首页 > 文献资料
-
微小RNA-21反义寡核苷酸对宫颈鳞癌SiHa细胞株细胞生物学特性影响的体内外实验研究
目的 探讨体内外微小RNA-21( miR-21)反义寡核苷酸对宫颈鳞癌SiHa细胞株绌胞生物学特性的影响.方法 miR-21反义寡核苷酸(miR-21-ASO)通过脂质体转染宫颈鳞癌SiHa细胞,即时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR -21表达情况,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、集落形成实验、流式细胞术等方法探讨抑制miR-21表达对SiHa细胞形态及生物学特性改变的影响.应用免疫组织化学MaxVision法、TUNEL( TdT-mediated dUTP nick end labeling)细胞凋亡检测试剂盒检测移植瘤细胞增殖活性和凋亡情况.结果 miR-21在SiHa细胞株中呈显著高表达,miR-21-ASO可使SiHa细胞中miR-21表达量显著降低(P＜0.05).MTT法检测结果显示,转染miR-21 -ASO后SiHa细胞的生长受到明显抑制(P＜0.05).阴性对照组的细胞集落形成率为98.3％±2.0％,miR-21抑制组则为55.6％±1.4％,miR-21抑制组的细胞集落形成率受到明显抑制(P＜0 05).流式细胞术检测显示,阴性对照组和miR-21抑制组的SiHa细胞凋亡率分别为6.7％±1.3％和29.4％±1.7％,miR-21抑制组的细胞凋亡率明显增加(P＜0.05).裸鼠皮下移植瘤成瘤率,miR-21抑制组与阴性对照组的成瘤比例分别为3/8和6/8(P ＜0.05).裸鼠瘤体的Ki-67阳性指数,miR-21抑制组(42％)比阴性对照组(90％)显著下降.荧光TUNEL凋亡检测显示,miR-21抑制组裸鼠肿瘤细胞凋亡明显增多(P＜0.05).结论 miR-21-ASO可有效抑制宫颈鳞癌SiHa细胞中miR-21表达,影响癌细胞增殖活性,促进癌细胞凋亡,体内抑制SiHa细胞裸鼠移植瘤生长促进其凋亡.
-
乳糖化多聚赖氨酸导向反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒的作用
目的研究乳糖化多聚赖氨酸(Gal-PLL)导向反义寡核苷酸对乙型肝炎病毒(HBV)基因表达的特异性抑制作用。方法 根据聚合酶链反应(PCR)产物直接测序结果，在HBV U5样序列区合成了一段16聚硫代磷酸反义寡核苷酸，并将其与肝靶向配体Gal-PLL连接，在2.2.15细胞比较，观察了它们对HBV基因表达的影响。结果 通过测序确定了2.2.15细胞中HBV DNA属于HBV表面抗原ayw1亚型，并将此用于反义寡核苷酸的序列设计；经荧光组化分析表明，Gal-PLL对大鼠肝组织有选择性亲和力；Gal-PLL与DNA形成复合物的佳摩尔比为2∶1；在相同实验条件下，硫代磷酸反义寡核苷酸对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为70%和58%，而Gal-PLL硫代磷酸反义寡核苷酸对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为96%和82%，同时培养上清液和细胞中HBV DNA的含量明显下降，无关序列寡核酸无明显效果，寡核苷酸对细胞未产生毒性。结论 肝靶向配体和反义寡核酸的复合物可以通过无唾液酸糖蛋白受体靶入2.2.15细胞内，并对HBV基因表达和复制产生特异性抑制作用。
-
反义寡聚核苷酸对CVB3蛋白基因表达的抑制作用及量效关系的研究
目的观察病毒基因组5′端非编码区内与翻译起始有关的位点和结构蛋白编码区的特异性反义核酸对病毒蛋白表达的影响及其量效关系.方法应用病毒致细胞病变作用保护实验、空斑形成实验和空斑形成减少实验、Western blot实验等方法,观察特定的反义核酸抑制病毒感染的效果.结果针对IRES位点、AUG区域和VP1区的3条反义核酸Scb561、Scb733、scb2785,对病毒感染有明显的抑制作用.病毒的感染量为0.01 MOI时,3种反义核酸在5μmol/L时对病毒的抑制率均在90%以上,当病毒增加到10 MOI时,抑制率仍在50%以上.Scb561和Scb733可明显的抑制病毒基因表达,当Scb561的浓度在0.625μmol/L时感染后的细胞内病毒蛋白量明显减少,增加到2.5μmol/L时病毒蛋白表达几乎看不到.另外Scb561、Scb733剂量与抗病毒效果呈现正相关关系.随着Scb561和Scb733浓度的增加,其抗病毒活性也随之增加直到抑制率达到90%以上,有效剂量在0.6～5μmol/L之间,且对细胞无毒性作用.非特异寡聚核苷酸对照实验显示,5μmol/L浓度时对病毒感染无明显抑制作用.结论针对核糖体进入位点和翻译起始位点的反义核酸,有明显的特异性抑制病毒基因表达的作用.为反义寡聚核苷酸成为一个潜在的治疗病毒感染的药物提供了重要的研究基础.
-
丁型肝炎病毒核酶反式切割HBV mRNA片段的实验研究
目的探讨反式作用丁型肝炎病毒(HDV)核酶体外切割乙型肝炎病毒(HBV) mRNA片段的可行性.方法将化学合成的核酶cDNA克隆到含有T7启动子的载体PGEM-4Z中.利用体外转录技术转录出核酶及底物,研究其体外切割活性.利用E-H作图法进行核酶的酶促动力学研究.结果在体外实验中显示两酶均能成功的将底物切割,37℃温浴90 min的切割百分率为50%和51%.利用E-H作图法进行的酶促动力学研究中求得Rc1、Rc2的Km值分别为0.61 μmol/L、0.58 μmol/L,Kcat值分别为:0.64*min-1、0.60*min-1.结论反式作用HDV核酶对非HDV底物-HBV mRNA片段的成功切割为寻找新的HBV的反义抑制手段开辟了途径.
-
反义DcR3 RNA转染诱导肝癌细胞凋亡的作用
目的研究DcR3反义mRNA在肝癌细胞凋亡中的作用.方法构建pVAXI-as-DcR3反义表达载体,转染肝癌细胞,Western blot法观察DcR3蛋白合成有无降低,流式细胞术、TUNEL等方法观察凋亡变化.结果 Western blot证实反义重组体可有效阻滞DcR3表达,同时转染了pVAXI-as-DcR3的肝癌细胞凋亡较对照组增多.结论 DcR3反义RNA可使肝癌细胞凋亡增多.
-
涂层支架局部导入c-myc反义核酸防治再狭窄的实验研究
目的:探讨铂-铱合金明胶蛋白涂层支架局部导入c-myc反义寡核苷酸的可行性及对新生内膜的抑制作用.方法:将携带c-myc反义寡核苷酸的国产铂-铱合金明胶蛋白涂层支架置入兔颈动脉(n=16),在术后7、14、30、90 d处死动物行HE和Weigert染色,图像分析测量新生内膜厚度和面积,c-myc蛋白免疫组化染色并与对照组(n=16)进行对比分析.结果:随观察时间延长两组新生内膜面积和平均新生内膜厚度呈持续增加趋势,且不同观察时间点给药组新生内膜面积和平均新生内膜厚度均显著小于对照组(P均＜0.001).c-myc免疫组化染色给药组为弱阳性和阴性,对照组为阳性.14 d时透射电镜观察显示血管平滑肌细胞呈过渡型改变.结论:国产铂-铱合金明胶蛋白涂层支架可携带c-myc反义寡核苷酸于兔颈动脉局部,并抑制新生内膜的形成,提示支架可作为局部给药防治再狭窄的工具.
-
端粒酶活性与膀胱癌T24细胞生长
目的:研究端粒酶逆转录酶基因(hTERT)反义寡核苷酸(ASODN)对膀胱癌T24细胞生长的影响.方法:用脂质体介导技术,将hTERT基因ASODN转染入膀胱癌T24细胞中应用端粒酶PCR-ELISA法检测端粒酶活性变化,MTT法测定细胞生长变化,并用流式细胞术观察其对T24细胞周期的影响.结果:hTERT基因ASODN能显著地抑膀胱癌T24细胞端粒酶活性,癌细胞生长增殖受限,同时抑制具有序列特异性和剂量依赖性,并出现细胞凋亡现象,其凋亡率(15.8%)明显高于SODN 转染组(0)和空白对照组(1.9%,P<0.05).结论:hTERT基因ASODN能特异性抑制膀胱癌T24细胞端粒酶活性和生长,促进其细胞凋亡.
-
Survivin反义RNA/HSP70双基因表达载体的构建及鉴定
目的:构建Survivin 反义RNA/HSP70双基因表达载体,为后期转染肿瘤细胞,抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡以及激发机体有效的特异性抗肿瘤免疫应答提供重要的实验材料.方法:应用RT-PCR从Jurkat细胞中获得Survivin cDNA片段,反向插入pIRES2-DsRed2质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的Survivin 反义RNA表达载体是否成功;应用RT-PCR从HepG2细胞中获得的HSP70 cDNA片段,定向插入到pIRES2-DsRed2质粒载体中;经菌落PCR、酶切和测序鉴定所构建的HSP70表达载体是否正确.结果:经酶切和测序鉴定证明Survivin 反义RNA表达载体已成功构建;经菌落PCR、限制性酶切和测序鉴定证明HSP70表达载体已成功构建.结论:本实验已成功构建了Survivin 反义RNA/HSP70双基因表达载体,为进一步研究提供了实验基础.
-
IL-1β反义RNA在肝癌细胞中对NK细胞固有免疫杀伤的影响
目的:探讨将所获IL-1β反义RNA真核表达载体导入HepG2细胞后,肝癌细胞对NK细胞杀伤敏感性的变化.方法:转染后用RT-PCR法检测反义基因片段的表达,MTT比色法分析NK-92细胞杀伤活性的变化.结果:转染后反义RNA均得到高水平表达,并使NK细胞的杀伤活性提高约15%.结论:IL-1β反义RNA可在一定程度上恢复肝癌细胞对NK细胞的杀伤敏感性.
关键词： 肝肿瘤/免疫学 白细胞介素1/生物合成 白细胞介素1/遗传学 RNA 反义 杀伤细胞 天然 -
hTERT反义寡核苷酸对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及端粒酶活性的影响
目的 研究hTERT基因反义寡核苷酸(ASODN)对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长增殖及端粒酶活性的抑制作用,探讨其在瘢痕疙瘩治疗中的作用.方法 应用ASODN封闭瘢痕疙瘩成纤维细胞hTERT基因的表达,不同浓度不同时间以ASODN作用于体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞,细胞计数和MTT法检测成纤维细胞生长增殖情况,端粒酶PCR-ELISA法检测不同处理浓度和时间成纤维细胞端粒酶活性.结果 ASODN作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞72 h后,成纤维细胞生长受抑,增殖能力减弱,并具有浓度、时间依赖性.端粒酶活性检测显示:ASODN 0.5、1.0和1.5 μmol/L作用组OD450-690值分别为0.612±0.038、0.535±0.027、0.423±0.023,与空白对照组(0.898±0.058)比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；正义寡核苷酸1.0 μmol/L作用组(OD450-690值为0.893±0.042)与空白对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 hTERT基因ASODN能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长增殖,降低成纤维细胞端粒酶活性是其重要作用机制之一.通过抑制端粒酶活性进行抗瘢痕疙瘩治疗可能是一个新途径.
-
反义miR-21对荷人宫颈鳞癌裸鼠移植瘤生长和凋亡的影响
目的 构建荷人宫颈鳞癌裸鼠移植瘤模型,探讨干扰miR-21 表达对移植瘤生长、凋亡的影 响.方法 将人工合成的反义寡核苷酸ASODN(AS-miR-21)转染SiHa 细胞(抑制组),同时设阴性对照组和 空白对照组,对数生长期的SiHa 细胞分别接种于裸鼠皮下,绘制肿瘤生长曲线并计算肿瘤生长率.当肿瘤 体积达0.2 cm3 时采用AS-miR-21 多点瘤周注射,观察其对移植瘤的影响.应用免疫组化技术、荧光TUNEL 检测移植瘤细胞增殖活性和凋亡情况.结果 (1)成功构建人宫颈鳞癌裸鼠皮下移植瘤模型,抑制组、阴性 对照组及空白对照组成瘤率分别为37.5%、75.0%、100.0%,瘤体平均体积为(732.80 ±56.32 ) mm3 、(1228.46 ±78.53)mm3 、(1301.26 ±80.63)mm3,平均生长率为18.32%、30.71%和32.53%,瘤重为(0.73 ± 0.05)g、(1.26 ±0.12)g 和(1.35 ±0.25)g,抑制组与阴性、空白对照组比较差异均有统计学意义(P <0.05); (2)免疫组化显示抑制组裸鼠瘤体Ki67 表达显著下降;荧光TUNEL 凋亡检测显示抑制组裸鼠肿瘤细胞凋亡 率明显增多;(3)注射治疗剂量AS-miR-21 两周后观察肿瘤组织局部坏死严重,胞核裂解、消失,凋亡明显增 加.结论 AS-miR-21 可下调裸鼠人宫颈鳞癌移植瘤中miR-21 的表达,抑制移植瘤生长和促进其凋亡.
-
结缔组织生长因子反义寡核苷酸对胰腺癌细胞基质金属蛋白酶-9、血管内皮生长因子表达及细胞增殖与侵袭的影响
目的 通过研究结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸(ASODN)对人胰腺癌细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、血管内皮生长因子(VEGF)表达及细胞增殖与侵袭力的影响,深入探讨CTGF在胰腺癌发生、发展中的作用机制,为CTGF ASODN在胰腺癌基因治疗中的运用奠定理论基础.方法 经脂质体介导将CTGF ASODN转染人胰腺癌细胞株SW1990,荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测转染细胞CTGF、MMP-9与VEGF mRNA与蛋白表达;噻唑盐(MTT)比色法检测转染细胞的增殖活性;采用Transwell小室检测细胞侵袭能力.结果 (1)荧光显微镜及流式细胞仪检测显示CTGF ASODN可成功转染SW1990细胞.(2)反义组、无义组和单加脂质体组细胞CTGF mRNA表达量分别为0.24±0.09、0.67±0.21、0.63±0.18,反义组较其他组的mRNA表达明显减少(P<0.01);相应的CTGF蛋白表达量分别为0.19±0.07、0.75±0.26、0.71±0.23;相应的MMP-9 mRNA表达量分别为0.21±0.12、0.78±0.35、0.81±0.37;相应的VEGF mRNA表达量分别为0.16±0.06、0.42±0.22、0.43±0.28;相应的MMP-9蛋白表达量分别为0.68±0.22、1.97±0.46、1.92±0.39;相应的VEGF蛋白表达量分别为0.27±0.07、0.52±0.19、0.55±0.18,反义组CTGF、MMP-9和VEGF的表达较其他组显著降低(P<0.01).(3)反义组、无义组、单加脂质体组细胞增殖活性分别为1.67±0.14、2.34±0.17、2.29±0.21,反义组较其他组细胞增殖被显著抑制(P<0.01).(4)反义组、无义组、单加脂质体组微孔滤膜外侧细胞数分别为24.88±6.17、52.37±8.62、55.49±8.83,反义组较其他组微孔滤膜外侧细胞数显著减少(P<0.01).结论 CTGF ASODN转染可有效抑制SW1990细胞CTGF的表达,并降低其MMP-9、VEGF的表达及细胞增殖活性与细胞侵袭力.
-
干细胞生长因子反义寡核苷酸对肝癌细胞中原癌基因蛋白质c-kit及碱性成纤维细胞生长因子表达的影响
目的 探讨干细胞生长因子(SCF)反义寡核苷酸对肝癌HepG2细胞中原癌基因蛋白质c-kit、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响及意义.方法 以脂质体作为转染载体,转染SCF反义寡核苷酸于HepG2细胞.实验分三组:(1)空白对照组;(2)转染SCF反义寡核苷酸组;(3)转染SCF错义寡核苷酸组.Western blot方法检测转染前后肝癌细胞中SCF、bFGF蛋白的表达,RT-PCR检测转染前后肝癌细胞中c-kit与bFGF mRNA的表达,用流式细胞仪检测转染SCF反义寡核苷酸后HepG2细胞凋亡率.结果 与转染错义寡核苷酸组相比,SCF反义寡核苷酸对HepG2细胞中c-kit、bFGF的表达有明显抑制作用,转染SCF反义寡核苷酸可明显增加HepG2细胞凋亡率(P<0.01).结论 SCF在肝癌细胞凋亡中有重要调节作用,SCF/c-kit有可能作为PI3K/Akt信号通路的上游对肝癌细胞bFGF的表达起重要调控作用.
关键词： 肝肿瘤 干细胞因子 寡核苷酸类 反义 原癌基因蛋白质C-kit 成纤维细胞生长因子2 转染 -
缺氧诱导因子-1α反义寡核苷酸对缺氧时视网膜血管内皮细胞增殖活性影响的研究
目的 研究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)反义寡核苷酸(ASODN)对缺氧时体外培养的牛眼视网膜血管内皮细胞(BREC)增殖活性的影响,探讨HIF-1αASODN 治疗视网膜新生血管性疾病的可行性.方法 根据Genbank 提供的HIF-1αcDNA 序列设计HIF-1αASODN,全硫代修饰,并用脂质体包被,体外转染BREC 细胞,荧光显微镜下计算转染效率.采用免疫组织化学法检测HIF-1α的表达,采用免疫组织化学法和生物荧光法分别检测细胞增殖细胞核抗原(PCNA)的表达、细胞内ATP 含量以分析细胞增殖能力.结果 荧光显微镜检测表明,HIF-1αASODN 可成功转染BREC.免疫荧光检测显示,未转染组缺氧开始时HIF-1α有极低表达,在缺氧1 h 时表达量显著上升,4 h 达到高峰,16 h 后下降.而ASODN 转染组HIF-1α的表达始终在极低水平,两组间差异有统计学意义(P ＜0.01).PCNA 免疫组织化学检测和细胞内ATP 含量测定结果显示,在缺氧后各检测点ASODN 转染组较对照组细胞增殖活性受到抑制,抑制作用在缺氧后8 h 为明显(P ＜0.01).结论 HIF-1αASODN 转染能有效抑制BREC 细胞HIF-1α的表达,从而降低细胞增殖活性,可能对视网膜新生血管性疾病有治疗作用.
-
沉默HCCR-2基因对胰腺癌细胞Bcl-2和Bax表达及细胞增殖与凋亡的影响
目的 利用反义寡核苷酸(ASODN)干扰技术探讨人宫颈癌癌基因-2(HCCR-2)对人胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响及其可能的分子机制.方法经脂质体介导将HCCR-2 ASODN转染人胰腺癌细胞株PANC-1,荧光显微镜观察细胞内荧光信号,流式细胞仪检测细胞转染效率及凋亡率;噻唑盐(MTT)比色法检测转染细胞的增殖活性;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测转染细胞HCCR-2、Bcl-2、Bax mRNA与蛋白表达.结果 HCCR-2 ASODN转染PANC-1细胞的转染效率为85.04%.反义组、无义组和单加培养液组细胞凋亡率分别为(24.04±2.38)%、(2.44±0.13)%、(2.54±0.21)%,反义组较其他组细胞凋亡显著增加(P<0.01);相应的各组细胞增殖活性分别为2.38±1.03、3.78±1.69、3.72±1.54,反义组细胞增殖较其他组显著被抑制(P<0.01).反义组、无义组和单加培养液组细胞HCCR-2 mRNA表达量分别为0.29±0.16、0.55±0.31、0.57±0.33;Bcl-2 mRNA表达量分别为0.31±0.14、0.63±0.28、0.62±0.35;Bax mRNA表达量分别为0.68±0.36、0.24±0.09、0.23±0.12;HCCR-2蛋白表达量分别为0.47±0.28、0.93±0.48、0.95±0.42;Bcl-2蛋白表达量分别为0.35±0.19、0.82±0.51、0.81±0.45;Bax蛋白表达量分别为0.91±0.42、0.42±0.21、0.39±0.20,较其他组,反义组细胞HCCR-2、Bcl-2 mRNA及蛋白表达量显著降低(P<0.01),而Bax mRNA及蛋白表达量显著增加(P<0.01).结论 下调PANC-1细胞HCCR-2表达后,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡增加,其作用机制与Bcl-2表达降低而Bax表达升高有关.
-
STAT3反义寡核苷酸对肺腺癌裸鼠移植瘤辐射增敏的研究
目的：探讨STAT3反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide，ASODN）对肺腺癌裸鼠移植瘤辐射增敏的影响，为提高恶性肿瘤的辐射敏感性提供新的思路和方法。方法建立裸鼠体内肺腺癌移植瘤动物模型，待瘤体直径＞0.5 cm后，瘤内多点注射STAT3 ASODN，给药剂量：15 mg/kg，1次/d，连续2周，给药后2 h联合γ射线局部照射总剂量20 Gy，每次2 Gy，每周5次，连续2周，照射剂量率0.75 Gy/min，定期测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；测量肿瘤质量，计算抑瘤率；记录存活情况，估算生存率，绘制生存曲线，计算总生存期；免疫组化检测肿瘤组织细胞内STAT3蛋白表达变化情况；Western Blot 检测肿瘤组织内 P-STAT3、Bcl-xL、CyclinD1蛋白表达情况。结果反义（antisense，AS）＋照射（irradiation，IR）组肿瘤体积治疗第8天开始明显小于其余各组肿瘤体积（P＜0.05）；AS＋IR组的抑瘤率为68.4%，高于IR组与AS组的之和；AS＋IR组的平均总生存期为（28.38±0.96）d，明显高于IR组及无义（nonsense，NS）＋IR组（P＜0.005）；STAT3蛋白及其下游Bcl-xL、CyclinD1蛋白表达变化明显下降， STAT3蛋白磷酸化水平也降低。结论 STAT3反义寡核酸能够增强肺腺癌裸鼠移植瘤的辐射敏感性，具有良好的放疗增敏剂临床应用开发前景。
-
hTERT表达水平对乳腺癌干细胞体外生物学行为的影响
目的：观察人端粒酶反转录酶反义寡核苷酸（hTERT ASODN）对乳腺癌干细胞生物学行为的影响。方法合成针对人端粒酶反转录酶（hTERT）的反义寡核苷酸，以脂质体转染的方法将其转染入乳腺癌干细胞，设为 ASODN 组，以正义序列转染作为阴性对照组，并设未处理对照组。RT-PCR和Western blot分别检测各组hTERT基因和蛋白表达。应用CCK8法检测转染对乳腺癌干细胞增殖的影响，Transwell小室法检测干细胞侵袭、迁移能力。结果 RT-PCR和Western blot检测结果显示，ASODN组hTERT基因相对表达量为0.40±0.03，低于阴性对照组（0.81±0.05）和未处理对照组（0.79±0.04），F＝137.33，P＜0.001；hTERT基因蛋白相对表达量为0.39±0.06，低于阴性对照组（0.87±0.04）和未处理对照组（0.90±0.02），F＝59.29，P＜0.001。CCK8结果显示，乳腺癌干细胞培养12、24、36、48和60 h，ASODN组细胞增殖能力明显低于阴性对照组和未处理对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。Transwell侵袭实验，ASODN组穿越Transwell小室的细胞数为8.40±0.36，低于阴性对照组（15.64±0.13）和未处理对照组（14.31±1.12），F＝94.56，P＜0.001。Transwell迁移实验，ASODN组穿越Transwell小室的细胞数为30.6±8.03，低于阴性对照组（51.40±5.66）和未处理对照组（53.11±6.34），F＝20.11，P＝0.002。结论 hTERT ASODN可显著抑制乳腺癌干细胞体外增殖、侵袭和迁移能力。
-
端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸对乳腺癌细胞生物学特性及干细胞富集的影响
目的：探讨人端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸（hTERT ASODN）对乳腺癌MCF-7细胞系干细胞微球体富集及其生物学特性的影响。方法以人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因编码区为靶点合成反义寡核苷酸，脂质体介导转染，以正义序列转染作为对照。实验分设转染组（ASODN组），正义序列转染的对照组（SODN组）及空白对照组。采用无血清悬浮培养法观察转染对MCF-7干细胞微球体富集的影响。Western blot检测各组干性标记物CD44及ALDH1的表达。RT-PCR检测各组ABCG2、MDR1 mRNA的表达。采用单因素方差分析对各组数据进行统计学处理。结果 ASODN组干细胞微球体生长速率及球体体积明显差于两对照组。与空白对照及SODN组比较，Western blot 检测发现CD44与ALDH1在ASODN组细胞表达降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。RT-PCR 检测发现，在ASODN组细胞ABCG2及MDR1 mRNA的表达量均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。而空白对照组及SODN组两者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 hTERT ASODN在抑制乳腺癌干细胞微球体的富集、降低乳腺癌细胞干性表达及其耐药性方面具有重要作用。
-
Bcl-Xl基因反义寡核苷酸诱导食管癌细胞凋亡的研究
目的探讨Bcl-Xl基因反义寡核苷酸(ASODN)对食管癌细胞株EC9706增殖和凋亡的影响.方法用阳离子脂质体介导bcl-xL基因 ASODN转染EC9706细胞后,采用四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT法)检测EC9706细胞的增殖抑制率;逆转录-聚合酶链反应和蛋白印迹杂交检测Bcl-Xl mRNA和蛋白表达水平;吖啶橙荧光染色和流式细胞术定量检测EC9706细胞的凋亡率.结果 MTT检测显示,Bcl-Xl ASODN可显著抑制EC9706细胞的增殖(P<0.01),而且其对细胞增殖的抑制作用具有剂量依赖性;Bcl-Xl ASODN对Bcl-Xl mRNA表达抑制率为57.29%.用吖啶橙荧光染色法和流式细胞检测ASODN组凋亡率(分别为31.13%±5.75%和30.5%,与细胞对照组、空白对照组及无关序列寡核苷酸组比较,差异均有统计学意义 (均P<0.05).结论 Bcl-Xl基因 ASODN可有效抑制EC9706细胞的增殖,通过ASODN作用可下调Bcl-Xl基因表达,并显著促进EC9706细胞凋亡;Bcl-Xl基因有望成为食管癌基因治疗的新靶点.
-
反义寡脱氧核苷酸对耻垢分枝杆菌抑制作用的研究
目的 研究反义寡脱氧核苷酸对耻垢分枝杆菌牛长的抑制作用,探讨其潜在的抗结核作用.方法 在7H9培养基中接种5×10~5 CFU耻垢分枝杆菌MC~2155,同时加入20μmol/L针对结核分枝杆菌中必须基因Rv3806c在耻垢分枝杆菌中的同源基因MSMEG_6401的反义寡脱氧核苷酸.以耻垢分枝杆菌MC~2155单独培养作为对照.观察和绘制细菌生长曲线;测定细胞膜MSMEG_6401编码的磷酸核糖转移酶的生物活性;应用高压气相色谱测定耻垢分枝杆菌细胞壁中糖的含量.结果 anti-ODNs作用6 d后的耻垢分枝杆菌平均吸光度值(A值)为0.84±0.09;而野生型耻垢分枝杆菌平均,4值为1.27±0.01,试验组耻垢分枝杆菌较对照组增殖速度平均降低0.45(P<0.01);anti-ODNs作用6 d后耻垢分枝杆菌平均CFU计数的对数值为8.27±0.19;而野生型耻垢分枝杆菌平均CFU对数值为8.89±0.14,试验组耻垢分枝杆菌较对照组增殖速度平均降低0.62个log单位;在应用等量的膜蛋白的情况下,实验组磷酸核糖转移酶的生物活性降低约40%;试验组和对照组细菌反映细胞壁糖含量的指标甘露糖-半乳糖/阿拉伯糖比值没有明显差异(2组实验组分别为0.63和0.69;2组对照组分别为0.67和0.69).结论 针对MSMEG_6401的反义寡脱氧核苷酸对耻垢分枝杆菌的增殖有一定程度的抑制作用,推测反义寡脱氧核苷酸技术有一定抗结核价值;结核分枝杆菌的Rv3806c基因或是其编码产物可能是一个好的抗结核药物作用靶位.
