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活化的肝星状细胞凋亡及其影响因素研究进展
肝星状细胞(HSCs)的凋亡在肝纤维化中的作用日益受到人们的重视,其凋亡途径是近年学术界研究的热点.激活的HSCs可自发发生凋亡,可通过Fas/FasL途径或其他途径实现.通过诱导激活的HSCs凋亡可能为肝纤维化的防治提供一条新途径.
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丹参注射液对肝星状细胞的毒性及其作用机制
目的探讨丹参注射液体外对肝星状细胞HSC-T6的毒性及其作用机制.方法利用细胞培养技术,苔盼蓝法检测系列丹参溶液对HSC-T6生长的影响,Gimsa染色观察细胞形态,MTT法检测丹参对细胞的生长抑制率,免疫组化检测血小板衍生生长因子(PDGF-BB)表达,生物法检测转化生长因子的表达.
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体外培养HSC作为筛选抗纤药物细胞模型的初步研究
目的:对比观察胆管阻塞性大鼠肝纤维化模型和肝星状细胞Ⅰ型胶原(Co1-I)和金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPl)mRNA表达的改变以及复方861的作用,探讨建立体外培养HSC作为筛选抗纤药物细胞模型的可能性.方法:给雌性Wistar在鼠胆管内逆行性注入硬化剂加胆管结扎,制备胆管阻塞性肝纤维化模型.于术后7天给予复方861灌胃(3g/kg),共49天.以含0.25mg/ml复方861的培养液,培养大鼠肝星状细胞系HSC-T6细胞48h.以RT-PCR法观察大鼠肝组织和HSC-T6细胞Col-I和TIMP1 mRNA表达水平及复方861的影响.结果:胆管阻塞性肝纤维化模型组大鼠肝组织Col-I和TIMPl分别为0.616±0.100、1.691±0.646,明显高于假手术组(分别为0.144±0.071和0.720±0.301,P＜0.05);复方861组Col-I和TIMPI mRNA较模型对照组分别下降61%和49%(P＜0.05).HSC-T6细胞Col-I和TIMP mRNA分别为0.579±0.056、2.0292±0.671,以复方861培养48h后Col-I和TIMPl mRNA分别下降78%和50%(P＜0.05).结论:复方861可抑制胆管阻塞肝纤维化模型和肝星状细胞Col-I和TIMPl mRNA表达,体内外结果具有良好的一致性,提示体外培养HSC可作为筛选抗纤药物的细胞模型.
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螺内酯对肝纤维化大鼠肝星状细胞活化及胶原合成的影响
目的探讨螺内酯对肝纤维化大鼠肝星状细胞活化及胶原合成的影响.方法用CCl4花生油、高脂和低蛋白复合因素制造大鼠肝纤维化模型.90只SD大鼠随机分为三组.对照组18只:单纯花生油皮下注射,正常饮食;模型组42只:40%CCl4花生油0.3ml/100g皮下注射,每周2次,饲以单纯玉米粉并高脂、高胆固醇饮食造模;螺内酯预防组40只:造模的同时予以螺内酯100mg/kg灌胃,1次/d.肝组织HE、VG染色,光镜下观察组织学改变,图像分析仪测量胶原面积;免疫组化法观察螺内酯对肝脏平滑肌动蛋白(α-SMA)表达的影响.结果①光镜下:模型组肝纤维组织增生分级及胶原面积均大于螺内酯组(P＜0.05);②螺内酯组α-SMA在肝组织中的表达较模型组明显减少(P ＜0.05).结论螺内酯可减轻肝组织胶原合成,其机理可能通过抑制肝星状细胞的活化,阻断ECM合成的自分泌放大过程,起到预防肝纤维化的作用.
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亚砷酸钠对人肝星状细胞活化及细胞外基质分泌的影响
目的 探讨不同浓度亚砷酸钠(NaAsO2)暴露对人肝星状细胞活化及主要细胞外基质(ECM)分泌的影响.方法 采用不同浓度NaAsO2(0.0、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0μmol/L)处理体外培养的人肝星状细胞株(Lx-2)24、48、72 h后,采用细胞增殖毒性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞存活率,计算半数抑制浓度(IC50);根据IC50结果,采用0.000、1.875、3.750、7.500、15.000μmol/L NaAsO2处理Lx-2细胞24 h,另以7.500μmol/L NaAsO2处理Lx-2细胞0、12、24、48、72 h,到达处理终点收集细胞沉淀及培养上清.采用Western blot法检测Lx-2细胞活化相关蛋白表达水平,包括α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和转化生长因子-β1(TGF-β1);ELISA法检测培养上清主要用于ECM分泌水平,包括透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(COL-IV)、Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNP).结果 随NaAsO2处理浓度的增加,Lx-2细胞存活率逐渐下降,其中50.0、100.0μmol/L砷暴露组在24、48和72 h时,细胞存活率较0.0μmol/L组均明显降低(P<0.05);处理24、48、72 h的IC50分别为72.75、48.19和29.95μmol/L.肝星状细胞活化相关蛋白检测结果发现,1.875、3.750、7.500、15.000μmol/L NaAsO2处理Lx-2细胞24 h后,α-SMA和TGF-β1蛋白表达水平均高于0.000μmol/L,且在7.500μmol/L剂量组蛋白表达差异大(P<0.05).7.500μmol/L NaAsO2处理Lx-2细胞0、12、24、48、72 h后,α-SMA和TGF-β1蛋白表达水平亦随染毒时间的增加而升高(P<0.05).ECM分泌水平检测显示,1.875、3.750、7.500、15.000μmol/L NaAsO2处理24 h后,HA、LN、COL-Ⅳ和PⅢNP分泌水平均高于0.000μmol/L组(P<0.05).7.500μmol/L NaAsO2处理Lx-2细胞0、12、24、48、72 h后,HA、LN、COL-Ⅳ和PⅢNP分泌水平均高于对照组(P<0.05).结论 NaAsO2可上调肝星状细胞活化相关蛋白表达,诱导其进一步活化,进而增加细胞外基质分泌水平.
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赤芍水提物对肝星状细胞HSC-T6中bax、bcl-2、caspase-3蛋白表达的影响
目的 研究赤芍水提物对肝星状细胞株HSC-T6中bax、bcl-2、caspase-3蛋白表达的影响.方法 采用乙醛造模后的肝星状细胞株HSC-T6细胞作为酒精性肝纤维化的体外研究模型;以赤芍水提物给彼格犬一次性灌胃,取给药后2 h的血清作为实验药物血清;免疫细胞化学法检测肝星状细胞HSC-T6中bax、bcl-2、caspase-3蛋白表达.结果 乙醛造模后的HSC-T6细胞中bcl-2的表达较正常组细胞增加,bax 、caspase-3表达降低;药物血清作用后的肝星状细胞HSC-T6细胞中bcl-2的表达较模型组的HSC-T6细胞显著性降低, bax、caspase-3的表达较模型组细胞显著性增加.结论 赤芍水提物可能是通过影响bax、bcl-2、caspase-3等基因异常表达来实现对HSC-T6的抑制增殖及促凋亡作用的,这可能与一些凋亡相关疾病如酒精性肝纤维化的发生有关.
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扶正理气合剂抗酒精性肝纤维化的实验研究
目的 探讨复方中药扶正理气合剂对洒精性肝纤维化的预防机制和效果.方法 雄性SD大鼠80只,随机分为正常组、模型组、复方丹参组和扶正理气合剂组.以乙醇灌胃诱导大鼠肝纤维化模型,复方丹参组造模同时给予复方丹参灌胃,扶正理气合剂组造模同时给予扶正理气合剂灌胃,共16周.16周后处死大鼠取肝组织标本,光镜观察肝组织的病理变化,放射免疫法测定血清丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性.结果 ①模型组多数正常小叶结构破坏或消失,由汇管区和中央静脉伸出粗大胶原纤维条索分割肝小叶,肝细胞索排列紊乱,肝细胞明显水肿,广泛脂肪变性.纤维隔内有大量淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞等浸润.与模型组比较,两个用药组肝小叶结构破坏明显减轻,肝脏胶原纤维增生亦明显减轻,纤维条索疏松变窄.肝细胞水肿好转,炎细胞浸润减少.②Masson染色胶原纤维面积比较:模型组胶原面积比正常组显著增加(P＜0.05),复方丹参组和扶正理气合剂组胶原面积较模型组均减轻(P＜0.05),扶正理气合剂组与复方丹参组比较无显著差异(P＞0.05).③与模型组比较,复方丹参组、扶正理气合剂组MDA下降(P＜0.01)、SOD升高(P＜0.05).结论 扶正理气合剂抗纤维化作用可能与其抗脂质过氧化作用有关.
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灯盏花乙素对肝星状细胞及 TGF-β1/Smad信号通路的作用评价
目的：观察灯盏花乙素( scutellarin)对肝星状细胞( hepatic stellate cell,HSC)及转化生长因子β1( TGF-β1)/Smad 信号通路的影响,探讨 scutellarin 抗肝纤维化的机制。方法建立TGF-β1诱导的HSC LX-2模型, CCK-8法检测 scutellarin 对细胞增殖的作用,化学发光法检测scutellarin对 Caspase3/7活性的影响,酶联免疫吸附测定( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法检测细胞上清液Ⅰ型前胶原的含量,ELISA法检测细胞Smad2和Smad3磷酸化水平。结果scutellarin能抑制HSC增殖,增强细胞 Caspase3/7活力,抑制Ⅰ型前胶原分泌,降低 LX-2细胞Smad2和Smad3磷酸化水平。结论抑制TGF-β1/Smad信号通路可能是scutellarin抗肝纤维化的作用机制。
关键词： 灯盏花乙素 肝星状细胞 TGF-β1/Smad信号通路 -
一贯煎抑制肝星状细胞活化作用机制的研究
目的 探讨一贯煎对肝星状细胞(HSC-T6)活化的抑制作用.方法 体外培养肝星状细胞,采用转化生长因子-β1(TGF-β1)制备肝星状细胞活化模型,将细胞分为正常组、模型组、阳性组、一贯煎小剂量组和一贯煎大剂量组.采用CCK-8法检测细胞活力,Western Blot技术检测肝星状细胞Ⅰ型胶原(anti-collagen type Ⅰ,COL-Ⅰ)和Ⅲ型胶原(anti-collagen type Ⅲ,COL-Ⅲ)蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期.结果 阳性组、一贯煎小剂量组和一贯煎大剂量组能显著抑制细胞增殖(P＜0.05),能显著降低COL-Ⅰ和COL-Ⅲ蛋白的表达(P＜0.05);阳性组能显著阻滞细胞周期于S期(P＜0.05);一贯煎小剂量组和一贯煎大剂量组能显著阻滞细胞周期于S期和G2/M期(P＜0.05).结论 一贯煎抗肝纤维化的作用机制可能与抑制肝星状细胞活化,减少胶原蛋白合成和阻滞细胞周期有关.
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雄芍汤含药血清对人肝星状细胞增殖和活化的影响
目的:观察雄芍汤对肝星状细胞增殖和活化的影响.方法:实验设4组:空白组、空白血清组、扶王化瘀胶囊血清组、雄芍汤血清组.采用MTT比色法测定雄芍汤含药血清对体外培养的人肝星状细胞LX-2增殖的影响；免疫组织化学染色法检测LX-2中α-SMA、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的含量.结果:20％和10％扶正组和雄芍组对LX-2抑制率均高于相应浓度的空白血清组(P＜0.01),5％扶正组、雄芍组和空白血清组差异不显著；雄芍各个浓度组对LX-2抑制率显著高于相应浓度的扶正组(P＜0.05或P＜0.01).雄芍各组中,20％组和10％组对LX-2的抑制率差异不显著,但均显著高于5％组(P＜0.01).雄芍组和扶正组LX-2中α-SMA的含量显著低于空白血清组(P＜0.01),扶正组α-SMA含量显著低于雄芍组(P＜0.05).雄芍血清组和扶正血清组LX-2中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原含量显著低于空白血清组(P＜0.01),雄芍血清组和扶正血清组Ⅰ型胶原差别不显著,扶正血清组Ⅲ型胶原含量显著低于雄芍血清组(P＜0.05).结论:雄芍汤能够抑制HSC的增殖和活化以及HSC中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的分泌.
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桂莪术提取物对人肝星状细胞的影响
目的：观察桂莪术提取物对肝星状细胞株（HSC-LX2）增殖、胶原生成以及基质金属蛋白酶表达的影响。方法：HSC-LX2培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，用终浓度分别为0、22.5、45、90μmol·L-1的桂莪术提取物处理24 h后，MTT法测定细胞增殖抑制率；LDH比色法检测桂莪术提取物对HSC-LX2的细胞毒性；ELISA法检测HSC-LX2 I型胶原表达的影响；Western Bolt法检测HSC-LX2基质金属蛋白酶-1（MMP-1）蛋白表达。结果：MTT结果显示，22.5、45、90μmol·L-1的桂莪术提取物均能抑制HSC-LX2细胞增殖，呈剂量依赖性，抑制率分别为16.2%，43.9%，59.4%，IC50为59.1μmol·L-1；桂莪术提取物各剂量组培养上清液中LDH活力差异无显著性；45、90μmol·L-1桂莪术提取物可显著降低I型胶原的表达（P<0.01）；Western Blot结果分析显示，45、90μmol·L-1桂莪术提取物可显著提高HSC-LX2 MMP-1蛋白的表达（P<0.05）。结论：桂莪术提取物可能通过抑制HSC-LX2增殖和I型胶原合成，提高MMP-1蛋白表达，发挥抗肝纤维化作用。
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基于 TGF -β1/Smad 信号通路探讨加味茵芍散含药血清对大鼠肝星状细胞增殖作用的影响及机制
目的：基于转化生长因子β1（TGF -β1）/ Smad 通路探讨加味茵芍散含药血清对大鼠肝星状细胞（HSC）增殖的影响。方法选成年雄性 Wistar 大鼠随机分为加味茵芍散组、己酮可可碱组和生理盐水组，分别给予加味茵芍散、己酮可可碱、生理盐水灌胃，喂养1周后，予以腹主动脉采血，制备含药血清。设生理盐水组，己酮可可碱组，空白组，加味茵芍散低、中、高剂量组，含药血清干预HSC - T6后，用 MTT 法检测加味茵芍散对 HSC - T6增殖的影响，并予以 PCR、Western blot 检测 TGF-β1、Smad3 mRNA 和蛋白表达情况。结果加味茵芍散高、中、低剂量组与生理盐水同等稀释倍数组相比较，加味茵芍散含药血清对 HSC 的增殖存在较为明显的抑制作用（P <0.05），在5%~15%的血清稀释倍数范围内，随剂量增大或给药时间的延长而抑制作用增强。加味茵芍散能有效抑制 TGF-β1/ Smad 通路中 TGF -β1、Smad3的 mRNA 和蛋白表达，与空白组和生理盐水组比较差异有统计学意义（P <0.05），且具有量效与时效关系。结论加味茵芍散可抑制 HSC 增殖，其机制可能与下调TGFβ1、Smad3的表达、阻断 TGF -β1/ Smad 信号传导通路有关。
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益气解毒通络颗粒对乙肝肝硬化患者肝星状细胞标记物VEGF和PDGF-AB的影响
目的:探讨益气解毒通络颗粒剂治疗乙肝肝硬化好转的分子机制,完善该方治疗乙肝肝硬化的理论基础.方法:选取2015年6月至2017年10月在北京中医药大学东直门医院,采用简单随机化分组方法,随机选择符合入排标准的体检中心体检健康者15例,肝炎门诊就诊的乙肝肝硬化患者42例.乙肝肝硬化患者均已规范使用抗病毒药恩替卡韦分散片治疗,入组后予益气解毒通络颗粒治疗6个月;对健康者,乙肝肝硬化患者治疗前、治疗6个月后,分别采集血样,待标本集中后采用酶联免疫吸附法成批检测VEGF、PDGF-AB含量.并将测定结果进行统计分析.结果:结果显示,血清VEGF水平乙肝肝硬化患者治疗前较健康者轻度升高,治疗后较治疗前及健康者均有所下降,但组间比较无统计学意义(P>0.05);血清PDGF-AB水平乙肝肝硬化患者治疗前较健康者显著降低(P<0.001),治疗后较治疗前有所升高(P<0.05)但仍低于健康者(P<0.05).结论:VEGF和PDGF-AB水平的变化与乙肝后肝硬化的发病相关,益气解毒通络颗粒能够改善乙肝肝硬化患者血清VEGF和PDGF-AB水平,这可能是其治疗乙肝肝硬化的作用机制之一.
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针刺对四氯化碳致肝纤维化大鼠肝脏中细胞外基质生成的抑制作用
目的:观察针刺治疗对四氯化碳致大鼠实验性肝纤维化的改善作用以及对纤维化肝脏中细胞外基质主要成分表达的影响.方法:将46只大鼠随机分为正常组(10只)、模型组(12只)、非穴组(12只)、穴位组(12只).采用50％ CC14橄榄油溶液腹腔注射进行肝纤维化造模,同时针刺穴位组大鼠的“太冲”“期门”“肝俞”并电针“足三里”进行治疗.非穴组取穴为上述各穴左侧平移0.5cm处.造模和治疗6周后,颈总动脉取血用酶联免疫吸附法检测血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原( PCⅢ)水平；然后处死大鼠,分离肝组织进行病理切片观察；并分离各组大鼠的肝星状细胞,以Western blot法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、α1(Ⅰ)型胶原蛋白[α 1(Ⅰ) collagen]、纤连蛋白(fibronectin)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)的蛋白表达,以Real-time PCR法检测α-SMA、α 1(Ⅰ) collagen和fibronectin的mRNA表达.结果:与正常组相比,模型组大鼠各项肝纤维化血清指标(HA、LN、PCⅢ含量)均明显升高(P＜0.01,P＜0.05)；与模型组相比,穴位组血清HA、LN水平显著下降(P＜0.05),非穴组无明显降低.针刺穴位可以降低肝星状细胞中α-SMA、α 1(Ⅰ) collagen和fibronectin的蛋白与基因表达(P＜0.01,P＜0.05),并上调MMP-9的蛋白表达(P＜0.05),而对TIMP-1无明显影响(P＞0.05).结论:针刺穴位能有效改善四氯化碳导致的大鼠肝纤维化损伤,减少肝星状细胞分泌细胞外基质,从而抑制肝纤维化.
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针刺对四氯化碳致肝纤维化大鼠血小板衍生生长因子信号通路的影响
目的:观察针刺对肝纤维化模型大鼠血小板衍生生长因子(PDGF)信号通路蛋白和mRNA表达的影响,探讨针刺抗肝纤维化的可能机制.方法:将46只SD大鼠分为空白组10只,模型组、非穴组、针刺组,每组12只.采用50％四氯化碳(CCl4)和橄榄油腹腔注射复制肝纤维化模型.针刺“太冲”“期门“肝俞”,电针“足三里”.采用Western blot和Real-time PCR方法检测各组大鼠PDGF信号通路蛋白及其mRNA表达.结果:与空白组相比较,模型组大鼠血清PDGF含量及肝脏PDGF信号通路相关蛋白、mRNA表达明显升高(P＜0.01,P＜0.05)；与模型组相比,针刺组则能够抑制PDGF-β R及其下游细胞外调节蛋白激酶(ERK)蛋白与mRNA的表达(P＜0.01,P＜0.05)；而针刺对Jun细胞核激酶(JNK)、P 38蛋白的表达无明显调节作用(P＞0.05).非穴组与模型组相比,各指标蛋白与mRNA的表达差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:针刺通过抑制CCl4致肝纤维化大鼠的PDGF信号通路,减少胶原沉积,促进细胞外基质的降解,从而起到治疗肝纤维化的作用.
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撤药析方分析五灵胶囊配伍及组方成分抗肝纤维化作用
目的:探讨五灵胶囊(Wuling Capsule,WL)组方成分和撤药组在方中的效应及对全方功效的影响.方法:采用四氯化碳多次注射,饮用10%乙醇溶液并以高脂低蛋白饲料饲养制备小鼠肝纤维化模型,分别给予试验药物治疗10 d,酶法测定各实验组小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、胆碱酯酶(CHE);体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6细胞并采用转化生长因子(TGF-B1)诱导其活化,研究撤药组及组成成分对HSC-T6表达Ras/ERK,TGFβ/Smad信号通路蛋白的影响,Western blot检测α-SMA,Ras,Collagen I,ERK,p-ERK,TβR I,TβRⅡ,Smad2/3蛋白的表达.结果:WL、组成成分和撤药组降低肝纤维化小鼠血清ALT和增加CHE活性,柴胡和灵芝无降ALT作用,各撤药组及组成成分对TGF-β1诱导HSC-T6表达α-SMA,Collagen Ⅰ,ERK,p-ERK,TαR Ⅰ,TαⅡ,Smad2/3蛋白具有差异性生物学效应.结论:组方配伍对WL治疗纤维化小鼠作用产生相加的影响.抑制对TGF-b1诱导HSC-T6表达ERK和TGF-β/Smad信号通路蛋白表达,继而影响HSC-T6转录和合成COL-Ⅰ.
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夏枯草硫酸多糖对CCl4致大鼠肝纤维化及TGF-β1诱导的大鼠肝星状细胞活化的影响
目的:观察夏枯草硫酸多糖(PSSP)对四氯化碳(CCl4)所致的大鼠肝纤维化及转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导活化大鼠肝星状细胞-T6(HSC-T6)的影响,从而初步探讨PSSP抗纤维化的机制.方法:采用CCl4-橄榄油溶液腹腔注射诱导大鼠肝纤维化造模,随机分为5组,分别为正常组,模型组,秋水仙碱组(0.25 mg·kg-1),PSSP高剂量组(300 mg· kg-1)和PSSP低剂量组(100 mg· kg-1).分别测定各组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST),层粘连蛋白(LN),透明质酸(HA),Ⅲ型前胶原(PCⅢ)和Ⅳ胶原(C-Ⅳ)的含量;采用苏木素-伊红(HE)及天狼猩红染色观察大鼠肝组织病理学改变;体外培养HSC-T6细胞;采用细胞增殖与活性法(CCK-8)测定PSSP对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞增殖的影响;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测HSC-T6细胞中Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) mRNA和蛋白的表达.结果:与模型组比较,PSSP可明显降低大鼠ALT,AST,HA,LN,PC-Ⅲ和C-Ⅳ的含量,并减轻大鼠肝纤维化程度(P＜0.01);PSSP可抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的增殖,减少HSC-T6细胞Col-Ⅰ,α-SMA mRNA和蛋白的相对表达量(P＜0.01).结论:PSSP具有很好的抗纤维化作用,其机制可能与抑制肝星状细胞活化及抑制胶原合成与沉积,减少细胞外基质(ECM)的生成并促进其降解有关.
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委陵菜酸对大鼠肝星状细胞的抑制作用及其机制分析
目的:研究委陵菜酸(tormentic acid,TA)对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)活化增殖及转化生长因子-β(TGF-β)/Smads信号通路的影响,探讨其抗纤维化的作用机制.方法:采用细胞活性毒性检测法(CCK-8)观察TA(0,50,60,70,80,90,100 μmol·L-1)作用于HSC-T6细胞24 h时的增殖情况,计算半数抑制率(IC50)并筛选出适浓度.取对数生长期的HSC-T6细胞,分为正常组,刺激组,TA高、中、低剂量(40,20,10μmol·L-1)组.利用姬姆萨染色液检测TA对细胞集落形成;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期的变化;免疫组化法检测Ⅲ型胶原蛋白(Col-Ⅲ)的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Smad4,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达.结果:TA能够抑制HSC-T6细胞的增殖,呈剂量依赖性,IC50为81.71 μmol·L-1;与正常组比较,TA呈剂量依赖性地抑制HSC-T6细胞集落的生成,同时,TA能明显地促进细胞凋亡和将细胞阻滞在G2期(P＜0.05,P＜0.01);此外,还能降低Col-Ⅲ,α-SMA,Smad4蛋白表达(P＜0.05).结论:委陵菜酸对肝星状细胞有明显的抑制作用,其机制可能与促进细胞凋亡、阻滞细胞周期,以及与阻断TGF-β/Smads通路有关.
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化浊解毒方含药血清对H2O2诱导的大鼠肝星状细胞氧化应激的影响
目的:研究化浊解毒方含药血清对H2O2诱导的大鼠肝星状细胞(HSC-T6)氧化应激的影响,以探讨化浊解毒方治疗肝纤维化的可能作用机制.方法:SD大鼠ig化浊解毒方不同剂量(0.3,0.6,1.2 g·kg-1),连续给药10 d,末次给药2h后取血,制备含药血清;常规培养活化的HSC-T6,采用0.1 mmol·L-1的H2O2制造HSC-T6氧化应激的模型,用不同浓度的含药血清进行干预,分为化浊解毒方组(高、中、低剂量组)、干扰素阳性对照组、模型组及空白对照组(不加任何药物的血清).干预72 h,放射免疫法检测细胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),还原性谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量,用RT-PCR及Western blot法检测HSC-T6培养上清液中Ⅰ型胶原(COL Ⅰ)及Ⅲ型胶原(COLⅢ)基因及蛋白表达.结果:与空白对照组比较,经过H2O2处理的HSC-T6上清液中SOD和GSH-Px的活性明显减低(P＜0.05),MDA和GSH的含量明显增加(P＜0.05);经化浊解毒方含药血清干预72 h后,其高、中剂量组能够提高SOD和GSH-Px的活性(P＜0.05),并降低细胞上清液中MDA和GSH的含量(P＜0.05),以高剂量组作用明显(P＜0.05);与空白对照组比较,HSC-T6上清液中COL Ⅰ及COLⅢ基因表达及蛋白含量经过H2O2刺激后明显增加(P＜0.05),经过化浊解毒方干预后,其胶原基因表达及蛋白水平明显降低,尤其高剂量组降低明显(P＜0.05).结论:化浊解毒方可以减轻因H2O2刺激造成的HSC-T6氧化应激反应,减少氧化应激产物产生,其效果与剂量呈正相关;从基因水平,化浊解毒方能够降低胶原基因的表达,同时抑制其蛋白转录,从而降低细胞外胶原含量,达到抑制肝纤维化的目的.
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加味四逆散药物血清对HSC-T6增殖的影响
目的:观察加味四逆散含药血清对瘦素刺激肝星状细胞增殖的影响,探讨其抗肝纤维化的机制.方法:SD大鼠30只,随机分为3组:正常血清组、秋水仙碱对照组、加味四逆散组(37.5 g·kg-1),每组均10只,将正常血清组大鼠每只按10mL·kg-1给予生理盐水ig,1次/日；秋水仙碱对照组大鼠每只按0.2 mg·kg-1给予秋水仙碱ig,1次/日；加味四逆散组给予加味四逆散药液10 mL·kg-1ig,1次/日.以上各组均连续ig7 d,制备各药物含药血清,并将药物血清用培养基配制成5％,10％,20％,40％4个浓度；培养肝星状细胞,取对数生长期细胞,使用噻唑蓝(MTT)比色法检测药物血清对100 mg·L -1的瘦素刺激肝星状细胞-T6( HSC-T6)增殖的影响.结果:加味四逆散药物血清对瘦素刺激的肝星状细胞增殖有抑制作用(P＜0.05或P＜0.01),在5％ ～ 40％的血清浓度范围内,抑制作用呈剂量依赖性关系；秋水仙碱对照组亦能抑制HSC-T6细胞的增殖(P＜0.05),但在10％～40％的血清浓度范围内加味四逆散组对HSC-T6增殖的抑制率显著高于秋水仙碱对照组(P＜0.05).结论:加味四逆散药物血清具有抑制瘦素刺激HSC-T6增殖的作用.
