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木脂素促进人胃癌MGC-803细胞凋亡
木脂素(lignans)是一类由苯丙素氧化聚合而成的天然产物,多以二聚体的形式存在,少数为三聚体和四聚体.木脂素类化合物具有广泛的生物活性[1],如抗肿瘤、抗氧化、降压、镇静和保肝等.目前,木脂素对胃癌细胞抗增殖及机制方面的研究尚未见报道.因此,本实验通过木脂素对胃癌细胞增殖的影响与Bax和Bcl-2等蛋白之间的相关性的研究,初步探讨木脂素对胃癌细胞的抗增殖作用及其机制.
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古细菌水通道蛋白AqpM四聚体在脂质双分子层的分子动力学模拟
目的 通过古细菌水通道蛋白 AqpM的分子动力学模拟,为其结构及功能研究奠定基础. 方法 将AqpM四聚体嵌入在二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)脂质双分子层,并加入水模型(TIP3P),使之模拟水通道蛋白与脂质和水分子在真实环境中的相互作用. 结果 模拟过程叶 RMSD值在后2.35 ns的变化较小,表明蛋白和脂质达到终结构的平衡. 结论 成功进行了AqpM脂质平衡系统的分子动力学模拟,并对AqpM通道的结构作了进一步研究,这对了解水通道蛋白结构及其功能具有重要意义.
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组蛋白乙酰化及其与肿瘤的关系
真核细胞中染色质的基本单位核小体,由核心组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)、H1及DNA组成.核小体组装过程中,(H3/H4)2四聚体首先与DNA结合,随后两个H2A/H2B异二聚体,结合到(H3/H4)2结合处的5′和3′DNA上形成核小体.核小体结构修饰是DNA复制、转录、修复过程中的关键步骤.早在30多年前,Allfrey等已发现核心组蛋白N-端乙酰化能调节多种反式作用因子与核小体结合,从而影响基因转录.此后研究不断深入,发现组蛋白可有多种修饰方式:泛素化、磷酸化[1]、乙酰化[2]、甲基化等,它们单独(协同)调节基因转录[3].其中组蛋白乙酰化是解除核小体抑制作用的主要机制,受组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferases,HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)的调控.本文就组蛋白乙酰化与基因转录及其在肿瘤发生、发展中的作用作一综述.
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人工抗原提呈细胞的制备和应用的研究
目的 制备人工抗原提呈细胞(artificial antigen presenting cell,aAPC)并用它从HLA-A2阳性健康个体外周血单个核细胞(PBMC)中诱导和扩增特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL).方法 将HLA-A2-EBV四聚体分子和抗CD28抗体分子吸附固定在细胞大小的聚苯乙烯乳胶微球(5μm)表面制成aAPC;采用流式细胞仪表型分析;aAPC和HLA-A2阳性个体人外周血单核细胞进行混合淋巴细胞反应;用HLA-A*0201-EBV四聚体染色法检测特异性CTL的频率;应用细胞内细胞因子染色法检测特异性CTL功能性细胞因子IFN-γ的分泌;采用LDH释放法检测特异性CTL的特异杀伤活性.结果 流式细胞仪分析显示微球表面吸附有HLA-A2-EBV四聚体分子和抗CD28抗体分子;四聚体检测及细胞内细胞因子染色法检测与经典细胞毒试验结果一致,结果表明aAPC在体外可诱导抗原特异性CTL的生成.结论 aAPC制备成功,并在体外有效地诱导抗原特异性CTL的生成.
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人乳头状瘤病毒11型E7抗原HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的功能鉴定
目的 筛选和鉴定人乳头状瘤病毒11型E7抗原(HPVllE7)HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位.方法 预测HPVllE7抗原HLA-A*0201限制性CTL表位并合成相对应的表位多肽和四聚体(tetramer),即HPVllE7 7-15(TLKDIVLDL)、15-23(LQPPDPVGL)、47-55(PLTQHYQIL)、81-89(DLLLGTLNI)和82-90(LLLGTLNIV).从健康HLA-A*0201成人外周血单一核细胞诱导树突状细胞(DC)并负载上述表位多肽,流式细胞技术检测DC成熟分化标记及ELISA法检测DC分泌的IL-12;成熟DC负载各组多肽后观察DC激活T淋巴细胞的效应,ELISA法检测T细胞分泌的IFN-γ;四聚体检测抗原特异性CD8+ T细胞及乳酸脱氢酶(LDH)释放法评价DC诱导的CTL对靶细胞的特异性体外杀伤效应.结果 预测的5条HPVllE7表位多肽均能诱导DC的成熟分化;E7 7-15、82-90和15-23多肽负载的DC能激活T淋巴细胞分泌高水平IFN-γ;E7 7-15多肽负载的DC能刺激特异性tetramer+CD8+细胞增殖且其诱导的CTL对HPVllE7/293细胞产生高效率的特异性杀伤作用(P<0.05).结论 筛选并鉴定出1条HPVllE7HLA-A*0201限制性CTL表位E7 7-15(TLKDIVLDL),负载该表位肽的DC体外可诱导高效、特异性的CTL效应,抗原性较强,有可能作为HPV感染治疗用肽疫苗的候选表位.
关键词: 人乳头状瘤病毒11型 E7抗原 细胞毒性T淋巴细胞 四聚体 -
大肠杆菌β-半乳糖苷酶EA、ED融合蛋白的表达
大肠杆菌β-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.23)是由四个相同亚基组成的四聚体,相对分子质量(Mr)为540000,通过溴化氰裂解或基因重组技术可得到一系列无酶活性的突变肽段,其中有些突变体在体外能重新聚合成全酶活性的四聚体,这一现象被称为α-互补[1].β-半乳糖苷酶的这种α-互补性已被用于分子生物学、蛋白质与蛋白质相互作用的监控、克隆酶供体免疫分析技术(CEDIA)、表达免疫分析等[2,3].通常具有α-互补活性缺失大部分C端氨基酸的小片段突变体如CNBr2被称为α-供体或酶供体(ED);而缺失N端约40个氨基酸的大片段突变体如M15蛋白被称为α-受体或酶受体(EA).为了进一步研究β-半乳糖苷酶的α-互补特性并促进其应用,我们通过DNA重组技术构建了一对编码β-半乳糖苷酶突变体EA、ED的质粒,并以融合蛋白的方式进行表达制备.
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结核性胸膜炎胸水CD4+与CD8+ T细胞的TCR和CDR3谱型分析
本研究的目的是了解结核性胸膜炎患者胸水中CD4+、CD8+T细胞聚集情况,并建立高效、灵敏的TCR α和β链多重PCR扩增方法,扩增出其特异性CD4+、CD8+T细胞的TCR α和β链全长编码序列,研究病变局部特异性克隆增殖TCR的重排特点以及CDR3(complementarity-determining region 3)谱型,可供构建结核分枝杆菌(Mtb)特异反应性TCR四聚体参考.
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HIV/HCV共感染患者病毒特异性CTL细胞定量研究
目的探讨病毒特异性CTL对HIV/HCV共感染患者病情进展的影响机制. 方法观察对象为HIV/HCV共感染患者、单纯HIV感染者、单纯HCV感染者.采用四聚体技术,运用流式细胞仪检测病毒特异性CTL.前瞻性比较HIV、HCV特异性CTL在三组中的异同,并对HIV/HCV共感染患者的HIV、HCV特异性CTL进行相关性分析. 结果 HIV/HCV共感染组与单纯HIV感染组比较HIV特异性CTL,差异无显著性(P=0.586).HIV/HCV共感染组中HCV特异性CTL的百分数及绝对计数(0.37±0.29, 3.52±3.79)均高于单纯HCV感染组(0.15±0.05, 0.86±0.33),差异有统计学意义(P=0.001, P=0.002).HIV/HCV共感染组中的HIV特异性CTL与HCV特异性CTL存在正性线性相关(P<0.001),方程成立.并且各系数均有统计学意义,方程似然比(r2)0.761. 结论 HCV特异性CTL可能是HIV/HCV共感染组中肝脏功能损伤加重的原因之一;HIV与HCV在同一患者存在相互影响.
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不同病程尖锐湿疣患者特异性CTL细胞频率和功能分析
.48)%,缓解期CA患者的特异性CTL杀伤活性为(59.33±1.71)%,两组间差异有统计学意义(P<0.05).结论 缓解期CA患者与复发期CA患者外周血中特异性CTL数量相近,但缓解期CA患者特异性CTL杀伤活性明显强于复发期CA患者,这可能是不同病程CA患者转归差异的根本原因.
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制备HLA-A*0201型NLVPMVATV肽四聚体用于巨细胞病毒特异CTL检测
目的 制备HLA-A*0201型NLVPMVATV肽四聚体,用于检测病人的巨细胞病毒(CMV)特异CTL,指导临床用药.方法 工程菌以包涵体的形式表达HLA-A*0201型α链和β2m,对包涵体进行洗涤、变性后,在NLVPMVATV肽存在的情况下,在复性液中加入适量的α链和β2m,共同复性形成单聚体,单聚体浓缩后进行生物素化,再纯化浓缩,与PE标记的链亲和素反应,形成四聚体.结果 用制备的四聚体-PE和购买的CD8-FITC能双标记CMV特异CTL,用于流式细胞仪检测.结论 成功地制备了四聚体-PE,可用于病人外周血的CMV特异CTL检测,由此可知病人的细胞免疫功能.
关键词: 四聚体 NLVPMVATV肽 巨细胞病毒 细胞毒T淋巴细胞 -
不同E7多肽/HLA-DRB四聚体分析检测结核患者外周血及胸水标本中多肽特异性CD4+T细胞
目的:应用流式细胞检测技术,探讨不同 E7/HLA-DRB 四聚体检测结核患者外周血及胸水标本中E7多肽特异性CD4+T细胞百分率之间的差异。方法复苏培养能稳定表达E7/HLA-DRB1*090102、E7/HLA-DRB1*130201、E7/HLA-DRB1*150101和E7/HLA-DRB1*130201的果蝇S2细胞株,表达、纯化、制备成相应四聚体。以37例脐带血作为研究对照组,150例肺结核患者外周血和23例结核性胸膜炎患者胸水标本为实验研究组,Ficoll法分离单个核细胞,用PE-E7/HLA-DRB四聚体和鼠抗人CD4-FTIC共染细胞,流式细胞分析检测标本中E7多肽特异性CD4+T细胞百分率,并作统计学分析。结果结核患者外周血和胸水中,各四聚体E7多肽特异性CD4+T细胞百分率检测结果均显著高于脐带血标本相应四聚体检测结果;胸水标本与血标本各自做4种四聚体任意2种四聚体检测结果间比较,结果显示均无统计学差异。此外,在外周血和胸水标本间,任一四聚体的检测结果也无统计学差异。结论不同 HLA-DRB 来源的E7/HLA-DRB 四聚体对于结核检测具有相当的意义,4种四聚体的结核检测特异性无明显差异。并未发现因CD4+T细胞迁移到局部病灶而引发的胸水标本检测结果高于相应四聚体外周血检测结果。
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结核分枝杆菌保护性肽表位KLIANNTRV多聚体的免疫原性研究
抗结核病的保护性免疫机制目前仍不清楚,细胞免疫尤其是循环及感染部位的T淋巴细胞应答被认为起着重要作用.我们采用分子生物学的方法重组表达了结核分枝杆菌保护性肽表位KLIANNTRV二聚体、四聚体和八聚体,并采用结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)试验阳性健康个体的外周血单个核细胞验证其免疫原性,为设计新型结核疫苗奠定良技好的基础.
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重型β地中海贫血的输血治疗
地中海贫血(地贫)又称珠蛋白生成障碍性贫血,是我国南方常见的遗传性疾病,地贫是由于珠蛋白基因发生突变导致血红蛋白(Hb)合成缺陷,红细胞易破裂引发慢性溶血性贫血[1].重型β-地贫因β-珠蛋白基因发生突变,使β-珠蛋白合成缺乏或极度减少,多余的α-珠蛋白形成α四聚体(α4)沉积在红细胞膜上,红细胞破坏增多,寿命明显缩短,导致严重贫血.造血干细胞移植是目前临床上唯一可行的治愈方法,但由于匹配的干细胞供者少、费用昂贵和移植相关风险高等因素,仅有小部分患者受益[2].通过基因治疗替换缺陷的β-珠蛋白基因、恢复正常的造血功能,已经有治疗成功的个案报道[3],但受限于基因表达的时空复杂性,目前仍处于探索阶段.
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应用四聚体酶联免疫斑点法和细胞内细胞因子染色法检测HIV-1感染者体内特异性细胞毒性T淋巴细胞的研究
目的 应用四聚体(tetramer)、酶联免疫斑点法(ELISPOT)和细胞内细胞因子染色(ICCS)方法研究HIV-1感染者细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的数量和功能.方法 应用三种tetramer检测14例HLA-A2阳性的HIV-1感染者外周血中特异性CTLs的频率,同时采用SL9(SLYNTVATL)体外冲击HIV-1感染者的外周血单核细胞(PBMCs).通过ELISPOT和ICCS方法检测产生γ-干扰素(IFN-γ)的CTLs,初步分析特异性CTLs在HIV-1感染中的作用.结果 Tetramer SL9、IV9和YI9检测出的特异性CTLs占CD8+T细胞的百分比范围分别为0.06%~3.27%,0.05%~0.57%和0.09%~0.66%;其检出阳性率分别为11/14、10/14和5/7.ELISPOT和ICCS检测的产生IFN-γ的细胞近似,但远低于tetramer检测出的病毒特异性CTLs的数量.结论 Tetramer可以敏感地检测出特异性CTLs.ELISPOT和ICCS则是研究CTLs功能的重要手段.联合使用三种方法可以更准确地评价HIV-1感染者体内CTLs的特征及其临床意义.
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水通道蛋白-2及加压素的调控——水通道蛋白-2在内淋巴囊的表达和调控
水通道蛋白-2(AQP2)是一种加压素调控的四聚体通道蛋白,是水转运的特异性通道,主要表达于肾脏集合管主细管腔侧(顶端)的细胞膜上和细胞质内。研究发现不论是人类还是大鼠的内耳组织,水通道蛋白-2仅在内淋巴囊表达,其它内耳组织则未见表达;而AQP2是肾脏尿液的重吸收,充血性心衰的水潴留等生理、病理机制的重要环节。这个发现无疑对有关内耳水代谢疾病的研究,如梅尼埃病,开辟了一个新的方向。AQP2在肾脏和内淋巴囊的特异性表达,进一步揭示了耳肾相关的机制,也提示了内淋巴囊在耳肾相关中的重要地位。
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MHC-肽四聚体技术研究进展
抗原特异性T细胞在细胞免疫应答中发挥重要作用.MHC-肽四聚体技术是直接检测抗原特异性T细胞的有效而特异的方法,成为目前研究T细胞免疫应答的重要技术之一.本文就MHC-肽四聚体技术的基本原理、制备方法,以及在病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病等研究领域的应用进展作一综述.
关键词: 主要组织相容性复合体 抗原特异性T淋巴细胞 四聚体 -
微粒体甘油三酯转运蛋白MTP研究进展
MTP存在于细胞微粒体、内质网腔内,在内质网内含量高,占总蛋白的0.5%~1.0%.用层析技术获得纯的MTP在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上表现为两种异构体,其分子质量是58000和88000;另外用沉降平衡技术测得的分子质量是150 000,说明MTP有两种异源二聚体.氨基酸测序和免疫技术分析证明低的是一个亚单位,称为蛋白二硫化合物异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)它的二硫化合物异构酶活性能使新合成蛋白质的一对半胱胺酸残基形成二硫键.另外它也是四聚体酶的成分,四聚体羟化酶有α和β两个亚基,β则为PDI.在体外PDI可以单独存在,其含量超过MTP,也可以自我形成二聚体和四聚体.MTP的大亚基不被去污剂所溶解,其可能与PDI协同翻译有关或者是PDI的分子伴侣(chaperone).PDI对于MTP是很重要的,这表现在当单独将MTP表达在昆虫Sf9,MTP无活性,而与PDI一起表达时MTP才有活性,说明它是MTP的组成和功能基础.PDI由491个氨基酸组成,当它成为MTP成分时活性仅为游离时的1/10,当其解离后活性增加,其活性中心在35~40和379~384两段氨基酸残基序列处.人的MTP大亚基具有高度的保守性、但同源性较低;其少数几个区域与卵黄磷脂蛋白序列具有同源性,可推测它是卵黄原蛋白的家族[1].
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葡萄籽原花青素二聚体的提取分离与结构鉴定
20世纪80年代以来,人们对原花青素的单聚体、二聚体、三聚体、四聚体和高聚体进行生化、药理活性的研究,发现其具有抗氧化、抗致突变、抗心血管疾病等活性,其中二聚体和三聚体活性强[1].葡萄籽原花青素单体主要由(+)-儿茶素(catechin)、(-)-表儿茶素(epicatechin)、(-)-表儿茶素没食子酸酯组成,各单体通过4→6或4→8键相连,形成二聚、三聚、四聚等多聚体.
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系统性红斑狼疮患者血清血小板第4因子的检测及临床意义
血小板第4因子(PF4)属于细胞因子家族中的CXC类趋化因子.人类PF4包括70个氨基酸,由巨核细胞产生,是一种特异性的热稳定蛋白,以非共价四聚体的形式贮存于巨核细胞和血小板α-颗粒中,当血小板黏附、聚集时以蛋白多糖-PF4复合物的形式从血小板释放.
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PTD-BCR/ABL-OD融合癌蛋白的表达和跨膜转运
寡聚化结构域(oligomerization domain,OD)是BCR/ABL融合蛋白N端的一个重要结构域,是2个单体通过N末端螺旋易位,然后在C末端螺旋间形成反向卷曲折叠形成二聚体,进而互相叠套形成四聚体.在几种不同类型的Ph染色体阳性的慢性粒细胞白血病(CML)患者中可以观察到这种四聚体的形成,它能介导BCR/ABL融合蛋白多聚体的形成,进而使无活性的ABL蛋白的酪氨酸激酶活化[1,2].因此,如果能够利用外源性的OD结构域蛋白干预内源性蛋白的聚合,从而达到抑制BCR/ABL蛋白激酶活化的作用.我们在以前工作的基础上,采用PCR扩增OD区基因片段,并在其N端融合蛋白转导结构域(PTD)基因后,构建原核表达载体,然后在大肠杆菌中进行表达.纯化表达的融合蛋白,并加入到培养的K562细胞中,对OD结构域蛋白在细胞中的作用进行了初步探讨.