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微管相关蛋白-2在240例活检肺小细胞癌中的诊断价值
目的 探讨微管相关蛋白-2(MAP-2)在肺小细胞癌中的诊断价值.方法 应用免疫组织化学EnVision法检测240例2008至2011年间收集的肺小细胞癌中突触素、嗜铬粒素A(CgA)、CD56、MAP-2及甲状腺转录因子1(TTF-1)的表达.结果 MAP-2在肺小细胞癌中的阳性率为95.8％ (230/240),明显高于突触素、CgA及CD56的阳性率[分别是57.1％ (137/240),38.8％(93/240),89.2％ (214/240)].其敏感性(99.1％)及准确性(95.4％)明显高于突触素(58.3％,42.5％) 、CgA(39.9％,42.5％)及CD56(91.5％,87.9％).结论 MAP-2是敏感性及准确性高的神经内分泌标志抗体,值得在肺小细胞癌诊断中推广应用.
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非小细胞肺癌患者EML4-ALK融合基因检测及其与临床病理特征的关系
目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中EML4-ALK融合基因的存在情况及其与患者临床病理特征的关系.方法 采用特异引物即时荧光PCR法对268例收集于2007年1月至2012年4月间的NSCLC手术切除标本进行EML4-ALK融合基因检测,应用Sanger测序法对其中164例进行验证,并结合临床病理资料分析EML4-ALK融合基因存在情况与患者临床病理特征的关系.结果 在268例NSCLC中,有11例存在EML4-ALK融合基因(4.1％).其中女性EML4-ALK融合基因阳性率(5.9％,5/85)高于男性(3.3％,6/183),两者差异无统计学意义(P=0.503)；年龄≤60岁者的EML4-ALK融合基因阳性率(4.3％,6/140)略高于＞60岁者(4.0％,5/124),两者差异无统计学意义(P=0.918)；非吸烟者的EML4-ALK融合基因阳性率(6.8％,8/118)高于吸烟者(1.6％,2/123),两者差异无统计学意义(P =0.092)；腺癌患者EML4-ALK融合基因阳性率(7.6％,10/132)高于鳞癌患者(1.3％,1/79),两者差异无统计学意义(P=0.094).抽取164例进行Sanger测序验证,其EML4-ALK阳性检出率与即时荧光PCR法结果一致,两种方法的总体符合率为100％.结论 EML4-ALK融合基因在女性、非吸烟、腺癌患者中较为多见,代表了一类新的NSCLC亚型.
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Survivin反义RNA/HSP70双基因表达载体的构建及鉴定
目的:构建Survivin 反义RNA/HSP70双基因表达载体,为后期转染肿瘤细胞,抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡以及激发机体有效的特异性抗肿瘤免疫应答提供重要的实验材料.方法:应用RT-PCR从Jurkat细胞中获得Survivin cDNA片段,反向插入pIRES2-DsRed2质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的Survivin 反义RNA表达载体是否成功;应用RT-PCR从HepG2细胞中获得的HSP70 cDNA片段,定向插入到pIRES2-DsRed2质粒载体中;经菌落PCR、酶切和测序鉴定所构建的HSP70表达载体是否正确.结果:经酶切和测序鉴定证明Survivin 反义RNA表达载体已成功构建;经菌落PCR、限制性酶切和测序鉴定证明HSP70表达载体已成功构建.结论:本实验已成功构建了Survivin 反义RNA/HSP70双基因表达载体,为进一步研究提供了实验基础.
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p27kipl与肿瘤预后
肿瘤的预后与许多因素有关,如分期、组织学分级、淋巴结转移等.随着分子生物学的发展,有关细胞周期调控因子与肿瘤的发生、发展、预后的研究取得了巨大的进步,现作综述如下.
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自噬基因LC3B在肺鳞癌中的表达意义及与窖蛋白-1的关系
目的：探讨自噬标志物--微管相关蛋白轻链3B（MAPLC3B）在人肺鳞癌组织中的表达以及与窖蛋白-1（Cav-1）的关系及它们的临床意义。方法利用量子点免疫荧光组织化学技术检测LC3B和Cav-1蛋白在肺鳞癌组织芯片包括100例肺鳞癌组织和20例非癌性肺组织上的表达；同时在20例肺鳞癌和20例非癌性肺组织中利用定量实时PCR法检测LC3B和Cav-1 mRNA的变化。结果与非癌变肺组织相比，LC3B和Cav-1蛋白和mRNA在肺鳞癌组织的表达均显著降低（P＜0.01）。LC3B 蛋白阳性表达与男性肺鳞癌患者显著相关，与淋巴结转移相关，但差异无显著性（P＞0.05）。肿瘤细胞Cav-1蛋白阳性表达在肺鳞癌TNM分期（P＝0.009）和淋巴结有无转移（P＝0.027）之间的差异均有显著性，而与其他临床病理参数均无关（P＞0.05）。基质Cav-1阳性率仅为10.12%（8/79），与肺鳞癌临床病理参数均无关（P＞0.05）。LC3B和Cav-1蛋白在肺鳞癌肿瘤细胞的表达呈显著正相关（P＝0.001，r＝0.473）。结论自噬基因 LC3B 和 Cav-1的缺失表达可能与肺鳞癌的发生有关，但二者共同阳性表达又可协同促进肿瘤的恶性进展。
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去泛素化酶UCH-L3和自噬基因LC3Ⅱ在急性髓细胞白血病诊断中的临床应用研究
目的 探讨自噬和UCH-L3在急性髓细胞白血病发生发展过程中的作用机制和相互关系,为白血病的诊断及治疗提供新的靶点和策略.方法 选取2014至2015年大连医科大学附属第一医院收治的84例AML患者(男47例,女37例)及健康体检对照组25名(男13名,女12名).AML初发组40例(男24例,女16例),中位年龄54岁(23～85岁);缓解组30例(男14例,女16例),中位年龄45岁(22～74岁);难治组14例(男9例,女5例),中位年龄50岁(18～80岁),其中M1型3例、M2型42例、M3型18例、M4型3例及M5型18例.HL-60细胞采用Real Time PCR及Western Blot法检测TCID处理前后UCH-L3和LC3II的表达变化.AML患者及对照组采用Real Time PCR方法检测外周血单个核细胞UCH-L3和LC3II基因mRNA的表达情况;比较其在初发组、缓解组、难治组及对照组间表达情况;分析AML不同型别之间UCH-L3和LC3II的表达水平;比较AML初发组LC3Ⅱ基因表达的高低与临床特征、临床分期、实验室检查结果及治疗效果的关系.追踪同一患者治疗前后UCH-L3及LC3ⅡmRNA的表达变化.计量资料用t检验,率的比较用χ2检验;相关性分析采用秩相关检验;不符合正态分布的数据用非参数检验.结果 TCID处理HL-60细胞后,UCH-L3及LC3 II在基因和蛋白水平上与未处理组相比表达均下调,差异有统计学意义(t=-29.435及-8.105,P均<0.05);AML初发组的UCH-L3表达量较健康对照组下调,差异有统计学意义(Z=-3.87,P<0.05);AML缓解组UCH-L3表达量与初发组和难治组相比均高表达,差异有统计学意义(Z分别为-6.70和-4.09,P均<0.05);AML初发组LC3Ⅱ的表达量与健康对照组,缓解组和难治组相比均高表达,差异有统计学意义(Z分别为-6.96、-5.32和-3.52,P均<0.05);LC3Ⅱ高表达组患者细胞遗传学异常更为常见(χ2=6.510,P<0.05);同一患者治疗前后UCH-L3及LC3Ⅱ的相对表达量均有显著差异(t=5.315及-7.353,P均<0.05),经化疗缓解后UCH-L3的表达量较初发治疗前上调,而LC3Ⅱ的表达量下调;初发与缓解组的AML患者各型别间UCH-L3及LC3Ⅱ的相对表达量无差异(F分别为0.014及0.143,P均>0.05).结论 UCH-L3和自噬可以通过相互协同作用而调控AML的发生发展.
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自噬相关基因在小鼠急性胰腺炎中的表达及其意义
目的 检测小鼠急性胰腺炎(AP)胰腺组织中自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62和溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)的表达,并探讨其意义.方法 20只小鼠随机分为AP组和对照组.采用腹腔内注射20％L-精氨酸溶液(4 g/kg体重)2次、间隔1h的方法制备AP模型;对照组腹腔注射等容积生理盐水.24 h后观察两组小鼠胰腺组织的病理改变,采用蛋白质印迹法检测小鼠胰腺组织LC3、p62和LAMP-2蛋白的表达.结果 对照组小鼠胰腺组织未见明显病理改变;AP组小鼠胰腺腺泡水肿,腺泡结构破坏、消失,叶间隔、小叶间隔及腺泡间隔显著增宽,腺泡细胞呈不同程度变性坏死.AP组胰腺组织水肿、出血、坏死和炎症评分分别为(3.13±0.50)、(2.83 ±0.32)、(3.25±0.46)、(3.16±0.47)分,对照组的4项评分均为0分,差异均有统计学意义(P值均＜0.01).AP组胰腺组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及p62、LAMP-2蛋白表达量分别为1.16 ±0.08、0.94 ±0.04、0.35 ±0.04;对照组分别为0.24±0.02、0.34±0.03、0.95±0.03.AP组胰腺组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、p62蛋白表达显著高于对照组,LAMP-2蛋白表达显著低于对照组,差异均有统计学意义(P值均＜0.01).结论 腹腔注射L-精氨酸诱导AP后小鼠胰腺组织出现自噬受损,这可能与AP时胰腺组织LAMP-2蛋白表达下降有关.
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P62通过调控自噬与抗氧化通路保护大鼠脑缺血再灌注损伤
目的 探讨大鼠脑缺血再灌注后P62介导的微管结合蛋白轻链3(LC3)和Kelch样ECH相关蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)表达的变化.方法 将80只SD大鼠随机分为假手术组和模型组(采用线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型),每组40只,分别于12h,1、2和3d取材,每个时间点10只.采用化学荧光法测定脑组织活性氧水平,透射电子显微镜观察神经细胞中自噬及凋亡形态结构变化,分别采用qRT-PCR和Westernblot法观察P62和LC3和Keap1 mRNA和蛋白在缺血半暗带表达变化.结果 与假手术组比较,模型组大鼠各时间点脑组织中活性氧水平显著升高,1d时达峰值[(238.23±25.51)％ vs(134.60±12.48)％,P＜0.01];透射电子显微镜下,模型组大鼠神经细胞线粒体肿胀,可见不同程度自噬小体形成,细胞发生迟发性神经元死亡.与假手术组比较,模型组各时间点P62 mRNA和蛋白表达明显下调,1d达低值(1.915±0.711 vs1.253±0.679;0.10±0.02vs 0.16±0.04,P＜0.01);各时间点LC3、Keap1 mRNA和蛋白表达显著升高,1d达到高值(0.862±0.501 vs 1.450±0.245,1.125±0.421 vs 2.037±0.730;1.25±0.17 vs 0.36±0.07,1.35±0.14 vs 0.24±0.05,P＜0.05,P＜0.01).结论 大鼠脑缺血再灌注损伤后LC3和Keap1表达水平增加,而P62表达减少,诱导了细胞自噬和氧化应激的发生.
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NEP1-40对局灶性脑缺血大鼠生长相关蛋白43和微管相关蛋白2表达的影响
目的 观察局灶性脑缺血大鼠生长相关蛋白43(GAP-43)和微管相关蛋白2(MAP-2)的表达变化,及轴突生长抑制因子A(NogoA)拮抗剂NEP1-40给药后对其表达的影响,探讨NogoA抑制神经再生的可能机制.方法 雄性SD大鼠48只,随机分为3组:假手术组、模型组和给药组,每组16只,采用线栓法建立大脑中动脉闭塞模型,给药组于脑缺血术后1d给予NEP1-40溶液侧脑室注射.术后1、3、7和14 d用免疫组织化学法检测缺血侧纹状体区域GAP-43和MAP-2的表达变化.结果 脑缺血后缺血侧纹状体区域,在模型组和给药组脑缺血后1、3和7d GAP-43阳性表达的吸光度值逐步增高,14 d GAP-43表达有所下降,但均明显高于假手术组.给药组1、3、7和14 d GAP-43阳性表达的吸光度值均明显高于模型组(0.19±0.18 vs 0.17±0.23,0.24±0.10 vs 0.21±0.04,0.30±0.21 vs 0.25±0.06和0.26±0.23 vs 0.23±0.08,P＜0.05).模型组和给药组各时间点MAP-2阳性表达的吸光度值逐渐升高,但均明显低于假手术组.给药组各时间点MAP-2阳性表达的吸光度值均明显高于模型组.结论 抑制NogoA后可以通过增加缺血区GAP-43和MAP-2的表达,促进神经修复,这可能是NogoA抑制神经再生的机制.
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间歇低氧对大鼠海马神经细胞自噬相关蛋白表达的影响
目的：通过模拟阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的发病特征，建立大鼠间歇性低氧（IH ）模型，观察IH后大鼠海马CA1区神经细胞线粒体自噬及相关蛋白的表达。方法72只雄性Wistar大鼠随机分为对照组36只和间歇低氧（5％ IH ）组36只，对照组向低氧箱内持续注入压缩空气，5％ IH组每天放入低氧箱内IH暴露7 h ，模型完成后分别于1、3、5、7、10和14 d采用透射电镜观察大鼠海马CA1区神经细胞线粒体超微结构的改变；免疫组织化学法检测Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3（LC3）的表达。结果与对照组比较，5％ IH组3 d开始出现线粒体超微结构的明显改变，可见线粒体自噬体形成；1、3、5、10和14 d Beclin-1及LC3蛋白表达均明显升高（P＜0．05），于10 d达高峰（P＜0.05），14 d开始下降，差异有统计学意义（P＜0．05）。结论 IH早期可诱导大鼠海马神经细胞线粒体发生自噬及自噬相关蛋白Beclin-1和LC3的表达。
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滋养细胞自噬在子痫前期发病中的作用及其分子机制
目的 探讨子痫前期(PE)患者胎盘滋养细胞自噬的发生规律及其可能的分子机制.方法 2011年11月至2012年4月在南京妇幼保健院收集20例PE患者(PE组)及20例正常妊娠妇女(对照组)的胎盘组织,透射电镜观察滋养细胞自噬体的形成情况；蛋白印迹法和实时荧光定量PCR技术检测胎盘组织中自噬相关基因Atg4B、微管相关蛋白l轻链3(LC3)Ⅱ、Ⅰ蛋白和mRNA的表达变化.结果 与对照组孕妇相比,PE组孕妇胎盘组织在透射电镜下见滋养细胞胞质中典型的自噬体形成.蛋白印迹法和实时荧光定量PCR技术检测结果显示,PE组患者胎盘组织中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值(1.43±0.23)高于对照组(0.59 ±0.12),两组比较,差异有统计学意义(P ＜0.05)；Atg4B蛋白的相对表达量(0.71±0.13)高于对照组(0.33±0.07),两组比较,差异也有统计学意义(P ＜0.05)；PE组Atg4B mRNA的表达水平上调,为对照组的(1.73±0.16)倍,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PE患者滋养细胞白噬活性的增高,可能参与了PE的发生发展.
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survivin反义RNA对卵巢癌细胞株SKOV3生长的抑制作用
目的观察survivin反义RNA对卵巢癌细胞株SKOV3的生长抑制作用及其对裸鼠皮下种植瘤成瘤能力的影响.方法构建能在真核细胞中稳定表达survivin反义RNA的载体pcDNA3-SVVas,应用基因重组技术,将pcDNA3-SVVas经脂质体lipofectamine 2000介导转染卵巢癌细胞株SKOV3(SKOV3/SVVas),同时以空载体pcDNA3转染SKOV3细胞(SKOV3/neo)作为对照;绘制细胞生长曲线,采用免疫组化、RT-PCR和流式细胞仪检测SKOV3/SVVas、SKOV3/neo和SKOV3细胞survivin mRNA及蛋白的表达和细胞凋亡率.将24只裸鼠随机分为3组,每组8只,分别将SKOV3/SVVas、SKOV3/neo、SKOV3细胞接种于裸鼠皮下,观察成瘤情况及肿瘤体积变化.结果与SKOV3细胞比较,SKOV3/SVVas细胞增殖能力明显降低;SKOV3/SVVas细胞survivin蛋白阳性细胞率及survivin mRNA表达量分别为(37.5±1.0)%、0.407±0.022,与SKOV3细胞的(81.2±0.4)%、0.793±0.042和SKOV3/neo细胞的(80.4±0.8)%、0.734±0.039比较,差异均有统计学意义(P<0.01);SKOV3/SVVas细胞凋亡率显著增加,为(27.4±9.6)%,与SKOV3和SKOV3/neo细胞比较,差异有统计学意义(P<0.05).SKOV3/SVVas组裸鼠成瘤率降低,出现目检可见肿瘤的平均时间延长为(14.0±1.0)d,与SKOV3/neo组的(6.1±0.8)d和SKOV3组的(5.8±0.9)d比较,差异有统计学意义(P<0.01);与SKOV3、SKOV3/neo组比较,SKOV3/SVVas组裸鼠肿瘤生长速度缓慢,肿瘤体积的差异均有统计学意义(P<0.01).结论稳定表达的survivin反义RNA能够有效抑制SKOV3细胞生长,降低survivin的表达,诱导SKOV3细胞凋亡;转染survivin反义RNA的SKOV3/SVVas细胞在裸鼠皮下的成瘤能力降低.
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子宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16 E6 mRNA表达与survivin蛋白表达的相关性
目的探讨宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒(HPV) 16E6 mRNA表达与survivin蛋白表达的相关性.方法采用半定量PCR技术和免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法,检测慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌共148例患者宫颈组织中HPV16E6 mRNA及survivin蛋白的表达.结果 148例患者中,HPV16阳性共37例,其中慢性宫颈炎5例、CINⅠ6例、CINⅡ～Ⅲ11例及宫颈癌15例.慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ及宫颈癌组织中,HPV16E6 mRNA的表达水平分别为0.3±0.4、0.6±0.4、1.8±0.6及2.4±0.6;survivin蛋白阳性表达率分别为7%、31%、63%及84%.CINⅡ～Ⅲ及宫颈癌组织中,HPV16 E6 mRNA的表达水平及survivin蛋白阳性表达率均显著高于慢性宫颈炎及CINⅠ组织,两者比较,差异均有统计学意义(P<0.01).宫颈癌组织中, HPV16 E6 mRNA的表达水平与survivin蛋白阳性表达率呈显著正相关关系(γs =0.62,P<0.05).结论HPV16 E6 mRNA的表达水平与宫颈病变的进展有关,survivin蛋白阳性表达率升高可能与宫颈癌的发生、发展密切相关.
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卵巢癌细胞系CAOV3体外化疗后survivin mRNA表达的变化
目的探讨卵巢癌细胞系CAOV3体外化疗后survivin mRNA 表达的变化.方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度(分别为2000、200、20、2、0.2 mg/L)紫杉醇或卡铂对CAOV3细胞体外生长的抑制作用.应用RT-PCR技术检测高浓度紫杉醇或卡铂(分别为200 、500 mg/L)处理1 d,低浓度紫杉醇或卡铂(分别为20 、50 mg/L)处理1、3、5 d后存活的卵巢癌细胞中survivin mRNA的表达水平,同时利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果不同浓度(分别为2000、200、20、2、0.2 mg/L)紫杉醇或卡铂作用后CAOV3细胞的抑制率分别为94%、88%、34%、22%、13%或97%、46%、14%、9%、7%,随着药物浓度的下降,细胞受抑制程度明显减弱(P＜0.05).低浓度紫杉醇处理1、3、5 d后CAOV3细胞的凋亡率分别为15%、23%和29%;高浓度紫杉醇处理1 d后CAOV3细胞的凋亡率为43%.低浓度卡铂处理1、3、5 d后CAOV3细胞的凋亡率分别为14%、22%和26%;高浓度卡铂处理1 d后CAOV3细胞的凋亡率为19%.紫杉醇或卡铂低浓度处理3 d及高浓度处理1 d后存活的卵巢癌细胞中survivin mRNA的表达量均明显高于未加药的对照(P<0.01),尤其是紫杉醇处理后存活的卵巢癌细胞中survivin mRNA的表达量增加更为明显(P<0.01).结论survivin基因可能在卵巢癌细胞系CAOV3体外化疗中起抑制作用.
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短发夹状RNA对卵巢癌细胞survivin mRNA表达及紫杉醇药物敏感性的影响
目的观察表达短发夹状RNA(shRNA)的mU6/survivin质粒转染卵巢癌细胞株OVCAR3细胞后,对OVCAR3细胞survivin mRNA表达的抑制作用,以及对OVCAR3细胞紫杉醇药物敏感性的影响.方法将表达绿色荧光蛋白的pEGFPC2质粒与脂质体按不同比例转染OVCAR3细胞,流式细胞仪检测其转染效率.根据转染效率高时pEGFPC2质粒与脂质体的比例,将mU6/survivin质粒转染入OVCAR3细胞.实验分为3组:未转染组、脂质体组、转染组,RT-PCR技术检测3组OVCAR3细胞中survivin mRNA的表达,流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡率的变化.四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测3组OVCAR3细胞对紫杉醇的50%抑制浓度(IC50).结果 pEGFPC2质粒与脂质体按1∶ 2比例转染OVCAR3细胞时其转染效率高,达23.6%.将mU6/survivin质粒与脂质体也按1∶ 2比例转染OVCAR3细胞24 h后,未转染组、脂质体组、转染组细胞survivin mRNA的相对含量分别为0.81±0.05、0.79±0.12、0.26±0.04,转染组survivin mRNA相对含量下降至未转染组的32%,两组比较,差异有统计学意义(P<0.01).转染组转染24 h后,细胞凋亡率为(31.9±1.2)%,明显高于未转染组的(4.9±0.7)%和脂质体组的(5.6±0.5)%(P=0.000);转染组细胞周期被阻滞于G0/G1期,G2/M期减少,分别与未转染组比较,差异有统计学意义(P<0.01).MTT比色法检测结果显示,未转染组、脂质体组、转染组OVCAR3细胞对紫杉醇的IC50分别为(0.305±0.032)、(0.157±0.031)、(0.019±0.001)μmol/L,转染组OVCAR3细胞对紫杉醇的IC50降低为未转染组的1/16,两组比较,差异有统计学意义(P=0.000).结论 shRNA可有效抑制卵巢癌细胞survivin mRNA的表达,并显著提高了卵巢癌细胞对紫杉醇的药物敏感性.
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RNA干扰技术沉默survivin基因逆转卵巢癌细胞株SKOV3/ADM耐药性的研究
目的检测survivin基因在卵巢上皮性癌(卵巢癌)耐药细胞株SKOV3/ADM及其亲本细胞株SKOV3中的表达水平,探讨以survivin基因为靶向的RNA干扰(RNAi)能否有效沉默survivin基因在SKOV3/ADM细胞中的表达,并能否有效逆转SKOV3/ADM细胞对化疗药物的耐药性.方法半定量RT-PCR、免疫荧光法检测survivin mRNA、蛋白在SKOV3/ADM及SKOV3细胞中的表达.以survivin基因为靶向的重组质粒pshRNA-survivin及紫杉醇作用于SKOV3/ADM细胞,将SKOV3/ADM细胞分为4组,即对照组、RNAi组、紫杉醇组、RNAi+紫杉醇组,RT-PCR技术检测各组细胞的survivin mRNA表达水平,吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)荧光染色法及末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法(TUNEL)检测各组细胞的凋亡情况.结果 survivin mRNA在SKOV3/ADM、SKOV3细胞中的表达水平分别为99.1%、75.3%,SKOV3/ADM、SKOV3细胞的荧光细胞数分别为(59±5)、(42±3)个,两种细胞间比较,差异均有统计学意义(P<0.05).RNAi后SKOV3/ADM细胞中 mRNA的表达水平由99.1%降低至7.9%.AO/EB荧光染色法、TUNEL法检测各组细胞凋亡数,紫杉醇组为(10.2±1.0)、(9.8±0.8)个,RNAi组为(48.5±4.9)、(49.5±4.3)个,RNAi+紫杉醇组为(71.5±6.8)、(68.3±5.7)个,RNAi+紫杉醇组与RNAi组比较,差异有统计学意义(P<0.05),RNAi+紫杉醇组与紫杉醇组比较,差异也有统计学意义(P<0.05).结论 survivin基因在SKOV3/ADM细胞中的表达显著高于SKOV3细胞.以survivin基因为靶向的RNAi可有效抑制SKOV3/ADM细胞中survivin基因的表达,有效增加了SKOV3/ADM细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性,显著上调了SKOV3/ADM细胞的凋亡活性.
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RNA干扰技术阻抑survivin基因表达对子宫颈癌细胞放射和化疗敏感性的影响
目的 探讨利用RNA干扰(RNAi)技术阻抑survivin基因的表达,对宫颈癌HeLa细胞放射敏感性和化疗敏感性的影响.方法 通过脂质体介导,将含survivin基因小分子干扰RNA的重组真核表达质粒pSilencer2.1-s2、阴性对照质粒pSilencer2.1-NC和空载质粒pSilencer2.1-U6 neo转染宫颈癌细胞系HeLa,获得HeLa-s2、HeLa-NC和HeLa-U6 neo细胞,同时设未转染的HeLa细胞为阴性对照.RT-PCR技术、蛋白印迹法分别检测survivin mRNA和蛋白的表达水平,并计算survivin mRNA和蛋白表达抑制率;激酶活性检测法测定波长在405 nm处的吸光度(A405)值,表示半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性;流式细胞仪检测细胞凋亡率;平板克隆形成实验观察细胞的放射敏感性变化,以克隆形成率表示;四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞存活率并计算顺铂的50%抑制浓度(IC50).结果 与HeLa-NC、HeLa-U6 neo及未转染的HeLa细胞比较,HeLa-s2细胞survivin mRNA和蛋白表达水平明显下降,survivin mRNA和蛋白表达抑制率分别为(62.8±0.3)%和(60.1±0.5)%.HeLa-s2细胞的A405值为1.261±0.043,未转染的HeLa细胞的A405值为0.314±0.012,两者比较,差异有统计学意义(P＜0.05).HeLa-s2与未转染的HeLa细胞相比,细胞凋亡率明显升高(P＜0.05),分别为(29.23±1.41)%和(2.74±0.32)%.不同照射剂量下,HeLa-s2与未转染的HeLa细胞分别比较,克隆形成率均明显降低(P＜0.05).在同一顺铂浓度下,HeLa-s2与未转染的HeLa细胞比较,细胞存活率显著降低(P＜0.05),HeLa-s2细胞对顺铂的IC50值较未转染的HeLa细胞下降显著(P＜0.05),分别为(0.873±0.021)和(9.212±0.033)μg/ml.结论 利用RNAi技术可阻抑HeLa细胞中survivin基因的表达,增强caspase-3活性,诱导细胞凋亡,显著提高细胞的放射敏感性和对顺铂的化疗敏感性.
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转录因子c-Jun对甲氨蝶呤耐药绒毛膜癌细胞内自噬标志蛋白LC3的调节作用
目的：初步探讨转录因子c-Jun对甲氨蝶呤耐药绒毛膜癌细胞内自噬标志蛋白--微管相关蛋白1轻链3（LC3）的调节作用。方法以人绒毛膜癌细胞株JEG-3及前期构建的甲氨蝶呤耐药绒毛膜癌细胞株JEG-3/MTXR为研究对象，采用蛋白印迹法检测甲氨蝶呤药物处理后细胞内磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）和磷酸化c-Jun（p-c-Jun）的表达变化，以及JNK抑制剂SP600125对p-c-Jun蛋白表达的影响。RNA干扰技术沉默c-Jun基因检测甲氨蝶呤处理后JEG-3/MTXR细胞内LC3 mRNA和蛋白的表达。染色质免疫共沉淀（ChIP）法结合实时荧光定量PCR技术测定甲氨蝶呤药物作用后JEG-3/MTXR细胞内c-Jun蛋白结合于LC3启动子上的相对富集量。结果（1）甲氨蝶呤作用后JEG-3/MTXR细胞内p-JNK和p-c-Jun蛋白的相对表达量呈时间依赖性上调，作用72 h时相对表达量分别为1.16±0.18、1.99±0.20，较0 h升高（分别为0.41±0.05、0.20±0.06），分别比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；SP600125抑制了甲氨蝶呤作用后JEG/MTXR细胞内p-c-Jun蛋白表达的上调，甲氨蝶呤作用后JEG/MTXR细胞内p-c-Jun蛋白的相对表达量为1.11±0.20，高于SP600125联合甲氨蝶呤者（0.30±0.04），两者比较，差异有统计学意义（P<0.05）。（2）针对c-Jun基因的小分子干扰RNA （siRNA）--c-Jun-siRNA抑制了甲氨蝶呤诱导的JEG/MTXR细胞内LC3 mRNA和蛋白表达的上调，甲氨蝶呤联合c-Jun-siRNA作用后JEG-3/MTXR细胞内LC3 mRNA和蛋白的相对表达量分别为1.24±0.17、0.52±0.07，低于甲氨蝶呤联合无义siRNA者（分别为3.03±0.43、1.20±0.15），分别比较，差异有统计学意义（P<0.05）。（3）甲氨蝶呤作用后JEG/MTXR细胞内c-Jun结合于LC3启动子的相对富集量是无甲氨蝶呤作用者的（2.95±0.35）倍。结论转录因子c-Jun对LC3的调节作用可能参与绒毛膜癌发生甲氨蝶呤耐药的机制。
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survivin反义寡核苷酸对K562细胞诱导分化的研究
目的采用反义寡核苷酸技术研究survivin与白血病细胞K562分化的关系.方法实验分为反义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组、脂质体组、空白对照组,转染后48 h观察细胞形态及超微结构的变化;转染后24、48 h分别进行联苯胺染色、过氧化物酶染色及硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验检测细胞功能;流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD33的表达;免疫组织化学方法检测survivin蛋白水平.结果反义寡核苷酸作用后,K562细胞出现向成熟红系及粒系分化的形态学及超微结构的改变,联苯胺染色阳性率、过氧化物酶染色阳性率、NBT还原实验阳性率均高于无义寡核苷酸组、脂质体组及空白对照组(P＜0.01);细胞表面分化抗原CD33的平均荧光强度在反义寡核苷酸组降低(P＜0.01);反义寡核苷酸作用24 h后细胞内survivin蛋白的表达水平低于空白对照组(P＜0.05),但与无义寡核苷酸组、脂质体组比较差异无统计学意义(P＞0.05),而48 h后survivin蛋白表达水平进一步降低,与其他各组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 survivin反义寡核苷酸能诱导K562细胞向成熟红系及粒系方向分化.
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抗凋亡蛋白表达与晚期乳腺癌紫杉醇化疗敏感性的关系
目的:探讨抗凋亡蛋白Survivin在乳腺癌组织中的表达及其与晚期乳腺癌紫杉醇化疗敏感性的关系.方法:应用免疫组化方法,对40例应用紫杉醇化疗的乳腺癌患者癌组织中Survivin表达水平进行检测,分析其与紫杉醇化疗敏感性的关系.结果:乳腺癌患者Survivin表达阳性率为60.0%(24/40);紫杉醇化疗后,有效组(CR+PR)患者Survivin阳性率为40.9%(9/22),无效组(NC+PD)患者Survivin阳性率为83.3%(15/18),两者之间差异有统计学意义,x2=7.424,P=0.006.结论:Survivin表达水平与乳腺癌对紫杉醇化疗敏感性呈负相关,Survivin可能作为一项筛选乳腺癌化疗药物、指导制定合理治疗方案的新指标.
