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重组乙型肝炎表面抗原(汉逊酵母菌表达)免疫小鼠后不同细胞免疫测定方法的比较研究
目的 探讨不同细胞免疫测定方法 对小鼠免疫乙型肝炎表面抗原 (HBsAg) 后细胞免疫应答测定的影响.方法 小鼠皮下接种 HBsAg,于免疫后 4、7、10、14 和 25 d 分离脾单个核细胞(MNC),应用酶联斑点法(ELISPOT) 测定 MNC 细胞体外刺激后所产生的细胞因子 IFN-γ斑点形成细胞计数(SFC),其中刺激物选择多肽和 HBsAg;流式荧光检测技术(Luminex)测定 MNC 体外经 HBsAg 刺激后所产生的细胞因子 IFN-γ、IL-4、IL-5 和 IL-10 含量;小鼠血清检测抗-HBs.结果 小鼠接种 HBsAg 后,应用 ELISPOT 法测定, 7 d 和 14 d 小鼠 IFN-γ阳转率分别为 60% 和 80%;而应用 Luminex 方法 测定,7 d 和 14 d 小鼠 IFN-γ阳转率均为 80%;IL-4、IL-5、IL-10 阳转率分别为 60%,80%;100%,100%;80%,100%;25d 时,IFN-γ与 14 d 比较统计学上差异有统计学意义( P25,14 d=0.030,＜0.05),而 IL-5、IL-10 和 IL-4 与 14 d 比较差异均无统计学意义 ( P＞0.05 ).抗-HBs 水平随时间而呈上升趋势.结论 Elispot 和 Luminex 法测定小鼠 IFN-γ应答符合率高,小鼠接种单针 HBsAg 后细胞免疫应答高峰为免疫后 7～14 d.25 d 时 IFN-γ分泌水平随抗-HBs 抗体水平升高而下降,而 IL-4、IL-5、IL-10 分泌继续保持较高水平.
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不同种类乙型肝炎重组疫苗诱导免疫应答特点比较
目的 比较三种乙型肝炎重组疫苗(rHB)[乙型肝炎汉逊酵母重组疫苗(rHP)、酿酒酵母重组疫苗(rSC)和CHO重组疫苗(rCHO)]诱导小鼠细胞和体液免疫应答特点.方法 给3组小鼠(BALB/c,H-2d)分别皮下接种3种r}HB 3μg,于免疫后第4、7、10、14、25和35 d分离脾单个核细胞(MNC),应用酶联斑点法(ELISPOT)测定MNCs体外刺激后所产生的细胞因子IFN-γ、IL-2斑点形成细胞数(SFC).刺激物为多肽或HBsAg.同时测定免疫后不同时间的细胞毒T淋巴细胞反应(CTL)活性和小鼠血清抗-HBs水平.结果 应用ELISPOT法,不同种类rHB免疫小鼠后诱导分泌IFN-γ和IL-2峰值均为10-14 d;rHP诱导CTL活性(P=0.000<0.05)和分泌IFN-γ水平(P<0.05)均显著高于rCHO和rSC,且rHP于免疫后第10天诱导CTL杀伤率高(39.8%);rHP组诱导分泌IL-2水平均显著高于其他两种疫莆组(P<0.05),第7和14天时,rSC组诱导产生IL-2水平均显著高于rCHO组(第7天t=4.595,P=0.001<0.05;第14天t=5.721,P=0.000<0.05);免疫后第7天3种疫苗诱导细胞免疫应答强度依次为rHP强,rSC其次,rCHO弱;小鼠血清抗-HBs阳转率和抗体滴度随免疫时间而逐渐上升,第7天时rCHO组抗体显著高于rHP组(P=0.044<0.05),第14天时rCHO组抗体显著高于rHP组(P=0.009<0.05)和rSC组(P=0.012<0.05).结论 3种疫苗免疫小鼠的应答特点不同,酵母重组疫苗早期诱导细胞免疫应答优于rCHO;rCHO的优势是诱导产生抗-HBs早,且滴度较高.
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成人接种乙型肝炎疫苗后细胞免疫应答的动态变化
目的 探讨人体接种乙型肝炎(乙肝)疫苗后细胞免疫的动态变化,了解疫苗介导的细胞免疫应答与体液免疫应答的关联.方法 8例成人按0、1、2月程序接种乙肝疫苗,于首针免疫后3、8、21、34和65 d采静脉血,分离外周血单个核细胞(PBMC),对PBMC进行细胞分选,获得纯度95%以上的CD4+和CD8+ T淋巴细胞,应用酶联免疫斑点法(ELISPOT)测定PBMC、CD4+和CD8+ T淋巴细胞体外刺激后所产生的细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4的斑点数(SFC),并收集乙肝疫苗免疫前(0 d)和免疫后3、8、21、30、34、60、65和150 d血样,测定乙肝表面抗体(抗-HBs).同时设立阴、阳性对照各2例.结果 人接种乙肝疫苗后,CD4+、CD8+ T淋巴细胞产生不同细胞因子趋势和强度不同:IFN-γ(由CD8+、CD4+ T淋巴细胞产生)出现较早,且较为稳定,而CD4+ T淋巴细胞产生的IL-2和IL-4出现较晚,但其升高与第2、3针乙肝疫苗免疫有关;免疫后IL-4阳转率与抗-HBs阳转率呈显著正相关,IL-2、IL-4的SFC与抗-HBs滴度也呈显著正相关.结论 成人接种乙肝疫苗后可早期检测出以IFN-γ为主的细胞免疫,IL-4和IL-2阳转与抗-HBs升高有关.
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ELIspot法观察中药红曲对强直性脊柱炎外周血单个核细胞分泌TNF-α的影响
目的 使用ELIspot法观察中药红曲对强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)患者外周血单个核细胞分泌TNF-α的影响.方法 采集强直性脊柱炎病情活动期患者(均符合1984年美国风湿病协会关于强直性脊柱炎的诊断)的外周血,分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),制成细胞悬液,以每孔2.5 ×105个细胞种植到包被有抗肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)抗体的96孔酶联免疫(enzyme-linked immunospot,ELIspot)板上.分为正常对照组、阴性对照组(TNF-α抑制剂组)、阳性对照组[脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激]、红曲高浓度组(0.5mg/mL)、红曲中浓度组(0.25mg/mL、红曲低浓度组(0.125 mg/mL),细胞种植的同时给予阴性药物、阳性药物和红曲高中低三种浓度药物刺激,24后检测TNF-α分泌情况.结果 红曲高中低浓度组的ELIspot检测,斑点计数均少于正常组,其中红曲高、中浓度组与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 ELIspot检测是一种较好的用于观察药物对细胞作用效果的方法;红曲能减少强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞TNF-α的分泌.
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鸡感染巨型艾美耳球虫后的体液、粘膜与细胞免疫应答
鸡的7种艾美耳球虫中，巨型艾美耳球虫免疫原性强。为研究巨型艾美耳球虫激发宿主产生的免疫应答，我们检测了巨型艾美耳球虫3次感染后鸡只的抗体应答及细胞应答特征。 ELISA检测显示，感染鸡只产生了显著高于未感染鸡只的特异性IgY和sIgA （肠道及胆汁）抗体；而酶联免疫斑点法（ ELISPOT）检测显示，被感染鸡只脾脏中分泌IFN-γ的球虫特异性淋巴细胞的数量显著高于对照组。粪便中卵囊的检测则显示，第3次感染后的鸡只几乎无卵囊排出，证实巨型艾美耳球虫产生的免疫应答可对同源感染提供完全的免疫保护。
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柯萨奇病毒A组6型抗体中和试验Nt-ELISPOT方法的建立
目的 建立快速、高效的柯萨奇病毒A组6型(CVA6)抗体中和试验Nt-ELISPOT检测法. 方法 取CVA6单克隆抗体(1D5)用HRP标记,以此为检测抗体,基于酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)建立CVA6抗体中和试验Nt-ELISPOT,通过对不同效价血清以及手足口病疑似患者血清标本的检测,比较该方法与传统抗体中和试验(Nt-CPE)的一致性. 结果 以CVA6单克隆抗体1D5为检测抗体,建立了快速检测针对CVA6中和抗体的Nt-ELISPOT检测法;该方法与Nt CPE法相比,其检测时间显著缩短;运用这两种方法分别对4份不同效价血清样品及70份手足口病疑似患者血清样品进行CVA6抗体检测,其中和试验结果的一致性为100％. 结论 建立的Nt-ELISPOT方法快速、高效,可用于手足口病CVA6感染检测,为CVA6的疫苗免疫原性评价、血清流行病学调查等提供了技术支持.
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乙型肝炎患者特异性细胞免疫功能检测的初步研究
目的通过酶联免疫斑点法检测乙型肝炎(乙肝)患者特异性细胞免疫功能,初步研究各型乙肝患者特异性细胞免疫功能的差异.方法选择急、慢性乙肝、肝炎肝硬化(乙型)、乙肝病毒(HBV)既往感染,接种乙肝疫苗后血清乙肝病毒学标志中仅表面抗体阳性及未接种过乙肝疫苗、未感染过HBV、血清HBV标志全部阴性者共6组研究对象,每组4例,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测其外周血单个核细胞中γ-干扰素分泌细胞的数量.结果急性乙肝患者、慢性乙肝患者及急性乙肝患者、肝炎肝硬化患者外周血单个核细胞γ-干扰素分泌细胞数量明显不同(P=0.0209及P=0.0211).结论通过ELISPOT检测乙肝患者外周血单个核细胞γ-干扰素分泌细胞的数量可以了解乙肝患者特异性细胞免疫功能.急性乙肝患者特异性细胞免疫功能明显强于慢性乙肝患者及肝炎肝硬化患者.
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人类B细胞转化为抗体分泌浆细胞的体外研究
目的 体外示踪不同刺激条件下人类B细胞转化为抗体分泌浆细胞的能力.方法 对5名健康自愿者采用B细胞阴性选择磁珠分离法分离和体外培养B细胞,观察4种培养条件下(培养液对照组、PWM组、细胞因子组及PWM+细胞因子组)、不同时间点B细胞转化为抗体分泌浆细胞的能力.采用双荧光标记(FTTC-CD27、PE-CD38)流式细胞技术监测B细胞4种表面标志物的动态变化;采用酶联免疫法(ELISA)测定不同时间点培养上清液中Ig浓度;采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)测定不同时间点抗体分泌B细胞数.结果 B细胞产生抗体浓度明显与培养条件有关.PWM刺激的B细胞培养上清液中Ig浓度高(P=0.003);PWM+细胞因子组次之;细胞因子组与对照组差异无统计学意义.流式细胞分析结果显示,培养第7天浆细胞前体达峰,第10天浆细胞百分率达峰.活细胞数以细胞因子组多,培养10 d后仍呈增殖状态;而PWM组很快下降.ELISPOT法测定的Ig分泌B细胞数也以PWM组佳,:PWM+细胞因子组次之.结论 从Ig产生能力看,以PWM组佳;从细胞增殖和浆细胞的存活来看,以细胞因子组佳.表明体外诱导B细胞产生抗体不仅需要有效的刺激原,同时还需要必需的细胞因子信号促使细胞增殖和维持细胞的存活.
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酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答试验条件的优化
目的探讨影响酶联免疫斑点(ELISPOT)实验特异性及敏感性的因素,优化酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答的实验条件.方法HLA-A2阳性正常人的外周血单个核细胞在体外经流感病毒抗原肽诱导1周后,观察不同实验条件对酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答的影响.结果CTL诱导时,效应细胞先分离出CD8+T细胞组获得的Flu抗原特异的细胞频数要高于CTL诱导后再分离出CD8+T细胞组(P＜0.05);自体DC(树突状细胞)作APC(抗原提呈细胞)比自体CD8-PBMC作APC,CTL的诱导效率高且特异(P＜0.05);使用细胞因子组合(IL-7+IL-2+IL-6)优于单纯使用IL-2.CTL行ELISPOT检测时,T2-2细胞较T2-1细胞具有更强抗原提呈功能,增加Flu抗原特异的CD8+T细胞频数(P＜0.05).结论优化了酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答的试验条件,优化后的方法在临床肿瘤疫苗的研究中具有应用价值.
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含HIV-1核心蛋白基因的重组质粒的构建及其免疫应答的研究
目的构建含有HIV-1核心蛋白gag基因的真核表达质粒,并研究其免疫应答反应.方法采用PCR方法从1例HIV感染者中扩增出gag基因,构建重组质粒pcDNA-GAG.接种小鼠后,检测其抗体及抗体亚类,并对小鼠的淋巴细胞亚群进行分析,采用3H-TdR法、ELISPOT方法和51Cr释放法分别检测T淋巴细胞的增殖反应性、特异性分泌IFN-γ的CD8+T淋巴细胞以及特异性CTL杀伤活性.结果重组质粒体外表达目的蛋白的相对分子质量(Mr)约为55×103.免疫小鼠后可诱导产生特异性抗体,其中IgG2a与IgG的比例显著高于IgG1与IgG的比例;T淋巴细胞体外经ConA刺激后SI达到160.67,显著高于对照组(14.04,P＜0.05);产生IFN-γ的CD8+T淋巴细胞数目以及特异杀伤率均显著高于对照组小鼠(P＜0.05).结论重组质粒pcDNA-GAG可诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答反应,而且ELISPOT方法检测特异性细胞免疫应答反应的结果与51Cr释放法一致,提示可用此法对DNA疫苗诱导的细胞免疫进行评价.
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体外诱导和检测人类B细胞产生抗HLA抗体的研究
目的 体外诱导和采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测人类B细胞产生的抗HLA抗体.方法 对7名健康志愿者采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)并体外培养5 d,以B细胞多克隆刺激原美洲商陆丝裂原(PWM)、葡萄球菌A蛋白菌体(SAC)体外刺激PBMC,采用EHSA和ELISPOT方法分别测定培养上清中Ig浓度和抗体分泌B细胞数,探索体外诱导PBMC产生Ig的适宜方法.采用该刺激方法和HLA特异的ELISPOT法,诱导和检测9例拟行肾移植预致敏对象PBMC产生的抗HLA抗体.结果 与PWM单刺激相比,PBMC在PWM和SAC联合刺激后,有更多细胞存活的趋势(P=0.052),且培养上清中IgM的水平明显增加(P=0.03),而IgG的水平无明显变化(P>0.05).6例预致敏对象诱导和检测到抗HLA抗体.其特异性与各自培养上清中检测到的抗HLA抗体一致.结论 PWM和SAC体外刺激PBMC,结合HLA特异的ELISPOT方法,能诱导和榆测到人类B细胞产生的HLA抗体.
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酶联免疫斑点法快速诊断活动性结核病患者的临床应用研究
目的：：对酶联免疫斑点法 Elispot 在活动性结核病患者中的应用进行分析。方法：选取202例活动性肺结核患者为活动性结核组,234例痰涂阳性肺结核患者的密切接触者为密切接触组,100例健康者为健康对照组,收集所有受试者外周血单核细胞应用 Elispot 技术进行检测。同时进行平行的 PPD 皮试。结果：活动性结核组患者 Elispot 反应阳性率为92.0％,阳性率显著高于健康组的4.0％；234例密切接触组者中,120例家庭成员的 Elispot 检测阳性率为23.3％(28/120),PPD 阳性率为10.0％(12/120),114例朋友中 Elispot 检测阳性率为7.0％(8/114),PPD 阳性率为2.6％(3/114),差异均有统计学意义。结论：酶联免疫斑点法 Elispot 诊断活动性结核病的准确性较高,优于PPD,可作为诊断结核病的辅助手段。
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临床免疫学与免疫新技术在临床应用的机遇与挑战
临床免疫学是免疫学的一个重要分支,是架起免疫学和临床医学的桥梁.近年来,固有免疫理论、Th17细胞的概念和意义、调节性细胞理论等临床免疫学理论的突破,以及各种临床免疫学新技术--芯片技术、组学技术、酶联免疫斑点、流式细胞术及相关临床免疫学新技术的发展,促进了多学科的交融,也推动临床免疫学技术向自动化、智能化、高通量方向发展的进程.同时,亦给临床检验工作的提高和发展带来前所未有的机遇与挑战.
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酶联免疫斑点法诊断结核性脑膜炎临床研究
目的 探讨酶联免疫斑点法(enzyme linked immune spot assay,ELISpot)X~结核性脑膜炎的诊断价值.方法 选取我院根据临床表现疑为结核性脑膜炎的患者26例,以ELISpot检测分泌IFN-γ的结核分枝杆菌ESAT-6及CFP-10抗原特异性T细胞水平.结果 在所有入组患者中,根据诊断标准,明确诊断为结核性脑膜炎者15例,诊断为非结核性中枢神经系统感染者11例,ELISpot检测的敏感度为80.00%[95%可信区间(confidence interval,CI)51.9%～95.7%,特异度为100%(95%CI71.5%～100.0%);阳性预测值为100%(95%CI 73.5%～100.0%),阴性预测值为78.6%(95%C149.2%～95.3%).结论 ELISpot对结核性脑膜炎有较高的诊断价值.
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ELISPOT及ELISA鉴别HBV感染免疫状态的研究
目的 比较酶联免疫斑点法(ELISPOT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴别乙型肝炎病毒(HBV)感染免疫状态.方法 临床诊断的慢性HBV感染者免疫清除期、免疫耐受期患者各16例,常规分离外周血单个核细胞(PBMC),体外用HBcAg或培养液刺激,分别用ELISPOT及ELISA方法,检测两组患者PBMC分泌的r-干扰素(INFr).结果 用ELISA方法,两组患者PBMC受HBcAg刺激分泌IFNr,分别为(655.25±3.80)、(578.37±7.73)ng/L,阳性率分别为68.81％、12.50％,差异有统计学意义(P＜0.01);用ELISPOT方法,两组患者PBMC受HBcAg刺激分泌IFNr,阳性率分别为87.50％、0,二者差异有统计学意义(P＜0.01).结论 免疫清除期、免疫耐受期HBV感染者,PBMC对HBcAg刺激的免疫反应不同,鉴别二者,ELISPOT优于ELISA.
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亚低温对重型颅脑损伤患者T辅助淋巴细胞1/T辅助淋巴细胞2平衡漂移的影响
一、资料与方法50例重型颅脑损伤患者,随机分为亚低温治疗组26例和常规治疗组24例.亚低温治疗组除常规颅脑损伤措施治疗外同时加用亚低温治疗.降温方法:入院或手术后采用降温毯降温.采用直肠、足底两部位持续监测体温.直肠温度作为机体的核心温度,足底温度作为末梢温度.给予冬眠合剂和肌松药持续静滴,用药剂量主要根据病情作适当调节.直肠温度控制在34℃～35℃,时程24-72h.早期缓慢降低温度,2h后降至35℃左右;如无特殊情况2-4h后降至35℃以下,但不应低于34℃,应保持直肠足底深部温度差在2℃～3℃内.常规治疗组单纯采用常规颅脑损伤措施治疗.正常对照组20例.分别于伤后1、3、7d晨取外周静脉血标本采用酶联免疫斑点法测定TH1、TH2细胞数目.统计学处理:所有数据以x±s表示,采用SPSS 10.0软件行t检验.
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应用四聚体酶联免疫斑点法和细胞内细胞因子染色法检测HIV-1感染者体内特异性细胞毒性T淋巴细胞的研究
目的 应用四聚体(tetramer)、酶联免疫斑点法(ELISPOT)和细胞内细胞因子染色(ICCS)方法研究HIV-1感染者细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的数量和功能.方法 应用三种tetramer检测14例HLA-A2阳性的HIV-1感染者外周血中特异性CTLs的频率,同时采用SL9(SLYNTVATL)体外冲击HIV-1感染者的外周血单核细胞(PBMCs).通过ELISPOT和ICCS方法检测产生γ-干扰素(IFN-γ)的CTLs,初步分析特异性CTLs在HIV-1感染中的作用.结果 Tetramer SL9、IV9和YI9检测出的特异性CTLs占CD8+T细胞的百分比范围分别为0.06%～3.27%,0.05%～0.57%和0.09%～0.66%;其检出阳性率分别为11/14、10/14和5/7.ELISPOT和ICCS检测的产生IFN-γ的细胞近似,但远低于tetramer检测出的病毒特异性CTLs的数量.结论 Tetramer可以敏感地检测出特异性CTLs.ELISPOT和ICCS则是研究CTLs功能的重要手段.联合使用三种方法可以更准确地评价HIV-1感染者体内CTLs的特征及其临床意义.
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DC-Chol佐剂的制备及其对HBsAg的佐剂效应
目的 制备适用于治疗性乙肝疫苗的DC-Chol佐剂.方法 用改良一步法合成DC-Chol,柱色谱精制,用红外光谱、薄层色谱定性分析,高效液相法检测纯度;采用高压均质机制备脂质体,经与HBsAg结合后免疫Balb/c小鼠,ELISA法测血清特异性抗体IgG1和IgG2a水平,ELISPOT法检测免疫后小鼠脾细胞经HBsAg刺激后产生IFN-γ的细胞数.结果 精制后的DC-Chol纯度达到98%;制备的DC-Chol脂质体平均粒径120 nm,Zeta电位33.7 mV,4℃放置18个月为47.7 mV.DC-Chol低有效剂量在每只小鼠0.063～0.125 mg.结论 合成DC-Chol纯度高,制剂稳定性好,低有效剂量低于文献报道.
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T-SPOT.TB与TB-IgG检测在结核病诊断中的价值研究
目的 探讨结核感染T细胞斑点试验(TB-SPOT.TB)与血清结核分支杆菌抗体检测试验(TB-IgG)在结核病诊断中的临床应用价值.方法 回顾性调查2014年6月~2014年12月收治的273例临床疑似结核病病例或待排病例(确诊活动性结核患者41例为结核组,非结核患者232例为非结核组)进行感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)和血清结核分支杆菌抗体(TB-IgG)平行检测,比较两种方法诊断结核病的敏感性、特异性,绘制ROC曲线(受试者工作特征曲线)比较两种诊断试验对肺结核的诊断效果.结果 T-SPOT.TB检测结核临床诊断的敏感性为90.24%(37/41),特异性为80.17%(186/232);TB-IgG检测结核的敏感性为17.07%(7/41),特异性为95.69%(222/232).结核组T-SPOT.TB检测法阳性检出率明显高于TB-IgG检测阳性率(P<0.05),非结核组T-SPOT.TB检测法阳性检出率也明显高于TB-IgG检测阳性率(P<0.05).T-SPOT.TB曲线下面积为0.852,TB-IgG检测曲线下面积为0.564,均超过诊断有效标准0.5,且T-SPOT.TB曲线下面积>0.7,诊断准确性更好.结论 T-SPOT.TB技术检测结核病操作简便且具有较好的敏感性,值得临床推广,但TB-IgG技术对排除结核病具有较好的特异性,可弥补T-SPOT.TB特异性上的不足,是防止误诊的有效补充,临床筛查结核病可联合使用两种诊断方法,进一步提高诊断价值.
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诊断结核感染的新方法——酶联免疫斑点法技术
酶联免疫斑点法(ELISPOT)技术作为一种新的免疫学检测方法用于结核感染的诊断,其主要原理是应用结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6与CFP-10刺激患者外周血T淋巴细胞使T细胞活化释放干扰素γ,根据活化T细胞数来判定是否存在结核感染,此技术因不受机体免疫力及卡介苗接种的影响,而较皮肤结核菌素试验具有更高的特异性及敏感性,现就ELISPOT的技术原理、发展简史、操作步骤及应用进行综述.
