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NOD2信号增强对负载白血病抗原的树突状细胞的作用研究
本研究旨在探讨胞壁酰二肽(muramyldipeptide,MDP)激活NOD2信号通路对白血病抗原致敏的树突状细胞(dendritic cells,DC)的免疫调控影响.采用梯度离心法获取健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononu-clear cells,PBMNC),体外给予3种细胞因子诱导培养7d,第5d给予白血病细胞株HL-60冻融抗原致敏DC,DC诱导成熟后,给予MDP(2000 ng/ml,24h)刺激各组细胞.应用RT-PCR和Western blot检测NOD2 mRNA和蛋白表达,流式细胞仪分析各组DC表面分子,ELISA法检测各组DC培养上清中IL-12和p40表达.结果显示:MDP作用于经不同方式处理的DC后,可以刺激NOD2 mRNA和蛋白的表达,并以负载白血病细胞株HL-60冻融抗原并给予MDP刺激DC组(致敏DC+ MDP组)高,其显著高于仅给予MDP刺激无负载抗原DC组(DC+ MDP组)和无MDP刺激致敏DC组,差异有统计学意义(P＜0.05);DC表面分子(HLA-DR、CD80、CD83、CD86、CD40)在致敏DC+ MDP组表达明显高于DC+ MDP组和致敏DC组,未处理DC表达低,差异有统计学意义(P＜0.05);同样地发现,致敏DC+ MDP组分泌细胞因子IL-12 p40高为(898.30±61.08) pg/ml,显著高于DC+ MDP组(573.86±32.09) pg/ml和致敏DC组(365.03 ±28.86) pg/ml,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:MDP可明显上调致敏DC中NOD2 mRNA和蛋白表达,同时促进致敏DC表面HLA-DR、协同共刺激分子、黏附分子表达及炎性因子IL-12和p40分泌.本研究有望为DC在白血病免疫治疗中的应用提供新思路.
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96、佐剂
佐剂是同抗原物质混合在一起进行免疫,增强机体免疫应答反应的物质.福氏佐剂是用液体石腊等矿物油类物质制成,同抗原水溶液混合,经研磨后能制备出油包水的混悬液,将其注射后,能使抗原物质缓慢释放,少量抗原持续性刺激免疫系统能增强免疫应答反应.如把结核杆菌、BCG、MDP(胞壁酰二肽)等物质加入福氏佐剂中,则可制备出福氏完全佐剂,就能诱导出强烈的细胞免疫.不加细菌的则称为福氏不完全佐剂.
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胞壁酰二肽对烟曲霉孢子刺激A549细胞分泌细胞因子的影响及其可能机制
目的:研究胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)对烟曲霉孢子刺激人肺腺癌细胞株A549分泌细胞因子的影响及其可能机制.方法:应用透射电镜观察A549细胞吞噬烟曲霉孢子；采用实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,Real time PCR)检测MDP对烟曲霉孢子刺激A549细胞分泌肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的影响；Real-time PCR检测烟曲霉孢子刺激A549细胞后核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2(nucleotide-binding oligomerization domain protein 2,NOD2) mRNA的表达；采用免疫荧光法检测烟曲霉孢子刺激A549细胞后NOD2蛋白的表达.结果:与灭活的烟曲霉孢子共孵育10h后,A549细胞内可见吞噬的烟曲霉孢子；MDP联合烟曲霉孢子刺激显著增加了A549细胞中TNFαmRNA的表达(P＜0.05)；A549细胞吞噬烟曲霉孢子24 h时细胞NOD2 mRNA表达较0h显著增加(P＜0.05),48h时NOD2 mRNA表达较24 h时减少,差异有统计学意义(P＜0.05)；A549细胞吞噬烟曲霉孢子后24 h细胞内NOD2蛋白表达增加.结论:A549细胞能够吞噬烟曲霉孢子,MDP刺激可显著增加吞噬烟曲霉孢子的A549细胞分泌TNF-α,其作用可能是通过NOD2对烟曲霉孢子的识别来实现的.
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肠道微生物菌群紊乱和肠道黏膜屏障功能障碍——肝脏疾病的致命要害?
细菌移位(BT)是指活体微生物及其产物(内毒素如脂多糖、脂磷壁酸、细菌DNA、肽聚糖和一些诸如胞壁酰二肽等碎片)穿越结构完整的肠黏膜屏障,从肠腔内转移到肠系膜淋巴结(MLN)和其他肠外器官和部位."细菌移位"这个概念涵盖了各种不同细菌产物的移位,但这些产物移位的路线、具体部位、彼此之间免疫应答都是不同的.
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反义胰岛素样生长因子Ⅱ与胞壁酰二肽联合抗肝癌实验研究
目的探讨反义胰岛素样生长因子Ⅱ(反义IGF-Ⅱ)与胞壁酰二肽(MDP)联合抗肝癌作用.方法化学合成人IGF-Ⅱ5＇端部分cDNA片段,克隆于真核表达载体pcDNA3;将反义IGF-Ⅱ、MDP包裹于脂质体中,同时转导入体外培养的HepG2人肝癌细胞株中、注射于裸鼠皮下人肝癌移植瘤内,观察两者联合应用对肝癌细胞生长的影响.结果反义IGF-Ⅱ与MDP同时转导入体外培养的HepG2人肝癌细胞株后,细胞增殖处于停滞状态,同时注射于裸鼠皮下人肝癌移植瘤内,5只裸鼠中有2只肿瘤完全消散.结论反义IGF-Ⅱ与MDP联合应用具有明显的抗肝癌作用.
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CARD15基因突变与中国人克罗恩病易感性的关系
克罗恩病(CD)是一种多基因决定的疾病.近年来,位于染色体16q21的胱冬蛋白酶激活与募集区(caspase activation and recruitment domain 15, CARD15)基因作为第一个与CD相关的基因被多个实验小组所证实[1].CARD15基因是核苷酸结合寡聚化结构域/凋亡蛋白酶活化因子1(nucleotide-binding oligomerisation domain-1/apoptotic protease activating factor 1, Nod1/Apaf-1)家族的一员,主要在外周血单核细胞中表达,并可编码1个有2个CARD结构域和6个富含亮氨酸重复区(leucine-rich repeats, LRR)的蛋白质.CARD15蛋白在对细菌脂多糖类(LPS)发生的免疫反应中起作用,可识别外来细菌的胞壁酰二肽(MDP),然后激活核因子(NF)-κB[2].
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胞壁酰二肽-抗CD10免疫偶联物对急性淋巴细胞白血病患儿树突状细胞的影响
目的 观察胞壁酰二肽与抗CD10单克隆抗体偶联物(MDP-Ab)对急性白血病患儿树突状细胞(DC)活性的影响.方法 采用本课题组新合成的MDP-Ab作用于急性淋巴细胞性白血病患儿分离培养所得的DC.分为6组:对照组、未偶联的抗 CD10抗体组、未偶联的 MDP组、MDP-Ab组、脂多糖(LPS)组及MDP-Ab+LPS组,培养8 d,收集各组DC,检测细胞免疫表型、内吞作用及细胞上清液中白细胞介素12(IL-12)水平.采用活细胞荧光剂羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色法检测各组作用的淋巴细胞增殖情况,酶联免疫吸附法检测上清液干扰素-γ(IFN-γ)水平.结果 1.DC细胞免疫表型:MDP-Ab促进白血病患儿外周血DC表达人白细胞(位点)DR抗原(HLA-DR)、共刺激分子(CD80、CD86)及成熟分子(CD83)的阳性细胞均明显高于对照组、未偶联的抗 CD10抗体组及未偶联的 MDP组,但低于 LPS组及 MDP-Ab +LPS组(F =629.62,P=0.000).2.IL-12水平:MDP-Ab组、LPS组及MDP-Ab+LPS组均明显高于对照组、未偶联的抗CD10抗体组及未偶联的MDP组(F=857.87,P=0.000).MDP-Ab组与LPS组、MDP-Ab+LPS组相比,亦有显著性差异(P<0.05).3.DC吞噬功能:对照组(即未成熟DC)为(81.3 ± 10.1)%,明显高于未偶联的抗CD10抗体组、未偶联的MDP组、MDP-Ab组、LPS及MDP-Ab+LPS组(F=383.04,P=0.000).4.混合淋巴细胞反应及IFN-γ水平:与对照组、未偶联的抗CD10抗体组及未偶联的MDP组相比,MDP-Ab组、LPS组及MDP-Ab+LPS组CFSE阳性细胞及IFN-γ水平明显增高,以MDP-Ab+LPS组为高(F=393.36,P=0.000;F=2497.18, P=0.000).结论 新合成的免疫偶联物MDP-Ab能促进白血病患儿外周血DC成熟.
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胞壁酰二肽对人主动脉内皮细胞炎症因子表达影响的研究
目的:观察胞壁酰二肽对人主动脉内皮细胞数种炎症因子表达的影响.方法:用胞壁酰二肽(MDP)按要求对人主动脉内皮细胞(HAECs)进行处理,运用实时定量RT-PCR以及RT-PCR测定IL-1β,IL-8,MCP-1,IFN-α与IFN-β基因的表达.用Western blot与RT-PCR方法研究MDP影响IFN-α,IFN-β表达的机制.结果:经MDP处理后,HAECs细胞中炎症因子IFN-α,IFN-β,IL-1β,IL-8和MCP-1的表达上调.结论:MDP可以通过上调HAECs细胞炎症因子的表达.
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胞壁酰二肽激活小鼠原代肝窦内皮细胞中NOD2信号
目的 调查小鼠原代肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)中NOD2信号通路激活后产生的免疫应答效应.方法 使用胶原酶灌注方法结合percoll密度梯度离心加抗小鼠LSEC免疫磁珠分离纯化小鼠LSEC.定量PCR检测小鼠原代LSEC NOD1和NOD2 mRNA表达水平,同时给胞壁酰二肽刺激小鼠原代LSEC;定量PCR检测NOD2、RIP2、TNF-α和IL-6mRNA表达水平;定量ELISA检测细胞上清IL-6和TNF-a蛋白产量.结果 小鼠原代LSEC中NOD2基础表达水平相对于NOD1基础表达水平较低.胞壁酰二肽刺激LSEC后诱导NOD2及其下游分子RIP2表达水平上调,接着诱导产生IL-6效应分子,而没有诱导产生TNF-α等其它细胞因子和趋化因子.结论 胞壁酰二肽能够激活小鼠LSEC中NOD2介导的信号通路,并诱导产生IL-6效应分子,可能在维持肝脏内环境稳定中发挥着重要作用.
