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c-ras与大鼠颗粒细胞和黄体细胞生成孕酮的关系
应用离体细胞培养,研究了反义c-ras寡脱氧核苷酸(反义c-ras ODN)对人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导的大鼠颗粒细胞和黄体细胞生成孕酮(P)的影响及其与外源性cAMP和Ca2+的关系.结果发现,20 μmol/L反义c-rasODN能显著抑制hCG诱导颗粒细胞的P生成量(P<0.05),而对黄体细胞的P生成无明显影响;反义c-ras ODN对hCG诱导的颗粒细胞生成P的抑制作用能被加入10-4 mol/L二丁酰cAMP所逆转,钙通道阻断剂维拉帕米对抑制作用具有协同效应.结果提示,c-ras癌基因参与hCG诱导的颗粒细胞生成P的调控,而对hCG诱导的黄体细胞P生成关系不大.
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ERCC1反义RNA降低肺癌细胞对苯并(a)芘所致DNA损伤的修复能力
目的探讨核苷酸切除修复基因ERCC1在肺癌细胞修复苯并(a)芘所致DNA损伤中的作用.方法构建表达ERCC1反义RNA的重组质粒,Lipofectin转染肺癌A549细胞,潮霉素筛选出稳定转染的细胞克隆;噻唑蓝法检测24 h细胞生存力;Northern Blot分析细胞ERCC1基因mRNA表达水平;单细胞凝胶电泳技术检测DNA损伤程度,每组计算50个细胞损伤情况.结果筛选出表达ERCC1反义RNA的7个阳性克隆,其生长特性与亲本细胞差别无显著性;内源性mRNA表达水平不同程度降低,为亲本细胞的12%～86%;DNA损伤修复速度减慢,10μmol/L苯并(a)芘作用24 h后再孵育24 h,修复程度为亲本细胞的29%～71%;相关分析表明DNA损伤修复程度与ERCC1mRNA水平显著相关.结论ERCC1反义RNA降低肺癌细胞对苯并(a)芘所致DNA损伤的修复能力.
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反义寡核苷酸体外抗乙型肝炎病毒研究
目的探讨反义寡核苷酸的体外抗病毒作用,为基因水平上防治乙型肝炎病毒(HBV)感染及HBV相关肝细胞癌的基因治疗提供实验依据.方法用PCR方法分别合成了互补于HBV X基因的翻译起始区、DR2区、ENⅡ区的反义寡核苷酸(AsON)及无关序列,其中针对ENⅡ设计的AsON,目前尚未见互补于该区段反义寡核苷酸的报道.以HBV DNA转染的HepG2.2.15细胞为靶细胞,ELISA法检测AsON作用前后细胞上清中的HBsAg和HBeAg分泌情况.结果当AsON的佳作用浓度为10 μmol/L时,3种反义寡核苷酸对HBsAg和HBeAg抑制率分别为:57%、60%、52%和56%、45%、56%,AsON 对HBV抗原的抑制作用具双峰现象.无关序列无明显抑制作用(<12%).利用锥虫蓝染色、四甲基偶氮唑盐比色试验观察到当AsON作用浓度为40 μmol/L时,对细胞代谢无明显毒副作用.结论反义寡核苷酸封闭HBV X基因区的关键区段,可有效抑制HBV抗原的分泌.
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JWA基因的蛋白缺陷对苯并(a)芘所致HeLa细胞DNA损伤的影响
目的研究JWA基因表达缺陷对苯并(a)芘诱导细胞DNA损伤与修复的影响及可能机制.方法构建JWA基因反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-C1-asJWA),用该载体稳定转染人宫颈癌细胞(HeLa)获得JWA蛋白缺陷细胞株(asJWA-HeLa),在含有S9的培养条件下以50 μmol/L苯并(a)芘处理细胞3 h,再恢复不同时间,用碱性单细胞凝胶电泳方法鉴定DNA损伤程度.结果 asJWA-HeLa细胞JWA蛋白表达水平比对照下降了69%.在苯并(a)芘致DNA损伤模型中,asJWA-HeLa细胞的DNA损伤程度重于对照细胞,并且出现明显的DNA修复延迟现象.结论JWA作为一种新的环境应答基因,活跃地参与了苯并(a)芘诱导的HeLa细胞DNA损伤与修复过程,并在其中起着积极的保护作用.
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靶向ASGPR的反义核酸与抗HBV药物联合用药的体外抗HBV作用
研究以宿主基因ASGPR为靶的反义核酸与抗乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)药物联合应用的抗-HBV作用,为HBV感染的联合治疗和用药提供新的思路.以HepG2.2.15细胞为靶细胞,脂质体为载体将靶向ASGPR的硫代反义寡核苷酸(ASODN)转染至HepG2.2.15细胞中,6h后加入抗病毒药拉米夫定(3TC)或阿地福韦(ADV),72h后收集细胞培养液,采用酶联免疫法及荧光定量PCR法测定ASODN与抗-HBV药物联合应用后对细胞培养液中HBsAg、HBeAg及细胞分泌HBV DNA的抑制作用.采用金正均Q值法对数据进行分析.拉米夫定(3TC)和阿地福韦(ADV)分别与ASODN联用对HBsAg的抑制呈相加或协同作用.随着ADV浓度的增加,两药的协同作用下降.3TC与ASODN联用对HBeAg的抑制呈拮抗、相加和协同作用,其拮抗作用随着3TC浓度的增加逐渐减弱.ADV与ASODN联用对HBeAg的抑制只呈相加作用.3TC和ADV分别与ASODN联用对HBV DNA的抑制均表现为相加作用或协同作用,取ADV0.5μmol/L与取ASODN0.2μmol/L联用时对HBV DNA的抑制率可提高到72.6%.ASODN在一定条件下分别与3TC及ADV联用有相加或协同抗HBsAg、HBeAg及HBV DNA的表达,尤以抗HBsAg作用显著增强.
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逆转录病毒载体介导的端粒酶抑制基因促胰腺癌细胞凋亡
目的 研究逆转录病毒载体介导的端粒酶反义RNA促进胰腺癌细胞Can-pan-2凋亡的作用.方法 通过电穿孔法将携带正反义端粒酶RNA基因的逆转录病毒载体导入PT67包装细胞,G418筛选抗性细胞,获取稳定表达病毒的产病毒细胞株,以病毒上清感染Can-pan-2细胞,G418筛选获得稳定转染细胞集落并扩增培养,PCR鉴定端粒酶RNA基因的表达,TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性,免疫荧光化学检测不同处理组细胞的增殖情况,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡.结果 两种逆转录病毒上清的滴度分别为0.95×106 CFU/mL和1.1×106 CFU/mL,PCR法可于约500 bp处观察到目的基因的表达,反义端粒酶RNA作用后,Can-pan-2细胞端粒酶活性和细胞增殖受到明显抑制,并出现明显的细胞凋亡.结论 反义端粒酶RNA可抑制胰腺癌细胞端粒酶活性,促进胰腺癌细胞的凋亡.
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反义VEGF165基因转染对人神经母细胞瘤生物学行为的影响
目的探讨反义VEGF165基因转染在抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长中的作用. 方法构建正义和反义VEGF165真核表达载体,用脂质体转染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,G418筛选稳定表达细胞克隆.应用RTPCR证实外源性反义VEGFmRNA的表达,免疫细胞化学和ELISA检测VEGF蛋白的表达水平,MTT法检测肿瘤细胞体外生长情况,并接种于裸鼠皮下,观察体内肿瘤增殖能力.结果RT-PCR证实转染反义VEGF的细胞中有外源性反义VEGFmRNA的表达,免疫细胞化学和ELISA显示VEGF蛋白表达明显降低,MTT实验显示转染前后细胞体外生长速度基本一致,而转染反义VEGF的肿瘤细胞裸鼠体内生长速度明显减慢.结论反义VEGF基因转染能够有效抑制SH-SY5Y细胞内源性VEGF蛋白的表达,抑制裸鼠体内肿瘤的生长.
关键词： 血管内皮细胞生长因子 神经母细胞瘤 反义 基因治疗 人 -
三种反义c-myc RNA对成纤维细胞NIH3T3的体外生物学效应
目的 了解反义c-myc基因稳定整合对正常细胞的影响。 方法 将分别载有c-myc第1、2和3外显子的反义片段的3种反义c-myc重组逆转录病毒表达载体aM1、aM2和aM3，导入c-myc正常表达的正常小鼠成纤维细胞系NIH3T3，并在基因稳定表达后进行各项检测。 结果 3种反义载体导入明显抑制了NIH3T3 c-myc表达(抑制作用aM2>aM3>aM1)、PCNA表达(aM2>aM1>aM3)，使细胞体外生长增殖活性下降(下降程度aM2>aM1>aM3)，aM2、aM3还使细胞周期出现了延长和DNA合成减少，并使NIH3T3软琼脂集落形成能力下降(aM2>aM3)。 结论 反义c-myc RNA的导入对正常细胞的生长增殖能力有抑制作用，提示局部治疗和靶向治疗在反义c-myc基因治疗中的必要性。
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核因子κB p65反义寡核苷酸对大鼠肝星状细胞增殖和I型胶原表达的影响
目的 探讨核因子κB(NF-κB)p65反义寡核苷酸(ASOND)对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖和I型胶原表达的影响.方法 Ⅳ型胶原酶消化密度梯度离心法分离培养大鼠HSC;脂质体介导的不同浓度的NF-κB p65 ASOND(0.001、0.01、0.1和1μmol/L)进入HSC;台盼蓝染色排斥法检测NF-κBp65 ASOND对HSC的毒性实验并检测各组乳酸脱氢酶(LDH)活性;MTT法测定NF-κB p65 ASOND对1mg/LTNF-α刺激后HSC增殖影响;RT-PCR法和ELISA法检测不同浓度NF-κB p65 ASOND对1mg/LTNF-α刺激后HSC I型胶原表达的影响.结果 转染NF-κB p65 ASODN后,HSC细胞NF-κB蛋白的表达下降,不同浓度(0.001、0.01、0.1和1 μmol/L)的NF-κB p65 ASOND对于体外培养HSC的存活率和LDH无明显影响(P>0.05),0.01～μmol/L的NF-κB p65 ASOND抑制HSC的增殖,lmg/L TNF-α刺激HSC的I型胶原蛋白和mRNA的表达,且随浓度的增加作用增强(P<0.05).结论 NF-κB p65 ASOND可通过抑制NF-κB活性减少HSC活化增殖及Ⅰ型胶原生成,从而减少细胞外基质的产生.
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基于反义RNA技术的FabI抑制剂筛选模型的构建
目的 基于反义 RNA 沉默技术构建针对细菌 FabI 的超敏全细胞筛选模型,用于筛选 FabI 抑制剂.方法 以 Escherichia coli 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增fabI 基因的 -74 ～ 86 bp 核苷酸序列,反向插入携带 pairedtermini 结构的反义质粒 pHN678 中,得到重组质粒pHNF,再转化至 E.coli 中,得到反义工程菌 E.coli/pHNF;通过平板表型观察对反义工程菌进行筛选;考察了 IPTG浓度对筛选模型的影响,确定 96 孔板抗菌筛选模型的条件,并用三氯生作为阳性对照、氨苄西林和浅蓝菌素作为阴性对照对该模型进行评价.结果 获得了针对 fabI 的反义工程菌,确定了适 IPTG浓度为 40 μmol/L,成功构建了 FabI 特异性酶抑制剂的超敏全细胞筛选模型,并验证了其可行性.应用该筛选模型对5847 个内生真菌次级代谢产物进行活性筛选,初筛阳性率约为 9.7%,经复筛后获得 8 份阳性样品.结论 成功建立了基于反义 RNA 沉默技术的 FabI 超敏全细胞筛选模型,并利用该模型筛选到 8 份阳性样品.
关键词： RNA 反义 药物评价 临床前 烯脂酰-ACP还原酶 -
尿激酶受体反义核糖核酸抑制肺癌细胞的侵袭转移
目的用反义核糖核酸(RNA)封闭尿激酶受体的表达,抑制人肺癌细胞株95D的侵袭转移能力,验证反义RNA技术在抗肿瘤中的作用.方法将尿激酶受体(uPAR)反义核糖核酸表达质粒转染具有高度侵袭转移能力的人肺癌细胞株95D,利用改良Bovden小室分析转染细胞的体外侵袭能力,并将转染细胞接种裸小鼠以观察其体内转移能力.结果G418筛选后,鉴定出2个表达uPAR反义RNA细胞克隆,uPAR蛋白质水平相应降低.表达uPAR反义RNA的细胞克隆的体外侵袭能力及在裸小鼠体内的肺转移能力较亲本细胞和空载体对照细胞均有显著性降低(P＜0.05).结论抑制尿激酶受体的表达,能够有效抑制肺癌的侵袭转移,反义RNA技术在抗肿瘤治疗中有良好的应用前景.
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前列腺凋亡反应基因4反义寡核苷酸抑制谷氨酸诱导的PC12细胞内钙离子浓度上调及其抗凋亡意义
目的研究前列腺凋亡反应基因4(par-4)反义寡核苷酸拮抗谷氨酸对PC12细胞内游离钙离子浓度的上调作用及其抗凋亡意义.方法脂质体介导转染par-4反义寡核苷酸.谷氨酸诱导PC12细胞凋亡.Hoechest 33258/碘化丙啶荧光染色观察细胞凋亡形态,流式细胞术分析凋亡百分率.Fura-2/AM荧光染色结合激光共聚焦显微镜测定细胞内游离钙离子浓度.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定钙依赖性蛋白酶Calpain10的mRNA水平.Western印迹测定par-4蛋白表达量.结果与正常对照组(25.6±4.1)相比,谷氨酸诱导PC12细胞中par-4蛋白表达上调(90.0±3.2,P<0.01),par-4反义寡核苷酸拮抗其上调(52.3±5.0,P<0.01);谷氨酸诱导凋亡组凋亡百分率为53%, par-4反义寡核苷酸拮抗谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡(31%,P<0.01);谷氨酸诱导PC12细胞内游离钙离子浓度上调,par-4反义寡核苷酸拮抗其上调(荧光强度比值分别为167.9±32.4、228.8±36.8,P<0.01);谷氨酸诱导PC12细胞内钙依赖性蛋白酶Calpain10 mRNA水平上调(46.3±3.7),par-4反义寡核苷酸抑制其上调(34.8±2.1,P<0.01).结论 par-4反义寡核苷酸拮抗谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡,其机制可能与抑制细胞内游离钙离子浓度上调和抑制Calpain10基因转录有关.
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反义凝血酶受体基因表达抑制大鼠动脉内膜损伤后内膜增生
目的了解凝血酶及其受体在血管损伤后动脉内膜增生中的作用,以进一步阐明经皮冠状动脉血管腔内成形术(PTCA)后再狭窄的发生机制,为寻找再狭窄的防治途径提供线索.方法采用球囊导管损伤动脉内膜的方法建立大鼠颈动脉球囊损伤模型.用纳米粒子包装凝血酶受体重组反义基因质粒pLXSN/ATR,用保留灌注的方法局部定位转染损伤后的大鼠颈动脉.结果 PCR检测发现重组基因整合,RNA斑点杂交观察到实验组大鼠颈动脉壁内有重组反义凝血酶受体基因表达,正义凝血酶受体基因的表达受到明显抑制,反义基因转染组新生内膜、中膜比例降低了40.9%.结论反义凝血酶受体重组基因转基因表达对大鼠颈动脉球囊损伤后动脉内膜的增生具有抑制作用,提示凝血酶及其受体在PTCA后再狭窄过程中有重要作用,为再狭窄的防治提供了新的线索.
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Bcl-XL反义寡核苷酸转染对食管癌细胞增殖及裸鼠体内人食管癌移植瘤生长的抑制作用
目的探讨Bcl-XL反义寡核苷酸转染后,对食管癌细胞增殖及裸鼠体内人食管癌移植瘤生长的影响.方法采用阳离子脂质体介导的反义寡核苷酸转染、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western蛋白印迹杂交、四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT法)、流式细胞术及凋亡的原位末端标记(TUNEL)检测等方法观察了Bcl-XL反义寡核苷酸转染对食管癌细胞增殖、凋亡的影响及裸鼠体内人食管癌移植瘤生长的影响.结果 MTT法检测显示,Bcl-XL 反义寡核苷酸可显著抑制食管癌细胞的增殖(P<0.05);对Bcl-XL mRNA表达抑制率为57.3%,可显著下调Bcl-XL的蛋白表达;应用流式细胞术和TUNEL检测技术,反义寡核苷酸组的凋亡率分别为(31.1±5.8)%和35.0%,与相关对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).反义寡核苷酸组裸鼠体内人食管癌移植瘤的生长受到显著抑制(P<0.05).Bcl-XL mRNA及蛋白表达亦受到明显抑制,并且移植瘤组织中凋亡细胞明显增加.结论 Bcl-XL 反义寡核苷酸可有效抑制食管癌细胞增殖及裸鼠体内人食管癌移植瘤的生长.通过反义寡核苷酸下调Bcl-XL的表达,达到治疗食管癌的目的,为食管癌的基因治疗提供实验依据.
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跨膜型和分泌型肿瘤坏死因子α对内毒素性休克肝的影响及意义
目的探讨分泌型(S)和跨膜型(TM)肿瘤坏死因子α(TNF-α)对内毒素性休克肝的影响及意义.方法首先使用埃氏大肠杆菌死菌液制备大鼠内毒素性休克模型;并分不同时间点检测血清中的S-TNF-α、腹腔巨噬细胞表面上的 TM-TNF-α;然后,在给大鼠注射死菌液之前30 min,注射TNF-α转化酶(TACE)反义寡核苷酸(5 mg/kg);6 h后分别检测S-TNF-α、TM-TNF-α水平;检查肝脏的病理改变,并监测各组大鼠的血压变化.结果在内毒素性休克过程中,TM-TNF-α表达的动态变化不同于 S-TNF-α, TM-TNF-α在注射菌液30 min后开始升高,4.5 h达高峰,随后有所下降,但一直维持在较高水平.TACE反义寡核苷酸能有效地抑制TM-TNF-α转化为S-TNF-α,使腹腔巨噬细胞表面上的TM-TNF-α表达明显增高(P<0.001),使血压维持在正常水平,肝脏未见病理改变.结论内毒素性休克的病理过程主要与S-TNF-α有关,而 TM-TNF-α则可抵抗内毒素的攻击,稳定血压,限制炎症反应及保护肝组织免受损伤,此研究为临床治疗休克和感染性疾病提供了新的线索和实验依据.
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Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸抑制HL-60细胞在重度联合免疫缺陷鼠中生长的研究
目的分析bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(ASPO)抑制HL-60细胞在重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内致白血病作用, 探讨应用bcl-2 ASPO体外净化白血病可行性.方法应用终浓度为10 μmol/L ASPO和正义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(SPO)与HL-60细胞共孵育,7 d后,1×107个活细胞腹腔接种SCID鼠;在35 d后处死2组动物,用半巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测SCID小鼠外周血、骨髓、肝脏、脾脏的HL-60细胞,组织病理观察它们浸润分布情况.结果 ASPO处理组HL-60细胞bcL-2表达下降,体外增殖抑制,凋亡,在SCID鼠中不会产生白血病,且未有残留;SPO组HL-60细胞不受影响,仍可在SCID鼠体内广泛增殖浸润,产生白血病.结论 bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸体外处理白血病细胞后可以抑制其体内增殖作用,可达到体外净化目的.
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个体性反义RNA对乳腺癌细胞突变p53基因表达的特异性封闭作用
目的 研究针对p53基因突变的个体性反义RNA对乳腺癌突变p53基因的特异性封闭作用.方法 通过免疫细胞化学LSAB法染色、聚合酶链反应-单链构象多态性分析及测序确定人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中p53突变位点,构建针对该突变点的反义表达载体并制备其反义RNA.原位杂交技术检测反义RNA与细胞内突变p53基因的特异性结合;在阳离子脂质体介导下将反义RNA转染细胞;以免疫细胞化学LSAB法染色及细胞生长抑制率观测反义RNA作用时效;Western blot检测p53蛋白的表达;四甲基偶氮唑盐法检测转染细胞的生长活性;流式细胞术检测转染细胞的细胞周期分布;原位缺口末端标记法检测转染细胞的凋亡情况.结果 人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的p53第8外显子(exon8)有突变,据此位点构建反义表达载体[pGEM3zf(+/-)p53exon8].原位杂交结果显示反义RNA(ASp53exon8'RNA)在细胞质内有阳性杂交信号;于转染后48 h反义RNA封闭效果显著,突变p53蛋白(mt-p53)的表达受抑制,细胞增殖能力下降,G2/M期阻滞.结论 针对p53基因突变位点制备的个体性反义RNA可特异性封闭乳腺癌细胞突变p53基因的表达.
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人鳞状细胞癌细胞株(A431)中NET-1基因对癌细胞增殖和浸润的影响
目的 探讨小分子干扰核酸(siRNA)对皮肤鳞状细胞癌(简称皮肤鳞癌)细胞株(A431)中NET-1基因的抑制作用,及其基因对癌细胞增殖、浸润的影响.方法 构建针对人NET-1基因的siRNA NET-1真核表达载体(pU6H1-GFP-siRNA NET-1),转染A431细胞后通过半定量RT-PCR检测细胞中NET-1 mRNA水平以筛选较有效的siRNA NET-1.同时设置针对NET-1的正、反义真核表达载体和随机序列对照组siRNA表达载体,体外瞬时转染A431细胞,RT-PCR、Western blot分别检测癌细胞内NET-1 mRNA和蛋白的表达,经免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下观察NET-1蛋白在细胞内的表达;四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞仪分别榆测A431细胞增殖与占不同细胞周期中细胞增殖指数(PI);划痕试验和Transwell迁移试验分别检测A431细胞的迁移和侵袭能力.结果 测序证实编码NET-1序列的siRNA已经插入载体pU6H1-GFP中U6和H1两个启动子之间,其他载体测序结果 符合设计要求.pU6H1-GFP载体转染A431细胞后其转染率达到80%.转染siRNA NET-1和反义NET-1后分别与未转染组比较,A431细胞中NET-1 mRNA分别减少72%和62%(t值分别为-36.01,-17.65;均P<0.05)和蛋白表达水平分别减少61%和69%(t值分别为-21.13,-33.14;均P<0.05);在转染48 h后能显著抑制A431细胞的增殖、迁移和浸润(均P<0.05).在转染对照组siRNA后并未见到明显的抑制效果.转染正义NET-1后,能分别增加细胞内52%NET-1 mRNA和49%蛋白表达水平(t值分别为12.49,13.98,均P<0.01).结论 靶向NET-1的siRNA真核表达载体能特异、有效的下调NET-1基因蛋白的表达,并抑制A431细胞增殖、迁移和浸润.进而证明内源性NET-1基因的功能与A431细胞增殖、迁移、浸润有关.靶向NET-1的siRNA显示基因抑制效率比反义核酸技术更好.
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反义Bmi-1 RNA转染对人肺癌细胞株A549体外增殖的影响
目的 研究转染反义Bmi-1 RNA对人肺腺癌细胞A549的体外增殖及细胞周期和凋亡的影响.方法 将表达反义Bmi-1 RNA的真核表达载体稳定转染A549细胞株,GA18筛选挑取阳性克隆.应用即时荧光定量RT-PCR及Western blot检测转染后Bmi-1基因在mRNA水平及蛋白水平的表达;应用MTT比色法及平板克隆形成实验检测A549细胞体外生长能力;用PI单染及Annexin-V-PI双染技术在流式细胞仪上检测细胞周期及凋亡情况.结果 Western blot结果显示转染反义Bmi-1RNA使A549细胞中Bmi-1蛋白表达量减少了95%;MTT检测细胞生长曲线表明反义Bmi-1 RNA使A549细胞生长速度明显减慢;平板克隆形成实验结果显示转染反义Bmi-1 RNA的A549细胞在平板中形成集落的数目(0.67±0.50)明显低于未转染组(73.0±4.1)及转染空质粒组(67.0±4.0,P<0.01);流式细胞仪结果显示反义Bmi-1使A549细胞阻滞在G_0/G_1期,但对细胞凋亡没有影响.结论 反义Bmi-1 RNA在体外对A549细胞增殖有明显的抑制作用,其抑制作用是通过使A549细胞阻滞在G0/G1期实现的.
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转染survivin反义mRNA对Jurkat淋巴瘤细胞生长和化疗敏感性的影响
目的研究转染survivin 反义mRNA对Jurkat淋巴瘤细胞生长的影响以及转染后淋巴瘤细胞对化疗药物的敏感性.方法构建survivin 反义mRNA真核表达质粒pcDNA3.1-反义(As)survivin;利用脂质体转染法将其转入高表达survivin mRNA T淋巴母细胞淋巴瘤Jurkat细胞系,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学SP法、Western印迹法检测细胞中survivin表达;用细胞计数、流式细胞术(FCM)检测其细胞生长曲线、细胞凋亡指数,并进行光镜、电镜形态学观察;并对转染pcDNA3.1-Assurvivin前后Jurkat细胞分别加入4-羟基-环磷酰胺(CTX)、甲氨蝶呤(MTX)72 h后,常规MTT检测细胞存活率.结果 RT-PCR检测转染pcDNA3.1-Assurvivin后48 h、5和6周Jurkat细胞survivin mRNA表达,发现survivin mRNA表达皆低于对照组;转染后survivin蛋白表达也明显降低.转染pcDNA3.1-Assurvivin后Jurkat细胞生长倍增时间(52 h)明显延长;用FCM检测细胞凋亡发现,转染pcDNA3.1-Assurvivin后Jurkat细胞凋亡指数[20.2%(48 h)]明显高于对照组(转染空质粒和未转染组,2.1%和1.3%);5和6周为6.2%和6.8%,明显高于未转染细胞(1.3%和1.0%).光镜、电镜观察见转染细胞出现较多凋亡细胞及一些变性肿胀细胞;MTT检测结果显示Jurkat细胞转染前后,经化疗药物4-羟基-环磷酰胺和甲氨蝶呤作用,转染细胞的抑制率明显大于未转染组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 survivin基因对Jurkat细胞系的生长起着重要的作用,抑制survivin 基因表达在T淋巴母细胞淋巴瘤治疗中可能有重要的意义,该基因似可能作为治疗的靶点.
