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血清S100BB蛋白水平与肺癌脑转移的相关性
目的 分析探讨血清S100BB蛋白在肺癌脑转移中的表达情况及其临床意义.方法 用ELISA法测定43例肺癌脑转移患者(脑转移瘤1 cm以下组12例,1～2 cm组9例,2 cm以上组17例,5例未知脑转移瘤大小)、44例肺癌患者、45例肺炎患者及44名健康人血清S100BB蛋白水平,并分析血清S100BB蛋白与肺癌脑转移的相关性.结果 肺癌脑转移组血清S100BB蛋白水平为42.28(38.56～121.70)ng/L,显著高于肺癌组的34.09(27.38～43.89)ng/L、肺炎组的31.11(26.79～37.15)ng/L和健康对照组的30.97(7.27～35.84)ng/L,组间比较,差异均有统计学意义(U值分别为422.5、325.5和237.5,P均<0.01).血清S100BB诊断肺癌脑转的ROC曲线AUC为0.828,当以37.15 ng/L为临界值时,其敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为83.7%(36/43)、74.4%(99/133)、51.4%(36/70)、93.4%(99/106)、76.7%(135/176).肺癌脑转移组、肺癌组、肺炎组和健康对照组中S100BB蛋白阳性率分别为83.7%(36/43)、36.4%(16/44)、24.4%(11/45)、15.9%(7/44),肺癌脑转移组S100BB的阳性率显著高于肺癌组、肺炎组和健康对照组(X~2=50.705,P<0.01).肺癌脑转移肿瘤1 cm以下组、1～2 cm组和2 cm以上组的S100BB蛋白水平分别为47.87(39.63～131.68)ng/L、45.28(40.02～126.70)ng/L和38.79(34.86～58.23)ng/L,3组间差异均无统计学意义(U值分别为50.5、65.0和56.0,P均>0.05).结论 血清S100BB蛋白水平可以作为肺癌脑转移发生的辅助诊断指标,但肺癌脑转移瘤大小可能与S100BB蛋白水平无关.
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神经营养因子受体相关黑色素瘤抗原基因同源物和p38基因与下肢动脉粥样硬化的关系
目的 探讨神经营养因子受体相关黑色素瘤抗原基因同源物(NRAGE)和p38基因多态性与闽南汉族人群下肢动脉粥样硬化(LEAD)发病的相关性.方法 收集本院468例体检者的临床资料及外周静脉血,分为LEAD组(228例)和正常组(240例);采用Sequenom MassArray系统对该人群的NRAGE基因rs5991738、rs7882628、rs6614327、rs4986561和p38基因rs3761979、rs6457878、rs3804451等7个单核苷酸多态性(SNP)位点进行基因分型.结果 7个SNP位点均符合Hardy-Weinberg平衡;rs5991738和rs7882628,rs6457878和rs3804451位点之间均存在明显的连锁不平衡现象;rs5991738(OR=1.109)、rs6457878(OR=1.167)和rs3804451(OR=1.082)有致病性;rs5991738位点在2组间的等位基因分布频率比较有显著差异(P＜0.05);rs5991738基因logistic回归分析显示:OR=3.901,L95值为1.257.结论 NRAGE基因rs5991738位点突变可能是LEAD致病相关危险因素之一.
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鼠神经生长因子制剂对老年脑出血患者神经功能缺损的疗效分析
目的 观察鼠神经生长因子制剂对老年脑出血患者神经功能缺损的疗效.方法 选择老年脑出血患者120例,随机分为对照组60例和实验组60例.对照组给予胞磷胆碱,治疗15d;实验组给予鼠神经生长因子制剂,治疗15d.其他常规治疗2组相同.采用美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分评价患者的神经功能缺损情况,采用Barthel指数(BI)评价患者日常生活活动能力,采用脑卒中影响量表评价患者生活质量.结果 治疗后2组NIHSS评分与治疗前比较均明显降低,随着治疗时间延长,治疗后第15天,对照组和实验组患者NIHSS评分平均值分别为10.13分和5.24分,实验组显著低于对照组(P＜0.05).实验组患者显效明显高于对照组(41.7％ vs 25.0％),差异有统计学意义(P＜0.05);治疗第15天实验组的BI评分显著高于对照组(76.5分vs56.5分,P＜0.05);与治疗前比较,2组治疗第15天BI评分均显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 鼠神经生长因子制剂可以有效缓解老年脑出血患者的神经功能缺损,提高患者生活质量.
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高血压心肌肥厚患者心脏交感神经分布与勿动蛋白A表达变化的关系
目的 探讨高血压心肌肥厚患者心脏交感神经分布与神经元轴突生长抑制因子勿动蛋白A(neurite outgrowth inhibitor-A,Nogo A)的表达变化.方法 从我院老年患者尸体标本库中,随机入选男性高血压患者10例,并根据患者去世前1周心脏超声结果分为心肌肥厚组4例和非心肌肥厚组6例.检测超声心动图,并计算左心室重量指数.免疫组织化学分析测定酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)与Nogo A的表达.结果 与非心肌肥厚组比较,心肌肥厚组患者室间隔厚度、左心室后壁厚度、左心室重量指数明显升高(P＜0.05)；心肌肥厚组患者心肌TH阳性表达明显降低[(6.35±3.85)％ vs(22.17±8.19)％,P＜0.05],Nogo-A表达明显增加[(11.34±7.16)％ vs(2.17±4.10)％,P＜0.05].心肌肥厚患者心肌Nogo A表达与心肌TH表达呈负相关(r=-0.33,P＜0.05).结论 老年高血压心肌肥厚患者心肌交感神经分布减低,然而心肌神经元轴突生长抑制因子Nogo-A表达增加,两者间存在密切相关性.
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神经生长因子对缺氧神经干细胞凋亡和分化功能的影响
目的 探讨缺氧环境对培养的胎鼠大脑神经干细胞(neural stem cells,NSCs)凋亡和分化的影响及神经生长因子(nerve growth factor,NGF)的作用.方法 将培养至第3代的NSCs分为3组,对照组:正常培养;缺氧组:缺氧培养(5% CO2、90% N2);NGF作用组:缺氧培养同时加入NGF,分别培养3天.Western blot测定NSCs Bel-2、Bax蛋白含量;RT-PCR测定NSCs分化细胞bcl-2、bax和nse、nne、gfap基因表达.结果 NSCs分化的第1、2、3天,缺氧组bcl-2较NGF作用组和对照组明显降低,bax明显增加(P＜0.01);NGF作用组bcl-2在NSCs分化的第1、3天与对照组比较差异有显著性意义,bax在NSCs分化的第1、2、3天均无差异.缺氧组nse、nne表达在第1、2、3天均低于对照组和NGF作用组,gfap表达高于对照组和NGF作用组(P＜0.01);NGF作用组与对照组比较,nse表达在第2、3天差异有显著性意义,nne表达在第1、3天差异有显著性意义,gfap表达在第2天差异有显著性意义(P＜0.01).结论 缺氧可引起NSCs凋亡,NGF具有保护NSCs抗凋亡的功能.
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NEP1-40对局灶性脑缺血大鼠生长相关蛋白43和微管相关蛋白2表达的影响
目的 观察局灶性脑缺血大鼠生长相关蛋白43(GAP-43)和微管相关蛋白2(MAP-2)的表达变化,及轴突生长抑制因子A(NogoA)拮抗剂NEP1-40给药后对其表达的影响,探讨NogoA抑制神经再生的可能机制.方法 雄性SD大鼠48只,随机分为3组:假手术组、模型组和给药组,每组16只,采用线栓法建立大脑中动脉闭塞模型,给药组于脑缺血术后1d给予NEP1-40溶液侧脑室注射.术后1、3、7和14 d用免疫组织化学法检测缺血侧纹状体区域GAP-43和MAP-2的表达变化.结果 脑缺血后缺血侧纹状体区域,在模型组和给药组脑缺血后1、3和7d GAP-43阳性表达的吸光度值逐步增高,14 d GAP-43表达有所下降,但均明显高于假手术组.给药组1、3、7和14 d GAP-43阳性表达的吸光度值均明显高于模型组(0.19±0.18 vs 0.17±0.23,0.24±0.10 vs 0.21±0.04,0.30±0.21 vs 0.25±0.06和0.26±0.23 vs 0.23±0.08,P＜0.05).模型组和给药组各时间点MAP-2阳性表达的吸光度值逐渐升高,但均明显低于假手术组.给药组各时间点MAP-2阳性表达的吸光度值均明显高于模型组.结论 抑制NogoA后可以通过增加缺血区GAP-43和MAP-2的表达,促进神经修复,这可能是NogoA抑制神经再生的机制.
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山楂叶总黄酮对慢性脑缺血大鼠轴突过度再生抑制因子A及其受体表达的影响
目的 探讨山楂叶总黄酮对慢性脑缺血大鼠的轴突过度神经再生抑制因子A(neurite outgrowth inhibitor,NogoA)及NogoA受体(NgR1)表达的影响.方法 SPF级雄性成年SD大鼠48只,随机分为假手术组、模型组、山楂叶总黄酮组[山楂叶总黄酮140 mg/(kg· d)]、银杏叶片组[银杏叶提取物65 mg/(kg·d)],每组12只,后3组采用双侧颈总动脉永久性结扎法制备慢性脑缺血模型后第30天开始灌胃,连续30 d.HE染色观察海马CA1区神经元形态和密度;Western blot法和免疫组织化学法分别检测NogoA和NgR1蛋白表达.结果 与模型组比较,山楂叶总黄酮组大鼠NogoA蛋白[(18.3±0.54)×10-3 vs (46.3±5.81)×10-3,P＜0.01]和NgR1蛋白(0.68±0.08 vs 0.82±0.15,P＜0.05)表达明显降低,分别降低了(38.88±9.22)％和(17.07±5.34)％;海马CA1区神经元密度显著增加[(20.28±4.68)个/mm2 vs (15.47±5.61)个/mm2,P＜0.05].山楂叶总黄酮组NogoA蛋白与银杏叶片组比较无显著差异(P＞0.05),2组海马CA1区神经元密度[(20.28±4.68)个/mm2 vs (21.62±4.24)个/mm2]也无统计学差异(P＞0.05).结论 山楂叶总黄酮对慢性脑缺血大鼠的神经功能具有保护作用,其机制可能与下调NogoA和NgR1蛋白表达,促进中枢神经再生有关.
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脑源性神经营养因子前体的研究进展
神经营养因子家族对神经细胞的生长、分化和存活等具有重要的营养支持作用,这早已成为研究者们的共识.早期研究者较为关注的是其中的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)家族,但成熟体BDNF的表达水平近来被认为可能难以成为阿尔茨海默病等神经退行性疾病有效的生物标记物[1.近年来研究发现,脑源性神经营养因子前体(brain-derived neurotrophic factor precursor,proBDNF)作为成熟BDNF的前体物质,其自身存在着重要功能,逐渐改变了以往将proBDNF仅作为细胞内无生物活性的失活状态的传统认识[2-3].研究证实,proBDNF在神经细胞的生长、分化、存活和凋亡等方面均有重要作用,与神经突触可塑性以及记忆等功能有重要联系.
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黄体酮对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织神经生长因子表达的影响
目的 观察黄体酮对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤后缺血区皮层神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)在mRNA与蛋白质水平表达的影响,探讨黄体酮在脑缺血-再灌注损伤中的脑保护作用机制. 方法 采用SD雄性大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤模型.将96只大鼠随机分为4组:假手术组、缺血再灌注组、溶剂组和黄体酮组各24只.应用Real time-PCR和Western blot技术分别对缺血区皮层NGF和BDNF mRNA与蛋白表达情况进行测定. 结果 在缺血区皮层,缺血2h再灌注6h后,缺血再灌注组NGF和BDNF的mRNA及蛋白质表达达高峰,再灌注24 h后,回复到假手术组水平；缺血2h再灌注12 h后,黄体酮组NGF和BDNF mRNA及蛋白表达达高峰,再灌注24 h后,表达仍高(P＜0.05). 结论 黄体酮可以使脑缺血-再灌注损伤后NGF和BDNF的mRNA表达上调,促进脑内NGF和BDNF蛋白的合成,从而发挥脑保护作用.
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neurturin基因转染c17.2神经干细胞移植治疗帕金森病模型大鼠的实验研究
目的 探讨neurturin(NTN)基因转染c17.2神经干细胞脑内移植后对帕金森病(PD)大鼠模型的治疗作用,并探讨神经干细胞介导的基因治疗方法的有效性.方法 在构建成功高表达NTN蛋白NTN-c17.2细胞克隆的基础上,分别在6-羟多巴胺单侧模型大鼠的纹状体区移植入NTN-c17.2、Mock-c17.2和磷酸缓冲液(PBS),通过免疫组化、旋转行为变化和高效液相色谱监测观圹察c17.2神经干细胞的分化,NTN基因的表达和NTN蛋白的治疗作用.结果 NTN-c17.2细胞移植后,标记抗原巢蛋白(nestin)逐渐消失,细胞分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,但仍持续分泌NTN蛋白.动物模型旋转行为动态观测和高效液相色谱法(HPLC)检测都提示NTN-c17.2和Mock-c17.2好于PBS组,两组之间差异无统计学意义(P＞0.05),RT-PCR和免疫组织化学检测提示c17.2神经干细胞能产生多种神经营养因子,移植后部分细胞可分化成酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经细胞.结论 用带有NTN基因的神经干细胞移植治疗PD,显示出一定的治疗效果,然而,这种治疗作用主要和神经干细胞分泌的多种神经营养因子和移植后的细胞分化有关,NTN蛋白可以增强这种作用.
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左旋多巴诱发异动症大鼠基底节环路功能改变的研究
目的 研究左旋多巴诱发的异动症(LID)大鼠纹状体区前强啡肽原(PDyn)和神经生长因子诱导蛋白-B(NGFI-B)基因表达的变化与行为学特点,探讨LID时大鼠基底节环路功能改变与异动症形成之间的关系.方法 分别以SCH23390(D1受体拮抗剂)、氟哌啶醇(D2受体拮抗剂)治疗LID大鼠,观察LID大鼠的行为学改变,并用逆转录聚合酶链反应技术检测其纹状体区PDyn mRNA和NGFI-B mRNA表达的变化.结果 LID大鼠治疗第28天的异常不自主运动(AIM)评分为(43.3±11.3)分,经SCH23390治疗后为(4.5±2.2)(P＜0.01),而经氟哌啶醇治疗后为(39.8±8.4)分,(P＞0.05).大鼠损毁侧纹状体区PDyn mRNA的相对表达量:PD组为(0.95±0.31)低于LID组(1.80±0.28)(P＜0.01),SCH23390组(1.13±0.39)低于LID组(P＜0.01),氟哌啶醇组(1.69±0.92)则高于SCH23390组(P＜0.01),上述差异均有统计学意义.NGFI-B mRNA的相对表达量:LID组(14.98±0.43)较PD组(11.38±1.02)增高(P＜0.01),SCH23390组(14.26±0.69)与LID组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).氟哌啶醇组为(18.01±0.73),分别高于LID组和SCH23390组(P均＜0.01).结论 LID的形成与基底节环路活动异常有关,其中直接通路的异常活化起了关键性的作用,直接通路上PDyn mRNA和NGFI-B mRNA表达的增高与LID的形成密切相关.
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轴突导向因子netrin-1在子痫前期患者胎盘组织中的表达及其与胎盘新生血管形成的关系
目的 探讨轴突导向因子netrin-1在子痫前期孕妇胎盘组织中的表达及其对胎盘新生血管形成中的作用.方法 采用RT-PCR和免疫印迹技术分别检测正常妊娠妇女20例(正常妊娠组)和子痫前期孕妇20例(子痫前期组,其中轻度12例,重度8例)的胎盘组织中轴突导向因子netrin-1 mRNA和蛋白的表达;采用免疫组化并通过抗F8因子抗体检测两组孕妇胎盘组织中的血管密度.结果 (1)正常妊娠组及子痫前期组孕妇胎盘组织中netrin-1 mRNA相对吸光度(A)值分别为0.51±0.08和0.41±0.06,netrin-1蛋白A值分别为26.4±1.8和20.5±1.3.两组分别比较,差异有统计学意义(P＜0.01).子痫前期组轻度和重度孕妇netrin-1 mRNA A值分别为0.48±0.08和0.34±0.07,netrin-1蛋白A值分别为22.8±1.3和18.2±1.0.两者分别比较,差异有统计学意义(P＜0.01).(2)子痫前期组孕妇胎盘血管密度为(54±8)个,正常妊娠组孕妇为(65±10)个,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);子痫前期组中重度孕妇血管密度为(48±7)个,轻度孕妇为(60±9)个,两者比较,差异有统计学意义(P＜0.01).(3)正常妊娠组孕妇胎盘组织中netrin-1 mRNA及其蛋白表达与血管密度呈正相关关系,相关系数(r)分别为0.67和0.71(P均＜0.01);子痫前期组孕妇胎盘组织中netrin-1 mRNA及其蛋白表达与血管密度呈正相关关系,r分别为0.61和0.70(P均＜0.01);子痫前期组轻度孕妇胎盘组织中netrin-1 mRNA及其蛋白表达与血管密度呈正相关关系,r分别为0.69和0.73(P均＜0.01);重度孕妇胎盘组织中netrin-1 mRNA及其蛋白表达与血管密度呈正相关关系,r分别为0.71和0.75(P均＜0.01).结论 子痫前期孕妇胎盘组织中netrin-1表达下降,可能是胎盘血管密度降低的原因之一.
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S100B 蛋白表达与早发型及晚发型子痫前期发病的关系
目的 通过检测S100B蛋白在早发型及晚发型子痫前期胎盘组织滋养细胞中的表达,探讨S100B蛋白表达与早发型及晚发型子痫前期发病的关系.方法 选择2010年10月-2011年9月在青岛市市立医院产科以剖宫产术分娩的子痫前期产妇60例,其中早发型子痫前期产妇30例(早发型组,发病孕周＜ 34周),晚发型子痫前期产妇30例(晚发型组,发病孕周≥34周),随机选择同期健康足月妊娠(因骨盆异常、臀位、巨大儿、社会因素等原因)行剖宫产术分娩的产妇30例为健康对照组.采用逆转录(RT) -PCR技术以及免疫组化方法分别检测各组产妇胎盘滋养细胞中S100BmRNA及蛋白的表达.结果 (1)S100B mRNA在各组胎盘滋养细胞中均有表达,其中在早发型组为0.73±0.11,晚发型组为0.64±0.10,健康对照组为0.58±0.08；其早发型组与晚发型组及健康对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；晚发型组与健康对照组比较,差异无显著意义(P＞0.05).(2)S100B蛋白在各组胎盘滋养细胞中均有表达,主要表达于胎盘滋养细胞的细胞膜、细胞质内,呈棕黄色或棕褐色颗粒.S100B蛋白在早发型组的阳性表达率为100％( 30/30),在晚发型组的阳性表达率为70％(21/30),健康对照组的阳性表达率为63％ (19/30),早发型组与晚发型组及健康对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；晚发型组与健康对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 早发型与晚发型子痫前期可能存在不同的发病机制,S100B蛋白参与了早发型子痫前期的发病.
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胎盘组织中色素上皮衍生因子蛋白的表达变化与子痫前期发病的关系
目的 探讨胎盘组织中色素上皮衍生因子(PEDF)蛋白表达及其与胎盘血管生成的机制在子痫前期发病中的作用.方法 选取2011年10月至2013年1月在南方医科大学南方医院妇产科住院分娩的子痫前期孕妇60例,分为子痫前期轻度组30例,子痫前期重度组30例；同期分娩的健康妊娠晚期孕妇40例作为对照组.采用蛋白印迹和免疫组化SP法测定各组孕妇胎盘组织中PEDF蛋白的表达,计数胎盘微血管密度(MVD),对胎盘组织中PEDF蛋白表达与MVD进行相关性分析.结果 (1)胎盘病理:子痫前期轻度组和重度组胎盘重量明显减轻,绒毛血管数量减少,管腔狭窄,滋养细胞基底膜增厚；合体滋养细胞结节状增生,伴灶性梗死、纤维素样坏死或血栓形成.而对照组胎盘组织则无上述病理改变.(2) PEDF蛋白表达:子痫前期轻度组、子痫前期重度组和对照组胎盘PEDF蛋白表达水平分别为0.63 ±0.09、0.93±0.07和0.47 ±0.04,子痫前期轻度组及子痫前期重度组胎盘PEDF蛋白表达水平显著高于对照组,分别比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；且子痫前期重度组显著高于子痫前期轻度组,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).(3)MVD检测:子痫前期轻度组、子痫前期重度组和对照组胎盘组织中MVD水平分别为106 ±9、93 ±8、136 ±9,子痫前期轻度组及重度组显著低于对照组,分别比较,差异有统计学意义(P＜0.05),且子痫前期重度组显著低于子痫前期轻度组,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).(4)相关性分析:子痫前期轻度组及子痫前期重度组胎盘组织中PEDF蛋白表达与MVD均呈负相关(分别为r=-0.426,P ＜0.05;r=-0.646,P＜0.05),对照组胎盘组织中PEDF蛋白表达与MVD也呈负相关(r=-0.589,P＜0.05).结论 子痫前期孕妇胎盘组织中PEDF蛋白高表达,导致胎盘血管生成障碍和胎盘发生缺血缺氧性病理改变,从而参与子痫前期的发病与病情进展.
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轴突导向因子netrin-1基因沉默对胎盘血管生成影响的体内外实验研究
目的 研究轴突导向因子netrin-1基因沉默对胎盘血管生成的影响.方法 应用RNA 干扰技术分别沉默netrin-1基因在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和孕鼠胎盘组织中的表达;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性;克隆形成实验检测细胞增殖能力;细胞迁移实验检测细胞迁移能力;小管形成实验检测细胞管腔形成能力;观察胎鼠体质量;CD34因子的免疫组化链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法检测孕鼠胎盘的微血管密度.结果 (1)HUVEC:沉默netrin-1基因后,HUVEC细胞活性受到抑制,克隆形成率由(69±6)%降至(46±5)%,迁移细胞数由(86±17)个降至(46±13)个,小管形成的分支点数由(37±9)个降至(17±5)个,HUVEC的netrin-1基因沉默前后比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).(2)孕鼠胎盘组织:沉默孕鼠胎盘组织netrin-1基因后,胎鼠体质量由(2.39±0.17)g降至(2.12±0.10)g,胎盘微血管密度由(258±38)条/mm2降至(197±32)条/mm2,孕鼠胎盘组织netrin-1基因沉默前后比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 沉默netrin-1基因,可以抑制体外HUVEC的细胞活性及增殖、迁移和管腔形成能力,同时使体内胎盘组织的血管生成能力下降.netrin-1是重要的促胎盘血管生长基因.
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轴突导向因子netrin-1在滋养层细胞侵袭中的作用
目的 探讨轴突导向因子netrin-1在滋养层细胞侵袭中的作用及其机制.方法 采用RT-PCR技术检测绒毛膜外滋养细胞株TEV-1中netrin-1的6种受体(UNCSA、UNCSB、UNCSC、UNCSD、DCC和neogenin)mRNA的表达.将培养的细胞按照加入netfin-1蛋白浓度的不同分为10μg/L组、50μg/L组、100 μg/L组、500 μg/L组、1000μg/L组、5000μg/L组和阴性对照组(netrin-1的浓度为0 μg/L)共7组,分别用细胞计数试剂盒8检测各组细胞的增殖能力[以吸光度(A)值表示],体外侵袭实验检测各组细胞的侵袭能力.结果 (1)RT-PCR技术检测结果显示,netrin-1的6种受体中,仅检测到neogenin和UNC5B mRNA的表达.(2)培养72 h后,10μg/L组、50μg/L组、100μg/L组、500μg/L组、1000μg/L组和5000 μg/L组细胞的A值分别为1.55±0.29、1.72±0. 31、2. 15±0.35、1.42±0.25、1.50 ±0.27和1.38±0.23,分别与阴性对照组(1.00±0.16)比较,差异均有统计学意义(P<0.05).(3)培养6 h后,10μg/L组、50μg/L组、100μg/L组、500μg/L组、1000μg/L组和5000 μg/L组细胞的穿膜细胞数分别为(41±4)、(47±5)、(55±6)、(44 ±5)、(43±5)和(42±5)个,分别与阴性对照组[(30±4)个]比较,差异均有统计学意义(P<0.05).(4)neogenin mRNA的表达水平,10μg/L组、50μg/L组、100μg/L组、500μg/L组、1000μg/L组和5000 μg/L组分别为1.50±0.16、1.83±0.19、2.24±0.25、2.12±0.24、2.12±0.23和2.13±0.23,分别与阴性对照组(1.00±0.11)比较,差异均有统计学意义(P<0.05);10 μg/L组与50μg/L组比较,50μg/L组与100μg/L组比较,差异也均有统计学意义(P<0.05);100 μg/L组与500 μg/L组、1000 μg/L组和5000μg/L组之间两两比较,差异均无统计学意义(P>0.05).(5)UNCSB mRNA的表达水平,10μg/L组、50μg/L组、100 μg/L组、500 μg/L组、1000 μg/L组和5000 μg/L组分别为1.09±0.11、1.47±0.14、1.61±0.16、1.85±0.19、2.21±0.21和2.42±0.23,分别与阴性对照组(1.00 ±0.07)比较,差异均有统计学意义(P<0.05);各组之间分别比较,差异也均有统计学意义(P<0.05).结论 netrin-1能促进入绒毛膜外滋养细胞的增殖和侵袭能力,这种促进作用受到其受体neogenin及UNCSB的调控.
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重组人色素上皮衍生因子在真核细胞SP2/0中的瞬时表达及活性鉴定
目的 构建抑制早产儿视网膜病新生血管形成的重组人色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)真核表达载体,检测其在小鼠骨髓瘤细胞SP2/0中的瞬时表达.方法 根据已知的GenBank中人PEDF cDNA成熟蛋白编码区序列设计特异性引物,以全基因合成的pUC57-PEDF质粒为模板,经聚合酶链反应技术扩增人PEDF基因,定向克隆至真核表达载体pIRESneo3中,获得重组表达质粒pIRESneo3-PEDF.将重组质粒pIRESneo3-PEDF与脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000混合后转染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,采用酶联免疫吸附试验及Western印迹对表达产物进行鉴定.收集转染细胞培养液上清,采用四甲基偶氮唑盐比色法检测重组PEDF活性.结果 聚合酶链反应技术、酶切鉴定和测序结果表明,pIRESneo3-PEDF表达载体构建成功.脂质体法将表达质粒成功转染到SP2/0中,经培养,可分泌表达PEDF,且经Western印迹检测证明为人PEDF,分子量为50 000.转染36 h上清液中PEDF浓度高,为(0.92±0.04) μg/ml.转染36 h细胞培养液上清对人脐静脉内皮细胞的抑制作用强(P<0.05).结论 成功构建人PEDF真核表达质粒pIRESneo3-PEDF,转染细胞可瞬时分泌表达有活性的人PEDF,对人脐静脉内皮细胞增殖有抑制作用,为开展下一步稳定转染表达及蛋白纯化奠定基础,为早产儿视网膜病的防治带来新的希望.
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干扰BDNF表达对97-H细胞侵袭影响及其机制的探讨
目的:应用特异性小干扰RNA(siRNA)下调97-H细胞中脑源性神经生长因子(BDNF)表达,观察对细胞凋亡和侵袭的影响并探讨相关分子机制.方法:在人肝细胞癌(HCC)细胞系97-H中,采用蛋白质印迹法检测BDNF的表达,采用ELISA方法检测培养上清上BDNF的分泌水平.特异性BDNF-siRNA转染细胞,采用FITC-phalloidin染色方法检测actin细胞骨架的变化,采用western blot方法检测细胞内RhoA、Racl、Cdc42的活化情况.同时,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室测定细胞侵袭能力的变化.结果:97-H细胞培养上清中BDNF含量为(119.08±6.21) ρg/mL.在97-H细胞中,特异性BDNF-siRNA显著抑制BDNF的表达,干扰细胞内actin细胞骨架聚合,RhoA 或Rac1活性受到抑制,同时与对照组相比,凋亡细胞百分比增加至(27.00±1.71)％,P=0.000,侵袭细胞数减少至(26.9±1.6)％,P=0.000.结论:干扰BDNF的表达能显著降低HCC细胞侵袭能力,其机制可能与阻断actin细胞骨架聚合、以及RhoA或Rac1活化相关.BDNF信号通路可能作为阻断HCC发展演进的新靶点,有待于进一步深入研究.
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胰腺导管癌神经生长因子mRNA表达及意义
目的研究胰腺导管癌和慢性胰腺炎组织中神经生长因子(NGF mRNA)的表达及临床病理意义.方法 51例胰腺癌和10例慢性胰腺炎手术切除标本经40 g/L中性甲醛固定后常规制作石蜡包埋切片,NGF mRNA染色为原位杂交法.结果胰腺癌组织NGF mRNA阳性率(54.9%)明显高于慢性胰腺炎(10.0%),差异有高度显著性(χ2=6.76,P＜0.01);高分化腺癌、未转移胰腺癌NGF mRNA表达阳性率明显低于低分化腺癌(25.0%对84.2%;χ2=13.74,P＜0.01)和转移病例(31.3%对65.7%;χ2=5.27,P＜0.05), NGF mRNA与胰腺癌其他临床病理特征无明显相关.结论 NGF mRNA表达可能与胰腺癌发生、进展、转移及预后有较密切的关系,可能是胰腺癌发生、发展及预后的重要生物学标记物.
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红景天甙促进帕金森病模型小鼠表达内源性胶质细胞源性神经营养因子蛋白保护多巴胺能神经元
目的 研究中药单体成分红景天甙(salidroside)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱发的帕金森病(Parkinson disease,PD)小鼠模型的脑保护作用及其可能机制.方法 80只C57BL雄性小鼠,分为正常对照组、MPTP模型组、MPTP+红景天甙组(即干预组,分别用3 mg/kg、50mg/kg和150 mg/kg)及红景天甙对照组(分别用3 mg/kg、50 mg/kg和150 mg/kg),每组10只.应用免疫组化法观察黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数目变化,蛋白印迹法(Western blot)检测TH、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在纹状体中表达水平的变化.结果 在小鼠黑质部位,MPTP组TH阳性神经元数目明显少于正常对照组及干预组(P＜0.05).Westernblot结果显示,不同剂量干预组小鼠纹状体中的TH蛋白表达(相对灰度值)(0.8326±0.0930,0.9007±0.0104和1.1114±0.2013)较MPTP组的TH蛋白表达(0.5738±0.0114)明显增加(P＜0.05);干预组的GDNF蛋白表达(1.3503±0.0573)较MPTP组的蛋白表达(0.1485±0.0118)显著增加(P＜0.05);干预组的GFAP蛋白表达(2.4788±0.2093)与MPTP组(1.8431±0.1559)之间差异无统计学意义(P＞0.05),但是干预组较正常对照组(1.3695±0.1174)明显增加(P＜0.05).结论 红景天甙可以拮抗MPTP诱导的PD模型小鼠黑质多巴胺能神经元的丢失,其神经保护作用可能与促进内源性GDNF分泌增加有关.
