHCVcluc在HHCC细胞中获得有效表达;IRES特异性IRNA能有效的抑制HCVIRES介导细胞内蛋白翻译作用.
