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石家庄市食品、公共场所从业人员乙肝病毒感染现状调查报告
乙型病毒性肝炎为一种严重危害人类健康的传染病,发病率高,传染性强,为掌握石家庄市食品、公共场所从业人员乙肝病毒(HBV)感染状况,2002年1-12月用RPHA法(HBsAg≥1:8为阳性,并经中和试验确证;用ELISA法检测乙肝病毒感染的5项指标,试剂分别购自山东3V和上海荣盛公司,试验方法和结果判断均按说明书进行)对市卫生防疫站负责体检的食品、公共场所从业人员进行检测.
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山西和河南省部分地区人群流行性乙型脑炎病毒中和抗体水平调查
目的 调查山西和河南省部分地区健康人群血清中流行性乙型脑炎(乙脑)病毒中和抗体水平.方法 对采集的血清标本按1:10,1:20,1:40,1:80四个稀释度稀释后进行乙脑病毒中和试验,结果判定采用细胞病变观察方法并结合EHSA测定结果进行综合判定.结果 调查结果显示,所测标本中乙脑病毒中和抗体保护率以临猗县高(87.6%),其次是栾川县(58.2%)和万荣县(51.4%).经χ2检验,临猗县与万荣县中和抗体保护率差异有统计学意义(χ2=42.812,P=0.000),临猗县的中和抗体保护率高于万荣县,栾川县与万荣县的中和抗体保护率差异无统计学意义(χ2=1.466,P=0.226).两个年龄组(≤40岁和>40岁)中和抗体保护率比较显示,临猗县差异无统计学意义(χ2=0.057,P=0.811),万荣县差异有统计学意义(χ2=5.505,P=0.019),栾川县差异无统计学意义(χ2=2.129,P=0.145).结论 三个县健康人群乙脑病毒中和抗体保护率不同,这可能与当地乙脑的流行状况以及疫苗的接种情况有关.
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南阳市血清低水平HBSAg携带者在随机人群中的分布状况调查
乙型肝炎在本地区有较高感染率,有一部分为隐性感染[1],血清水平低,不易检测出来,临床采用ELISA法检测HBV血清标志物.在日常工作中发现当HBsAg水平低到一定程度时,不必稀释可以直接使用中和试验确认.设定吸光度(A)值0.05～2.01,且定量检测＜50010u/L为低水平HBsAg.本课题通过对南阳市随机体检人去血清HBsAg在人群中的分布情况.
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空气消毒剂中和试验方法的改进及现场消毒效果的观察
空气消毒效果测定中,残留消毒剂的去除方法与其它消毒试验有所不同.为了探索更科学合理的空气消毒中和剂试验,采用空气消毒效果试验方法,以双链季铵盐为消毒剂代表,对常规中和剂试验方法进行了改进,并对双链季铵盐现场消毒效果进行观察.结果,现行常规试验方法对中和产物抑菌作用判定存在问题,改进后的中和剂试验方法提高了中和产物抑菌作用的检测敏感性.经试验观察,以2000 mg/L双季铵盐(双十烷基二甲基溴化铵)溶液按8 ml/m3用量进行气溶胶喷雾,密闭作用30 min,对空气中自然菌消除率均为90%以上.结论,改进的中和试验方法能更合理地避免中和产物对检测体系影响,有利于提高空气消毒剂消毒效果检测的准确性.2000mg/L双季铵盐溶液气溶胶喷雾可有效消除室内空气中自然菌达90%以上.
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复方硫代硫酸钠中和含氯复方消毒剂效果的试验观察
为了解含硫代硫酸钠、吐温80、卵磷脂的复方中和剂对含次氯酸钠、十二烷基磺酸钠的复方消毒剂的中和效果，进行了菌悬液定量试验。结果，将中和剂各成分混合后经压力蒸汽灭菌处理，或分别以压力蒸汽灭菌处理后再混合，对该消毒液的中和效果均不符合要求。因此，用此复方中和剂中和含氯复方消毒剂时，应先做中和剂试验，加以检验。
关键词： 中和试验 中和剂硫代硫酸钠卵磷脂 吐温80 含氯复方消毒剂 大肠杆菌 -
严重急性呼吸综合征康复病例血清中和抗体三年追踪观察
目的 了解严重急性呼吸综合征(SARS)康复病例病后3年血清中和抗体水平及其变化规律,为SARS疫苗的研制和使用决策提供理论依据.方法 对SARS康复病例进行随访,分别采集病后第5个月、第20个月和第35个月的血清,每份血清标本均采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和微量中和试验二种方法进行血清SARS-CoV特异性抗体的检测.中和抗体效价采用Reed-Muench方法计算.3个时间点中和抗体效价的趋势分析采用对数转换后的数据进行重复测量方差分析.结果 分别采集到病后第5个月、第20个月和第35个月的血清标本13份、17份和13份,采用ELISA法检测的抗体阳性率分别为100%、82.4%和84.6%,而采用中和试验法检测的中和抗体阳性率均为100%,中和抗体效价依次为1∶43(1∶16～1∶203)、1∶36(1∶17～1∶59)和1∶21(1∶10～1∶39),其差异具有统计学意义(F=60.419,P＜0.001).病后第35个月时有30.8%(4/13)的病例血清中和抗体效价高于1∶36,但另有30.8%(4/13)的病例血清中和抗体效价等于或略高于1∶10(临界水平1∶8).结论 SARS病例血清中和抗体至少可持续3年,但中和抗体效价随康复时间延长呈逐渐下降趋势;血清中和抗体效价个体差异较大,病后第35个月时部分病例的血清中和抗体效价已降至较低水平,何时完全消失尚需进一步追踪观察.
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三色混合荧光HPV假病毒中和检测系统的建立及评价
目的 建立三色混合荧光HPV假病毒中和检测系统,并评价其在检测HPV九价疫苗免疫血清免疫原性的应用.方法 分别选取红色、绿色和蓝色荧光蛋白的质粒N31-MCHREEY、N31-EGFP和N31-mTagBFP构建HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58假病毒,利用双抗夹心法和病毒半数组织培养感染剂量法检测HPV假病毒浓度和感染滴度;利用单色荧光与三色混合荧光HPV16/33/45假病毒,检测HPV九价疫苗免疫小鼠血清的中和滴度,以验证三色混合荧光HPV假病毒系统的准确性;采用单色荧光和三色混合荧光HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58假病毒系统检测HPV九价疫苗免疫食蟹猴血清的中和滴度,判断其是否可应用于HPV九价疫苗免疫血清的免疫原性检测.结果 含有绿色、红色和蓝色荧光质粒的HPV16型假病毒的浓度为5～6μg/ml,HPV6/11/18/31/33/45/52/58的三色混合荧光假病毒浓度为1～3μg/ml.获得了分别含有EGFP、Mcherry和mTagBFP报告基因的9个型别的HPV假病毒,且满足中和检测需要;9个型别单色荧光HPV假病毒的滴度值均在1×104～1×105之间,即它们具有相似的感染滴度.检测HPV九价疫苗免疫的小鼠血清时,单色荧光与三色混合荧光HPV16/33/45假病毒系统所得中和滴度值差异均无统计学意义(P值均>0.05);检测HPV九价疫苗免疫的食蟹猴血清时,单色荧光与三色混合荧光A、B和C组HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58假病毒所得中和滴度值差异均无统计学意义(P值均>0.05).结论 成功地建立了三色混合荧光HPV假病毒中和检测系统;验证其与单色荧光HPV假病毒系统具有一致性;证实其可应用于检测HPV九价疫苗免疫血清的免疫原性检测中.
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非结构蛋白1抗原捕获酶联免疫吸附法评价登革病毒抗体中和活性
目的 在获得具有中和活性的针对Ⅰ型登革病毒(dengue virus serotype Ⅰ,DENV-1)的抗体基础上,评价已建立的非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NSI)抗原捕获酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析抗体中和活性的可行性,为中和抗体的筛选和疫苗效果的评价提供一个更为快速、简便的检测方法.方法 使用重组DENV-1包膜蛋白Ⅲ区(envelopeprotein domainⅢ,EDⅢ)免疫5只BALB/c小鼠制备单克隆抗体(简称单抗),采用间接ELISA、间接免疫荧光法(immunofluorescenee assay,IFA)和免疫印迹法(Western Blot)对单抗进行筛选及鉴定;同时用该重组蛋白免疫1只新西兰兔,制备多克隆抗体血清;以传统噬斑减少中和试验(plaquereduction neutralization test,PRNT)作为参比方法,采用NSI抗原捕获ELISA对所获抗体进行中和活性检测.结果 获得4株针对DENV-1 EDⅢ单抗和1份兔多抗血清,且被PRNT试验证明均具有中和活性,四株单抗腹水(1A1、1B3、3D3、9D6)和兔多抗血清中和效价分别为1:1024、1:512、1:256、1:4096和1:4096.使用NS1抗原捕获ELISA法检测不到PRNT中和效价低的3D3抗体对DENV-1有中和能力,而检测其余3株单抗(1A1、1B3、9D6)和多抗兔血清中和效价均远低于PRNT测定结果,分别为1:32、1:32、1:128和1:128.结论 简单、快速的NS1抗原捕获ELISA可用于评价DENV抗体的中和活性,该方法适合于高效价中和抗体的筛选,有望成为评价疫苗效果的方法之一.
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人乳头瘤病毒(HPV)58型DNA疫苗免疫原性的初步分析
为了检测HPV 58型不同L1基因的DNA疫苗的免疫原性,以pcDNA3.1为载体分别构建含HFV 58型不同L1基因的DNA疫苗,命名为L1h、L1h△c、L1S、L1SM和L1wt.用免疫印迹法检测各DNA疫苗的体外表达情况;各重组质粒与pcDNA3.1-h58L2和pcDNA3.1-GFP共转染293FT细胞,检测其形成假病毒的能力;并将各DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠,利用假病毒中和实验检测中和抗体水平,用ELISPOT检测细胞免疫情况.结果显示,本实验成功构建了五种DNA疫苗,L1h△c的体外表达量高,L1S和L1SM的表达量次之,L1wt没有表达;重组质粒L1S能够形成假病毒,而其他四种重组质粒均不能形成假病毒.L1S和L1h均可在小鼠体内诱导中和抗体,但L1S诱导的中和抗体的平均滴度为1:6 400,明显高于L1h诱导的中和抗体水平(平均滴度为1:48),而其他疫苗在小鼠体内未产生中和抗体.对五种疫苗均未检测出特异性的细胞免疫反应.结果提示,体外能够组装成假病毒的DNA疫苗在免疫动物后可诱导高滴度的中和抗体,为今后DNA疫苗的筛选提供参考.
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SARS-CoV假病毒中和试验技术的建立及评价
为避免传统的SARS病毒中和试验需要操作活毒而存在的生物安全隐患,建立了基于假病毒系统、操作较安全的SARS中和试验技术平台.本研究应用高效表达SARS-CoV S(密码子优化的全长S蛋白,简称S)的真核表达载体(pVRC8304),与HIV慢病毒包装质粒(p CMV△8.2)及转移质粒(pHR'CMV EGFP)3个质粒载体系统共同转染人胚肾细胞293T,包装了SARS假病毒;通过SARS假病毒感染的RD-A细胞中标记基因EGFP表达的分析,确定SARS假病毒能有效进入细胞,建立了可在BSL-2级实验室操作的SARS病毒中和试验技术平台.用该技术平台对不同免疫血清进行了中和抗体分析,并比较了基于假病毒和基于SARS活病毒的中和试验效果.结果显示:SARS假病毒和SARS活病毒两个中和试验系统获得中和抗体滴度变化趋势一致,表明本研究构建的SARS假病毒可替代SARS活病毒用于建立操作上安全的SARS病毒中和试验技术平台.
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肠道病毒68型新型中和试验方法的建立及其初步应用
针对肠道病毒68型(EV-D68)建立一种新型快速、高效的中和试验方法,并初步评价其在EV-D68流行病学研究中的应用价值.以灭活EV-D68病毒免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤技术制备其单克隆抗体;筛选反应性好、特异性强的抗EV-D68单克隆抗体作为检测抗体,基于酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)建立EV-D68高效中和试验方法;进一步比较该方法与传统中和试验方法Nt-CPE的一致性,并使用该方法对临床血清样本进行检测.共获得10株分泌抗EV-D68单克隆抗体的杂交瘤细胞株,选取一株性能优的15C5进行生产纯化,鉴定其为IgG3亚型;以15C5为检测抗体,建立了快速检测EV-D68中和抗体的Nt-ELISPOT方法;与Nt-CPE方法比较,Nt-ELIS-POT方法将检测时间由5～7d缩短至1d以内,并且两种方法检测结果一致性良好;应用所建立的Nt-ELISPOT方法对厦门地区146份人群血清样本进行检测,显示血清样本EV D68中和抗体阳性率为98.6％(144/146),提示厦门地区可能存在过EV-D68的流行.本研究基于ELISPOT建立的新型EV-D68中和试验方法快速可靠,适合通量检测,可以应用于EV-D68中和抗体水平的血清学调查,为EV-D68感染的防控工作提供帮助.
关键词： 肠道病毒68型(EV-D68) 中和试验 中和抗体 血清检测 -
麻疹中和试验对酶联免疫吸附试验的质量控制探讨
目的 探讨酶联免疫吸附试验(ELISA)检测麻疹IgG抗体的质量控制方法 .方法 2003年对3个年龄组的294份ELISA法检测麻疹IgG抗体后的血清,用中和试验加以证实.结果 两种方法 相关,但差异较大,相关系数0.423～0.684,阳性符合率64.76%～98.24%.结论 排除两种试验方法 本身敏感性的差异,麻疹ELISA-IgG试剂盒质量的稳定性、操作方法 的精确性等问题值得关注,必须确保血清学检测方法 标准化.
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白喉抗体实验室检测方法
目前检测白喉抗体的方法主要有5种:锡克氏试验、动物体内中和试验、体外微孔培养物中和试验、间接血凝试验(IHA)及酶联免疫吸附试验(ELISA).
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柯萨奇病毒A组6型抗体中和试验Nt-ELISPOT方法的建立
目的 建立快速、高效的柯萨奇病毒A组6型(CVA6)抗体中和试验Nt-ELISPOT检测法. 方法 取CVA6单克隆抗体(1D5)用HRP标记,以此为检测抗体,基于酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)建立CVA6抗体中和试验Nt-ELISPOT,通过对不同效价血清以及手足口病疑似患者血清标本的检测,比较该方法与传统抗体中和试验(Nt-CPE)的一致性. 结果 以CVA6单克隆抗体1D5为检测抗体,建立了快速检测针对CVA6中和抗体的Nt-ELISPOT检测法;该方法与Nt CPE法相比,其检测时间显著缩短;运用这两种方法分别对4份不同效价血清样品及70份手足口病疑似患者血清样品进行CVA6抗体检测,其中和试验结果的一致性为100％. 结论 建立的Nt-ELISPOT方法快速、高效,可用于手足口病CVA6感染检测,为CVA6的疫苗免疫原性评价、血清流行病学调查等提供了技术支持.
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基孔肯雅病毒常见血清学检测技术研究进展
基孔肯雅热是由基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)经伊蚊叮咬传播的一种自然疫源性疾病,人群普遍对CHIKV易感,临床上多以突起发热、皮疹、关节疼痛和轻度出血为主要特征,主要分布在非洲、南亚、东南亚热带和亚热带地区.由于目前无疫苗预防和特效药治疗,及时开展疑似CHIK病例实验室诊断检测,防止其暴发与流行具有重要的意义.现今实验室检测CHIKV感染技术主要包括血清学试验、病毒分离技术和分子生物学检测技术,其中前者具有操作简便、快速特点,较容易现场推广应用.常见的血清学检测方法主要包括中和试验(Neutralization test,NT)、血凝抑制试验(Hemagglutimation inhibition test,HI)、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫层析试验(Immunochromatography assay,ICA)、间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)等.本文对上述常见的基孔肯稚血清学检测方法进行了综述.
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泰安市肾综合征出血热疫源地分型研究
我市自1984年流行肾综合征出血热(HFRS)以来,曾多次进行地理流行病学调查,根据流行季节、主要宿主动物种类确定流行类型.这种方法不够准确.为有效控制HFRS在我市发病与流行,1995～1997年应用聚合酶链反应(RT-PCR)、核苷酸序列分析、微量细胞病变中和试验(MCPENT)技术开展了疫源地分型研究.
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北京市成人感染肠道病毒71型血清流行病学分析
目的 分析和评价北京市成年健康人群肠道病毒71型(EV71)血清保护抗体水平,为EV71预防控制提供科学依据.方法 从医院收集北京市健康成年人群的血样和资料,采用酶联免疫吸附法检测EV71 IgG抗体,用微量细胞病变中和试验方法进一步检测EV71中和抗体滴度水平.结果 检测成年人群486例,年龄分布为19～62岁,平均EV71 IgG抗体阳性率水平为40.3％,男性抗体水平与女性没有显著差异,EV71 IgG抗体阳性率随着年龄的增长而下降；中和抗体阳性水平滴度高于1∶256的占13.3％,中和抗体滴度水平随年龄增长而下降.结论 北京市40％的健康成年人群血清中具有EV71保护性抗体,抗体滴度高于1∶256者仅占13％,随着年龄增长,EV71保护性抗体水平呈现下降趋势.
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铝佐剂和免疫程序对Sabin IPV免疫原性影响的研究
目的 研究铝佐剂和免疫程序对不同配比的Sabin IPV免疫原性的影响.方法 用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒原液制备四批Sabin IPV,分别为中剂量无佐剂组、中剂量铝佐剂组、低剂量无佐剂组、低剂量铝佐剂组,采用0、1、2月和0、2、4月两种免疫程序对大鼠进行3针基础免疫,每针基础免疫一个月后采血,并检测免疫后血清中3个型别的中和抗体水平.结果 经过3针基础免疫后,各组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中和抗体几何平均滴度均显著提高,阳转率均达到100％.对不同组别间两种免疫程序比较无显著差异,但相同条件下,0、2、4月免疫程序可诱导产生更高的抗体水平.对相同免疫程序下不同组别进行比对,添加铝佐剂组与无佐剂组相比可以诱导更高的抗体水平.结论 铝佐剂和免疫程序可提高Sabin IPV免疫原性.
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马传染性贫血病毒囊膜蛋白GP90的表达及其免疫效果研究
目的探索马传染性贫血病毒(EIAV)野毒株(强毒,LN)和疫苗毒株(弱毒,DLV)的囊膜蛋白GP90作为鉴别诊断试剂的效果及基因工程疫苗的可能性.方法将中国EIAV疫苗株(DLV)及其亲本毒株辽毒株(LN)接种于驴外周血白细胞培养物,提取前病毒DNA,并以其为模板,经聚合酶链法(PCR)扩增出LN和DLV的GP90片段,在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达.表达的GP90蛋白经金属离子亲和层析(IMAC)纯化后免疫小鼠,ELISA法检测抗EIAV抗体,中和试验检测中和抗体活性.同时对DLV和LN GP90的核苷酸与氨基酸进行比较.结果 DLV和LN GP90核苷酸序列的同源性为95.3%, 氨基酸序列的同源性为87.7%.未加佐剂组抗体滴度为800,佐剂组抗体滴度达1 600;不加佐剂组的中和抗体滴度在40～80之间,加佐剂组中和抗体滴度在80～160之间.结论成功构建了分别表达EIAV野毒株LN和疫苗毒株DLV囊膜蛋白GP90的重组杆状病毒,大量表达的蛋白纯化后纯度较好,该纯化产物在小鼠体内可激发良好的体液免疫应答.
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HPV31和52 L2融合蛋白的原核高效表达及免疫效果评价
目的 高效表达HPV31和52型L2融合蛋白疫苗,并评价其免疫效果.方法 根据GenBank上公布的HPV31、52型L2蛋白11-200位氨基酸序列,设计合成两个型别L2该区域对应的优化密码子基因融合序列,并将其克隆至原核表达载体中.利用原核表达系统表达HPV31和52 L2融合蛋白,纯化目的蛋白后免疫小鼠,用血清抗体检测及HPV假病毒体外中和试验评价融合蛋白疫苗的免疫效果.结果 HPV31和52 L2融合蛋白在原核表达体系中呈高效表达,表达量约占全菌20％.融合蛋白加铝佐剂免疫小鼠后,血清中能检测到高滴度的总抗体及一定水平的中和抗体和交叉中和抗体.结论 HPV31和52 L2融合蛋白能够刺激机体产生广谱中和抗体,为高危型广谱HPVL2蛋白疫苗研发提供了实验室依据.
