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NODs蛋白及其与TLRs相互调控在机体抗病原真菌感染中的作用
宿主的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)主要包括Toll样受体(TLRs)和核苷酸结合寡聚化结构域( NODs)两大类受体[1],其中TLRs是胞膜模式识别受体,NODs是近年来新发现的胞质模式识别受体.目前,已有大量关于TLRs与NODs在细菌感染免疫应答中作用的研究,但NODs蛋白在真菌感染中作用的研究报道屈指可数,且NODs与TLRs在抗病原真菌感染中相互调控关系的机制尚不明确.本文主要对NODs蛋白信号通路,NODs与TLRs相互调控关系,NODs蛋白在抗病原真菌感染免疫应答中的作用进行综述.
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核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族及其在痛风炎症反应中的作用
固有免疫系统是机体为古老的免疫系统,普遍存在于多细胞动植物中,参与固有免疫的细胞可以识别广泛存在于病原体上的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),PAMPs是各种微生物赖以生存及具有高度保守的结构.
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寡聚化结构域融合蛋白对K562细胞的作用研究
BCR/ABL融合癌蛋白可导致慢性粒细胞白血病的发生.寡聚化结构域(OD)是BCR/ABL融合癌蛋白上的一个结构域,能激活BCR/ABL融合癌蛋白的酪氨酸激酶活性.
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PTD-BCR/ABL-OD融合癌蛋白的表达和跨膜转运
寡聚化结构域(oligomerization domain,OD)是BCR/ABL融合蛋白N端的一个重要结构域,是2个单体通过N末端螺旋易位,然后在C末端螺旋间形成反向卷曲折叠形成二聚体,进而互相叠套形成四聚体.在几种不同类型的Ph染色体阳性的慢性粒细胞白血病(CML)患者中可以观察到这种四聚体的形成,它能介导BCR/ABL融合蛋白多聚体的形成,进而使无活性的ABL蛋白的酪氨酸激酶活化[1,2].因此,如果能够利用外源性的OD结构域蛋白干预内源性蛋白的聚合,从而达到抑制BCR/ABL蛋白激酶活化的作用.我们在以前工作的基础上,采用PCR扩增OD区基因片段,并在其N端融合蛋白转导结构域(PTD)基因后,构建原核表达载体,然后在大肠杆菌中进行表达.纯化表达的融合蛋白,并加入到培养的K562细胞中,对OD结构域蛋白在细胞中的作用进行了初步探讨.
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OD-PTD融合蛋白对K562细胞的作用
目的 研究OD-PTD融合蛋白对K562细胞的作用.方法 应用细胞计数的方法研究OD-PTD融合蛋白对K562细胞的生长曲线的影响;用MTT研究OD-PTD融合蛋白对K562细胞的细胞毒作用;用流式细胞仪技术研究OD-PTD融合蛋白对K562细胞周期的影响.结果 OD-PTD融合蛋白能显著抑制细胞的生长(P<0.01);并且对K562细胞具有明显的细胞毒作用(P<0.01).OD-PTD融合蛋白作用于K562细胞后,细胞周期变化明显,细胞从G0/G1期到S期发生明显阻滞(P<0.05).结论 OD-PTD融合蛋白对K562细胞有明显的抑制作用,为进一步探讨慢性粒细胞白血病新的治疗手段提供了实验依据.
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TF-CTP-OD2-HA融合蛋白的原核表达及纯化
目的 构建pCold-TF-CTP-OD2-HA原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白.方法 以前期构建的质粒p32a(+)CTP-OD-HA为模板,PCR扩增寡聚化结构域(Oligomerization domain,OD)中起关键作用的OD2基因序列,与胞浆转导肽(Cytoplasmic transduction peptide,CTP)和流感病毒血凝素抗原表位(Hemagglutinin,HA)连接后,克隆至pCold-TF-DNA质粒中,构建质粒pCold-TF-CTP-ODrHA,同时构建质粒pCold-TF-CTP-HA作为对照.将两种质粒分别转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 质粒pCold-TF-CTP-OD2-HA和pCold-TF-CTP-HA经PCR、双酶切和测序鉴定构建正确;表达的融合蛋白TF-CTP-OD2-HA和TF-CTP-HA相对分子质量分别约为63 000和58 000,两种融合蛋白均主要存在于破菌上清中,表达量分别约占菌体总蛋白的32%和25%,破菌沉淀中有少量表达;纯化的融合蛋白纯度均达95%以上,均可与鼠抗HA-tag多克隆抗体特异性结合.结论 成功构建了pCold-TF-CTP-OD2-HA原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化了融合蛋白,为后续研究其在CML中的作用机制奠定了基础.
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融合蛋白TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA的原核表达、纯化及其生物学活性
目的 原核表达、纯化融合蛋白TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA,并检测其生物学活性.方法 以pET32a(+)CTP-OD-HA为模板,PCR扩增OD序列中的第1-87 bp和第190-216 bp序列,并通过重叠PCR连接成为新序列,命名为OD1,克隆至pET32a(+)载体,构建原核表达质粒pET32a(+)CTP-OD 1-HA;再分别以pET32a(+)CTP-OD-HA和pET32a(+)CTP-OD1-HA质粒为模板,PCR扩增CTP-OD-HA和CTP-OD 1-HA片段,分别克隆至表达载体pCOLD-TF-DNA,构建质粒pCOLD-TF-CTP-OD-HA和pCOLD-TF-CTP-OD1-HA,转化E.coli BL21,IPTG诱导表达TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA融合蛋白;表达的融合蛋白经镍离子亲和层析纯化和脱盐浓缩后,采用MTT法和DAPI染色检测两种融合蛋白对K562细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用.结果 重组原核表达质粒pCOLD-TF-CTP-OD-HA和pCOLD-TF-CTP-OD 1-HA经菌落PCR及测序证实构建正确;表达的TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD 1-HA融合蛋白相对分子质量分别约为67 000和63 000,主要为可溶性表达,表达量分别占总菌体蛋白的35%和20%,脱盐浓缩后,纯度分别约为98%和95%,均可与鼠抗HA单克隆抗体特异性结合;TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA对K562细胞的增殖抑制率分别为34%和31%,与PBS对照组比较,差异有统计学意义(P<0.001);TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD 1-HA处理的K562细胞胞核均具有细胞凋亡的典型特征.结论 原核表达并纯化了TF-CTP-OD1-HA融合蛋白,该蛋白具有与TF-CTP-OD-HA相似的生物学活性,为今后开发治疗慢性粒细胞白血病的小分子多肽药物提供了新的策略.
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白细胞介素1受体相关激酶1旁路引发和直接连接Toll样受体至快速核苷酸结合寡聚化结构域样受体含热蛋白结构域3炎性体激活
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CARD15基因突变与中国人克罗恩病易感性的关系
克罗恩病(CD)是一种多基因决定的疾病.近年来,位于染色体16q21的胱冬蛋白酶激活与募集区(caspase activation and recruitment domain 15, CARD15)基因作为第一个与CD相关的基因被多个实验小组所证实[1].CARD15基因是核苷酸结合寡聚化结构域/凋亡蛋白酶活化因子1(nucleotide-binding oligomerisation domain-1/apoptotic protease activating factor 1, Nod1/Apaf-1)家族的一员,主要在外周血单核细胞中表达,并可编码1个有2个CARD结构域和6个富含亮氨酸重复区(leucine-rich repeats, LRR)的蛋白质.CARD15蛋白在对细菌脂多糖类(LPS)发生的免疫反应中起作用,可识别外来细菌的胞壁酰二肽(MDP),然后激活核因子(NF)-κB[2].
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NLRP3炎症体在肾脏疾病中作用的研究进展
核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3[nucleotide?binding oligomerization domain(NOD)?like receptors family, pyrin domain containing 3,NLRP3]是先天性免疫系统中具有代表性的核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族(NLRs)成员,受到刺激活化后招募含有CARD结构域的凋亡相关斑点蛋白(apoptosis?associated speck?like protein containing a caspase recruitment domain,ASC)与含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1, caspase?1)前体,形成炎症体.研究发现NLRP3炎症体参与多种炎性反应疾病,并与多种肾脏疾病相关.我们对新的研究作一综述.
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BCR/ABL-OD结构域重组蛋白的表达和纯化
目的: 制备BCR/ABL-OD结构域-HIS的重组蛋白.方法: 用RT-PCR方法扩增BCR/ABL-OD结构域的基因片段,测序正确后将其克隆入原核表达载体pET16b中,并进行酶切鉴定,鉴定正确后转化大肠杆菌BL21,构建表达His-OD融合蛋白的菌株.经IPTG诱导表达后,镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖进行亲和层析纯化,用SDS-PAGE对该融合蛋白的表达产率及蛋白纯度进行了分析.结果: 获得了His-OD重组融合蛋白,纯度在95%以上,产物得率约75%.结论: 成功制备高纯度His-OD融合蛋白,为进一步研究OD结构域的生物学功能奠定了基础.