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色素上皮细胞衍生因子对脑胶质瘤细胞凋亡的影响
目的 本研究试图通过检测人脑胶质瘤U87细胞中色素上皮细胞衍生因子(PEDF)以及凋亡相关蛋白的表达,探讨其表达在胶质瘤的增殖和细胞凋亡调控中的作用.方法 将100μg/ml的PEDF加入U87细胞中(PEDF处理组),同时以未加PEDF蛋白的胶质瘤细胞作对照组(U87con),采用四甲基偶氮唑蓝法榆测PEDF对胶质瘤细胞U87增殖率的影响;流式细胞术检测胶质瘤细胞是否凋亡;Western-blot(免疫印迹)检测PEDF处理组凋亡相关蛋白p16的变化.结果 实验数据显示:与对照组相比,当PEDF浓度为100μg/ml时,对U87的抑制率为(54.29±0.62)%,PEDF处理组胶质瘤细胞的增殖明显减慢(t=2.63,P＜0.05);PEDF处理过的凋亡细胞产生明显增多,annexin V+和PI-的细胞为(21.84±0.36)%,提示胶质瘤细胞处于凋亡早期(t=2.86,P＜0.05);PEDF诱导的发生凋亡的胶质瘤细胞中,p16蛋白的表达量明显增加(0.82±0.09),与对照组相比(0.43±0.03),差异具有统计学意义.结论 PEDF与p16协同作用,可能在胶质瘤细胞凋亡的调控中起着重要的作用,从而抑制胶质瘤细胞增殖.
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原发性开角型青光眼家系的MYOC基因突变研究
目的 对来自重庆地区的1个原发性开角型青光眼(POAG)家系进行MYOC基因突变筛查,研究POAG与MYOC基因突变的相关性,探讨MYOC基因突变在中国人POAG发病中的作用.方法 1个4代共39例的青光眼家系,8例为已确诊患者,健康对照者100名.用单链构象多态性分析(SSCP)、PCR.限制性片段长度多态性(RFLP)和基因测序的方法筛选MYOC基因的突变(包括G34C、C136T、G144T、G227A、C624G、G736A、C1009G、A1036G、C1081T、G1099A、G1138A、A1139C、T1430A、C1441A和C1442T等),同时对检测到的突变结果进行生物信息学分析.结果 在该家系中,发现1个G227A(Arg76Lys)突变,该突变存在2例已确诊的POAG患者和1例家系表型正常者中,健康对照者中未榆出.发现1个缺失突变(C1009del),该突变存在于家系中所有发病患者和1例4岁的子代亲属,健康对照者中未检出.未发现其他突变.由于C1009del突变是首次发现,据此我们申请了GenBank号,已发表的GenBank序列号为FJ237047,对应的蛋白序列号为ACI62293.结论 G227A(Arg76Lys)突变为已报道的多态性位点,与该家系青光眼的发病无相关性.移码突变C1009del突变与青光眼的发病密切相关,也可由此推测青光眼患者亲属的发病率较正常人高.
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色素上皮细胞衍生因子与胶质瘤侵袭的相关性
目的 评价色素上皮细胞衍生因子(PEDF)对胶质瘤侵袭的抑制作用.方法 将PEDF(100 ng/ml)加入胶质瘤细胞U87中(U87PEDF),以未加PEDF蛋白的胶质瘤细胞作对照组(U87con),同时在U87PEDF中加入0.25μg/ml的促血管生成因子(VEGF,U87PEDF+VEGF).细胞迁徙实验检测PEDF抑制胶质瘤细胞侵袭性;实时荧光定量逆转录(RT)-PCR检测层粘连蛋白Laminin-8表达.结果 迁徙实验结果表明,对照组胶质瘤细胞穿透数明显多于PEDF处理组细胞,加入VEGF后,胶质瘤细胞迁徙率的抑制率仍减少38%;实时荧光定量RT-PCR结果显示,U87对照组 Laminin-8α4、β1、γlmRAN表达分别为(1.043±0.090)、(0.823±0.012)、(0.762±0.005)拷贝/μl,明显高于U87PEDF组[(0.633±0.004)、(0.442±0.005)、(0.424±0.002)拷贝/μl,P＜0.05].结论 在VEGF存在的条件下,PEDF能有效抑制胶质瘤细胞的迁徙,表明其可能由下调Laminin-8基因的表达所致.
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子宫内膜癌组织中DACH1基因启动子的甲基化状态及其临床意义
目的 探讨子宫内膜癌组织中DACH1基因启动子的甲基化状态及其临床意义.方法 选取2004年2月至2008年8月间山东大学齐鲁医院及第二医院行全面分期手术并经病理检查确诊的80份子宫内膜癌组织,以同期(2008年)因功能失调性子宫出血行诊刮并经病理检查确诊为正常子宫内膜的20份组织标本作为对照.采用甲基化特异性PCR (MSP)技术检测子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织中DACH1基因启动子的甲基化状态,蛋白印迹法检测其DACH1蛋白的表达,并分析DACH1基因启动子的甲基化状态与子宫内膜癌临床病理特征的关系.结果 MSP技术检测显示,子宫内膜癌组织中DACH1基因启动子的甲基化阳性率为30％( 24/80),明显高于正常子宫内膜组织(5％,1/20),差异有统计学意义(P＜0.05).DACH1基因启动子甲基化阳性的子宫内膜癌组织中DACH1蛋白为阴性或弱阳性,而DACH1基因启动子甲基化阴性的子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中DACH1蛋白表达阳性；在24份DACH1基因启动子甲基化阳性的子宫内膜癌组织中,DACH1蛋白表达强度与DACH1基因启动子的甲基化程度呈明显负相关关系(r=-0.30,P=0.008).子宫内膜癌组织中,病理分级为G1～G2的癌组织中DACH1基因启动子的甲基化阳性率为18％ (7/39),显著低于G3者(41％,17/41),差异有统计学意义(P＜0.05)；病理类型为子宫内膜样腺癌的癌组织中DACH1基因启动子的甲基化阳性率为23％( 12/53),显著低于特殊类型子宫内膜癌(包括子宫内膜浆液性乳头状癌和子宫内膜透明细胞癌)的44％( 12/27),差异有统计学意义(P＜0.05)；而DACH1基因启动子的甲基化状态与患者的年龄、手术病理分期、肌层浸润深度及淋巴结转移无关(P＞0.05).结论 子宫内膜癌组织中DACH1基因启动子的甲基化导致DACH1蛋白表达降低或缺失,这可能是导致DACH1基因在子宫内膜癌中失活的分子生物学机制之一.
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胎盘组织中色素上皮衍生因子蛋白的表达变化与子痫前期发病的关系
目的 探讨胎盘组织中色素上皮衍生因子(PEDF)蛋白表达及其与胎盘血管生成的机制在子痫前期发病中的作用.方法 选取2011年10月至2013年1月在南方医科大学南方医院妇产科住院分娩的子痫前期孕妇60例,分为子痫前期轻度组30例,子痫前期重度组30例；同期分娩的健康妊娠晚期孕妇40例作为对照组.采用蛋白印迹和免疫组化SP法测定各组孕妇胎盘组织中PEDF蛋白的表达,计数胎盘微血管密度(MVD),对胎盘组织中PEDF蛋白表达与MVD进行相关性分析.结果 (1)胎盘病理:子痫前期轻度组和重度组胎盘重量明显减轻,绒毛血管数量减少,管腔狭窄,滋养细胞基底膜增厚；合体滋养细胞结节状增生,伴灶性梗死、纤维素样坏死或血栓形成.而对照组胎盘组织则无上述病理改变.(2) PEDF蛋白表达:子痫前期轻度组、子痫前期重度组和对照组胎盘PEDF蛋白表达水平分别为0.63 ±0.09、0.93±0.07和0.47 ±0.04,子痫前期轻度组及子痫前期重度组胎盘PEDF蛋白表达水平显著高于对照组,分别比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；且子痫前期重度组显著高于子痫前期轻度组,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).(3)MVD检测:子痫前期轻度组、子痫前期重度组和对照组胎盘组织中MVD水平分别为106 ±9、93 ±8、136 ±9,子痫前期轻度组及重度组显著低于对照组,分别比较,差异有统计学意义(P＜0.05),且子痫前期重度组显著低于子痫前期轻度组,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).(4)相关性分析:子痫前期轻度组及子痫前期重度组胎盘组织中PEDF蛋白表达与MVD均呈负相关(分别为r=-0.426,P ＜0.05;r=-0.646,P＜0.05),对照组胎盘组织中PEDF蛋白表达与MVD也呈负相关(r=-0.589,P＜0.05).结论 子痫前期孕妇胎盘组织中PEDF蛋白高表达,导致胎盘血管生成障碍和胎盘发生缺血缺氧性病理改变,从而参与子痫前期的发病与病情进展.
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色素上皮衍生因子对新生小鼠视网膜病变新生血管的抑制作用
目的 探讨色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)对高氧诱导的新生小鼠视网膜病变新生血管的抑制作用.方法 选取7日龄C57BL/6J新生小鼠吸75%高氧5 d后返回空气制备早产儿视网膜病(retinopathy of prematunty,ROP)的小鼠模型.通过对模型组(n=26)和模型对照组(n=26)小鼠视网膜比较,观察吸氧对视网膜血管的影响.治疗组(n=112):采用不同剂量和注药次数给ROP小鼠右眼玻璃体内注入PEDF,左眼作为自身对照,在生后17 d各组取材做视网膜铺片和切片,对视网膜新生血管进行形态学观察和定量研究.结果 ROP小鼠在生后第12天和14天右眼注入两次PEDF后,第17天时计数突破视网膜内界膜的细胞核数,1μg组左右眼细胞核数分别是(39.43±3.28)个和(13.51±2.05)个(P=0.000);2μg组左右眼细胞核数分别是(48.40±6.24)个和(11.80±1.74)个(P=0.000).血管形态和定量结果均显示眼内注射PEDF后新生血管形成明显减少.以2μg作为注射PEDF剂量,单次注药无效,二次和三次眼内注药有效果.结论 玻璃体内注入PEDF能有效抑制视网膜新生血管的生长,同时不影响正常血管的发育,可能成为防治ROP有效的血管抑制因子.
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比较现代囊外摘出术与超声乳化吸出术对老年性白内障血-房水屏障功能的影响
目的 比较老年性白内障现代囊外摘出术与晶状体乳化吸出术两种手术对眼血-房水屏障功能的影响.方法 分别对32例(37眼)老年性白内障行经典的现代囊外摘出(10 mm大切口)联合人工晶状体植入术以及60例(64眼)老年性白内障行超声乳化(3.2 mm透明角膜切口)联合人工晶状体植入术,应用激光蛋白细胞检测仪定量检测手术前后房水蛋白浓度的变化.结果 两组术前房水蛋白浓度差异无统计学意义(P>0.05),而术后各观察时期的房水蛋白浓度.差异均有统计学意义(P<0.05).现代囊外摘出术组术后随访90 d均高于术前,差异均有统计学意义(P<0.05);晶状体超声乳化组术后90 d与术前比较,差异无统计意义(P>0.05).结论 比较白内障现代囊外摘出手术与晶状体超声乳化手术,前一种术式对血一房水屏障损伤较大,且血-房水屏障功能不能在短时间内修复.
关键词： 白内障超声乳化吸出术 现代囊外摘出术 血房水屏障 眼房水 眼蛋白质类 -
先天性无虹膜症一家系PAX6基因Q310X突变的致病研究
目的 探讨先天性无虹膜症一家系的致病基因突变情况与发病机制.方法 采用病例对照研究方法.对该家系所有成员21人进行全面的眼科检查,同时进行家系调查并采集外周血样本,分离单个核细胞;用基因组DNA纯化试剂盒提取基因组DNA,以先证者DNA为模板聚合酶链反应法扩增转录因子PAX6基因全部14个外显子,用双脱氧末端终止法进行测序分析.结果 测序结果发现先证者Ⅲ2的PAX6基因在第11外显子上有Q310X(c.1378C>T)无义突变.它导致了第301位氨基酸密码子由CAA改变为TAX(Q301X),编码的谷氨酰胺突变为强终止密码子.对该家系中所有21名成员PAX6基因测序,结果发现所有10例患者都携带这一突变,而11名正常人则未检测到这一改变.结论 PAX6基因Q310X的无义突变所致PAX6蛋白翻译提前终止是此先天性无虹膜症家系的致病原因.
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高氧诱导小鼠视网膜病变模型中血管内皮生长因子和色素上皮衍生因子的表达及意义
目的 研究高氧诱导小鼠视网膜病变模型中血管内皮生长因子(VEGF)和色素上皮衍生因子(PEDF)的表达和意义,并探讨两者在视网膜新生血管形成过程中的作用.方法 对照实验研究.对新生C57BL-6N系小鼠给予高氧后,置相对低氧环境中饲养,诱导产生视网膜新生血管.在小鼠生后第12、14及17天摘除眼球,通过逆转录聚合酶链反应和免疫印迹法及荧光素灌注造影,分别检测不同时间点全视网膜新生血管组织对VEGF与PEDF的mRNA和蛋白质的表达水平的差异,并观察视网膜新生血管的分布与形态变化,通过血管内皮细胞计数对新生血管进行量化.应用SPSS11.5统计学软件,采用析因设计方差分析,分别比较实验组与对照组mRNA与蛋白质表达水平的差异,以P<0.05作为差异有统计学意义.结果 在高氧环境中(出生第12天小鼠),OIR模型鼠VEGF蛋白质表达A值(0.47±0.12)较正常鼠(1.81±050)下降,PEDF蛋白质表达A值(5.35±0.94)较正常鼠(0.68±0.17)明显升高;而相对低氧环境中(出生第14和17天小鼠),VEGF蛋白质表达A值(2.15±0.46,5.49±0.97)较正常鼠(0.90±0.05,0.88±0.91)明显升高,PEDF蛋白质表达A值(2.07±0.35,1.37±0.48)较正常鼠(2.62±0.68,5.30±0.59)明显下降,尤以第17天下降显著.对不同时间点VEGF和PEDF蛋白质表达水平进行析因方差分析,结果显示各时间点的VEGF蛋白质表达水平差异有统计学意义(F=70.450,P=0.000),各时间点的PEDF蛋白质表达水平差异有统计学意义(F=160.237,P=0.000).出生第12、14及17天小鼠视网膜VEGF蛋白质的表达与正常对照组比较,差异有统计学意义(P=0.009,0.010,0.000),PEDF蛋白质的表达差异也有统计学意义(P=0.002,0.046,0.000);出生第12、14及17天小鼠视网膜VEGF mRNA的表达与正常对照组比较,差异有统计学意义(P=0.001,0.000,0.001),PEDF mRNA的表达差异也有统计学意义(P=0.000,0.001,0.000).伴随着视网膜组织的缺氧,出现了VEGF蛋白质表达水平升高和PEDF蛋白质表达水平降低,导致视网膜组织中VEGF与PEDF蛋白质表达失衡;VEGF与PEDF的mRNA表达亦发生类似变化,且较蛋白质改变提前发生.上述改变均伴随着同期视网膜新生血管的发生、发展及其严重程度而逐渐加重.结论 VEGF和PEDF的mRNA和蛋白质表达失衡可能足造成视网膜新生血管发生的机制之一.(中华眼科杂志,2008,44:734-740)
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青光眼滤过手术患者超声乳化白内障吸除术后血-房水屏障功能的改变
目的从血-房水屏障功能方面评价青光眼滤过手术后白内障患者行超声乳化白内障吸除人工晶状体植入术的安全性.方法分别对40例(46只眼)青光眼滤过手术后白内障患者(试验组)和60例(64只眼)老年性白内障患者(对照组)行超声乳化白内障吸除人工晶状体植入术,使用激光蛋白细胞检测仪(LFCM)定量检测术前和术后1、7、30、90 d房水蛋白浓度的变化,并进行比较.结果超声乳化白内障吸除人工晶状体植入术前及术后1、7、30、90 d术眼平均房水闪光值试验组分别为(15.12±2.87)、(40.24±3.75)、(24.33±3.38)、(21.18±1.77)、(16.51±1.70)光粒子数(PC)/ms,差异有统计学意义(P<0.05);对照组分别为(6.94±2.34)、(26.27±10.21)、(13.96±6.44)、(9.07±2.67)、(7.16±1.89)PC/ms,差异有统计学意义(P<0.05).其中2组术后1、7、30 d均高于术前(P<0.05);术后90 d与术前比较,差异均无统计学意义(P>0.05).术前和术后1、7、30、90 d 2组平均房水闪光值比较,差异均有统计学意义(P<0.05).试验组术后1 d和30 d与术前平均房水闪光值的差值均高于对照组(P<0.05).结论青光眼滤过手术后患者血-房水屏障功能紊乱;超声乳化白内障吸除人工晶状体植入术治疗青光眼滤过手术后白内障患者具有安全性,但加强抗炎性反应治疗,减轻手术损伤,是保证手术安全性的关键.(中华眼科杂志,2005,41:132-135)
关键词： 超声乳化白内障吸除术 血房水屏障 青光眼 眼房水 眼蛋白质类 -
蓝光致人RPE细胞分泌VEGF及PEDF变化及与Ca2+-PKC信号通路的关系
目的 探讨蓝光照射致体外培养人RPE细胞分泌VEGF、色素上皮衍生因子(PEDF)、RPE细胞内三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DAG)的浓度变化,分析Ca2+-蛋白激酶C(PKC)信号通路之间的相互作用.方法 实验研究.将体外培养的第4代人RPE细胞随机分为6个组,A组:无光照组;B组:蓝光光照组;C组:蓝光光照+PKC激动剂佛波酯(PMA)组;D组:蓝光光照+PKC抑制剂钙磷酸结合蛋白(Calphostin C)组;E组:蓝光光照+硝苯地平组;F组:蓝光光照+钙磷酸结合蛋白组+硝苯地平组.用(2 000±500)lux蓝光照射体外培养人RPE细胞6h,终止培养24 h,采用ELISA测定各组RPE细胞分泌VEGF、PEDF、RPE细胞内IP3和DAG的浓度,采用流式细胞仪检测A、B及F组细胞的凋亡率.结果 A～E组的VEGF浓度分别为(584.38± 10.66)、(700.70±5.88)、(698.21±6.66)、(623.87±3.12)、(648.30±4.91) ng/L.其中B、C、E组的VEGF浓度高于A组,差异有统计学意义(P=O.002,0.002,0.016).A～E组的PEDF浓度分别为(75.96±1.70)、(71.82±1.67)、(72.43±0.58)、(86.31+1.35)、(93.716±1.24) μg/L.其中B、C组PEDF浓度低于A组(P=0.004,0.011).B组和C组的VEGF/PEDF比值显著高于A组(P=0.008,0.027),E组和D组的VEGF/PEDF比值低于B组(P=0.016,0.015).A～E组的IP3浓度分别为(9 108.42±0.74)、(117.23±1.05)、(137.12±2.70)、(139.17±1.39)、(149.60±0.76) μg/L.B、C、D、E组IP3浓度均高于A组(P=0.003,0.007,0.000,0.000),并且C、D、E组IP3浓度均高于B组(P=0.011,0.000,0.000).A～E组的DAG浓度分别为(995.47±13.61)、(1070.10±10.07)、(1046.39±7.90)、(1041.12±9.76)、(1273.13±10.89) pmol/L.B、C、D、E组DAG浓度均高于A组(P=0.000,0.000,0.000,0.000),与B组比较,组DAG的浓度增高(P=0.000),而C、D组DAG浓度降低(P=0.021,0.007).A、B和F组的细胞凋亡率分别是(10.26±1.87)％、(25.06±2.66)％和(19.36±3.23)％.与A组比较,B组和F组的细胞凋亡率升高(P=0.001,0.009);与B组相比较,F组的细胞凋亡率下降(P=0.038).结论 蓝光照射可致人RPE细胞分泌VEGF量增加,PEDF量减少;VEGF与PEDF的比值升高;IP3和DAG浓度增加.L型钙通道及Ca2+-PKC信号通路参与调节蓝光照射导致体外培养的人RPE细胞VEGF、PEDF、IP3和DAG浓度变化,可能存在反馈调节机制.钙磷酸结合蛋白与硝苯地平联合应用可抑制蓝光照射导致体外培养的人RPE细胞凋亡.
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大鼠角膜碱烧伤后差异表达基因的变化及相应基因克隆
目的探讨大鼠角膜碱烧伤后差异基因表达情况,克隆目的基因片段并了解其同源性,检测有无新基因产生, 从分子角度阐明角膜碱烧伤后变性蛋白产生的分子生物学基础.方法采用异硫氰酸胍法提取大鼠角膜碱烧伤后3 d和2周的角膜RNA,合成双链cDNA.分别以正常角膜和碱烧伤角膜的cDNA为模板,应用2种锚定引物和12种随机引物,进行24种不同引物组合的差异显示反转录聚合酶链反应(DDRT-PCR),对目的基因进行克隆、克隆鉴定、测序及同源性分析.结果在相同PCR反应条件下,同正常角膜相比,碱烧伤2周的角膜产生1条差异性条带,分子量为630 bp.对该片段进行克隆和测序,并与Gene Bank进行同源性的比较,发现该基因与大鼠线粒体细胞色素C氧化酶的亚单位Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的基因具有部分同源性.结论大鼠碱烧伤2周的角膜有差异基因产生,与大鼠线粒体细胞色素C氧化酶的亚单位Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ具有部分同源性.该差异基因的产生可能与角膜碱烧伤后超氧自由基的作用有关.
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我国诺里病家系NDP基因的突变分析
目的 对我国诺里病一家系进行致病基因突变的鉴定,确定其家系中是否存在NDP基因突变.方法 基因家系研究.发现一个3代均患有诺里病的家系,共13人,患者3人,现存患者仅先证者1人,为20月龄男孩.根据诺里病家族史、临床体征及眼科B超检查对患者进行临床诊断；采集该家系成员外周血标本,常规提取基因组DNA;设计并合成3对特异性引物,通过PCR扩增NDP基因的外显子及外显子与内含子交界区,PCR产物直接测序；通过PCR产物限制性内切酶分析和基因型分析对家系所有13名成员进行突变鉴定.结果 基因测序结果显示先证者及其母亲均具有NDP基因突变c.220C＞ T(p.Arg74Cys),且先证者为该突变的半合子,其母为该突变的携带者；NDP基因突变鉴定表明家系中另外4个表型正常的个体(Ⅲ3、Ⅳ4、Ⅲ5和Ⅱ2)均为该突变的携带者.结论 我国诺里病一家系中发现存在NDP错义突变c.220C＞T.
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重庆地区开角型青光眼患者及其亲属和正常人群中小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白基因突变的研究
目的研究开角型青光眼患者及其亲属和正常人群中小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白(TIGR)基因突变的情况.方法 (1)应用聚合酶链反应(PCR)方法,对15例开角型青光眼患者及其10例一级亲属和20例正常对照者的TIGR基因的3个外显子、部分内含子及部分启动子(7对引物)的各个片段进行扩增,应用单链空间构象多态(SSCP)分析法,筛选可能存在突变的PCR产物.(2)将筛选出的PCR产物交上海基康公司测序.(3)对突变片段行生物信息学分析.结果 (1)在重庆地区15例原发性开角型青光眼患者中,共发现TIGR基因突变者5例,其中青少年型青光眼4例;在10例青光眼患者亲属中发现TIGR基因突变者2例;正常对照者20例中未发现TIGR基因突变.(2) PCR产物测序共发现4个序列改变,其中编码区2个,非编码区2个.编码区的2个突变位点(Ser55Thr、Asp247Stop)及第二内含子区bp35c→t的突变,均未见文献报道;而在启动子区域bp-83c→t的突变有文献报道为1个多态位点.(3)生物信息学分析结果显示编码区的突变可导致氨基酸序列、蛋白质的二级结构及等电点、抗原结合位点等发生改变.结论 TIGR基因突变与青少年开角型青光眼的发生密切相关,由此可推测青光眼患者的亲属发病率较正常人高.TIGR基因突变可引起TIGR蛋白结构及理化特性的变化,这些改变可能是引发开角型青光眼的危险因素之一.
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脂质体介导色素上皮衍生因子-绿色荧光蛋白质粒转染大鼠视网膜细胞及其转染途径的实验研究
目的 观察表达质粒色素上皮衍生因子(PEDF)-绿色荧光蛋白(GFP)以脂质体介导转染入BN大鼠视网膜组织的表达及定位,探索合适的基因治疗给药方法.方法 将脂质体包裹的重组表达质粒PEDF-GFP分别经玻璃体注射和视网膜下注射的途径转染至BN大鼠眼内,于一定时间内分别用荧光显微镜观察GFP表达情况,用RT-PCR方法检测PEDF表达情况.结果 (1)BN大鼠视网膜下注射脂质体包裹的重组表达质粒PEDF-GFP后1 d即可见在荧光显微镜下观察到在注射点周围明显的绿色荧光蛋白分布于视网膜全层包括RPE细胞层,第2、3周荧光强度比第1周增强,荧光范围也有所扩大,可以持续表达4周.RT-PCR结果证实PEDF mRNA表达明显较对照组增强.(2)经玻璃体腔注射脂质体包裹的重组表达质粒PEDF-GFP后第1天BN大鼠的视网膜和RPE细胞亦可见绿色荧光蛋白表达,且分布更均匀,范围更广.第1、2周表达明显增强,到第4周仍有表达.RT-PCR结果也证实PEDF mRNA表达明显较对照组增强.结论 阳离子脂质体可以成功介导PEDF-GFP基因转染至BN大鼠的视网膜组织、RPE细胞中,并能够持续表达.视网膜下注射和玻璃体腔注射均为有效的转染途径.本研究为视网膜,脉络膜新生血管性疾病的基因治疗奠定了基础.
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广州开角型青光眼家系致病基因定位与功能初步研究
目的鉴定常染色体显性遗传家族性开角型青光眼家系(GZ.1)致病基因并探讨其致病机制.方法应用全基因组扫描、连锁分析、核苷酸直接测序法筛查GZ.1家系的致病性基因突变,进一步利用体外基因转染技术,观察突变型基因在小梁细胞中的表达、分布及对细胞凋亡的作用.结果 GZ.1家系所有患者均存在myocilin基因第三外显子Pro370Leu杂合突变(16/16),而家系正常人中均未检测到该突变(0/8).小梁细胞体外转染野生型和突变型myocilin基因后,经免疫印迹法检测证实,培养上清液中突变型myocilin蛋白的细胞外分泌较野生型明显减少;荧光免疫组化检测结果证实野生型myocilin蛋白在小梁细胞内呈点状、弥漫分布;而Pro370Leu 突变型myocilin蛋白以积聚体形式存在于胞质内;经流式细胞仪检测突变型转染组凋亡细胞百分比较野生型转染组及对照组轻度升高.结论突变型(Pro370Leu)myocilin基因为GZ.1家系的致病基因,突变型(Pro370Leu)myocilin蛋白在小梁细胞内以积聚体形式存在,可能是由于蛋白质错误折叠所致,并可能诱导小梁细胞凋亡.
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中国人散发性圆锥角膜VSX1基因变异检测与分析
目的 探讨中国人圆锥角膜VSX1基因的变异类型和变异特点.方法 横断面研究.收集就诊于浙江大学医学院附属邵逸夫医院眼科中心的50例散发性圆锥角膜患者做为病例组,其中男性29例,年龄(19.0±4.8)岁.选取50例健康人群作为对照组.对所有受检者采集外周静脉血,提取基因组DNA,应用聚合酶链反应和DNA直接测序技术,对VSX1基因全部5个外显子及外显子内含子拼接部,进行基因变异的检测;生物信息学分析这些基因变异对蛋白质结构和功能的影响.结果 发现VSX1基因4种碱基变异类型,包括二种错义变异和一种单核苷酸多态性改变:1例圆锥角膜患者在VSX1基因第1外显子氨基酸131位点精氨酸错义变异为脯氨酸(即p.R131P变异),此变异在对照组中未检出;2例圆锥角膜患者在VSX1基因第2外显子氨基酸160位点甘氨酸错义变异为缬氨酸(即p.G160V变异),此变异在对照组中未检出;在VSX1基因第3内含子中,碱基序列8326处发现G→A置换(即g.8326G>A变异),其中3例圆锥角膜患者和4例对照者为杂合性,2例圆锥角膜患者和1例对照为纯合性.生物信息学分析提示p.R131P变异系一新的VSX1基因突变类型,而p.G160V突变对蛋白质结构和功能可能有害;VSX1基因g.8326G>A变异为单核苷酸多态性改变.结论 在中国人圆锥角膜患者中发现了VSX1基因p.R131P新的杂合性突变,揭示了中国人群VSX1基因变异特征,但VSX1基因在中国人圆锥角膜发病中的作用尚需进一步研究.(中华眼科杂志,2018,54:212-217)
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基因检测在一家族性青光眼家系中的预警作用
目的 探讨基因检测技术对家族性青光眼家系新增成员的早期预警作用.方法 前瞻性队列研究.对一家族性青光眼家系新增成员提取外周血DNA,进行myocilin基因突变筛查,根据基因检测结果将其分为myocilin基因突变携带组和非携带组,并对该家系成员进行前瞻性队列研究,观察其视力、眼压、视野、视乳头结构、视网膜神经纤维层改变情况.结果 在12例家族新增成员中,DNA测序证实5例成员myocilin基因第3外显子呈现C→T杂合突变(Pro370Leu);其余7例成员未显示myocilin基因突变.随访过程中,突变携带组成员均相继诊断为开角型青光眼,视野缺损距眼压升高平均时间为21.6个月,视网膜神经纤维层厚度发生变化距眼压升高平均时间为14.4个月;而非携带组成员在随访过程中眼压、视乳头结构、视网膜神经纤维层、视野均未出现病理性改变.结论 myocilin基因为家族性青光眼的致病基因,基因诊断技术在青光眼家系中所表现的特异性及灵敏性可满足症状前诊断要求并具有预警作用.(中华眼科杂志,2009,45:621-624)
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超声乳化白内障吸除术对血-房水屏障功能的影响
目的观察小切口超声乳化白内障吸除人工晶状体植入术及相关因素对血-房水屏障功能的影响.方法使用激光蛋白细胞检测仪对60例(64只眼)白内障患者超声乳化白内障吸除人工晶状体植入术前、后的房水蛋白浓度进行定量检测,记录并比较闪光值.术后随访时间为3个月.结果超声乳化白内障吸除人工晶状体植入术前,术后1 d、1周、1个月及3个月术眼房水的平均闪光值分别为(6.94±0.34)、(26.27±1.37)、(13.96±1.05)、(9.07±0.43)及(7.16±0.27) 光粒子数/ms,其中术后1 d、1周及1个月高于术前,且差异均有显著意义(P<0.05);术后3个月与术前比较,差异无显著意义(P>0.05).术后早期术眼房水蛋白浓度与患者年龄呈正相关(r=0.400, P=0.001),与患者的性别和眼别均无相关.术中虹膜脱出者术后1 d和1周血-房水屏障功能破坏严重.结论超声乳化白内障吸除人工晶状体植入术在术后短期内影响术眼的血-房水屏障功能;激光蛋白细胞检测仪可动态评价超声乳化白内障吸除术对血-房水屏障功能的影响.
关键词： 超声乳化白内障吸除术 血房水屏障 白内障 眼房水 眼蛋白质类 -
原发性开角型青光眼MYOC- TIGR基因突变研究
目的 筛选并研究原发性开角型青光眼(POAG)小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白MYOC- TIGR基因突变情况。方法 病例对照研究。抽取2002年1至12月就诊并诊断为POAG患者118例和150例非POAG对照者的外周静脉血4～8ml，采用酚-氯仿抽提全基因组DNA，应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增全基因组DNA，以单核苷酸构象多态性(SSCP)分析MYOC基因的3个外显子（7对引物）编码区域序列改变。对SSCP分析异常者，采用双向测序法进一步证实。应用Cfr13I、Hinfl及BsmA1等限制性内切酶检测对照者MYOC基因编码区序列改变。POAG与非POAG人群MYOC基因各位点突变率比较采用x2检验。结果 基因序列分析发现G12R、I288M及Y353I共3个基因序列改变。118例POAG患者中仅有5例(4.23％)发生G12R位点突变，150例对照者中未见G12R位点改变；两组G12R位点突变率比较差异有统计学意义(x2=4.37，P=0.037)。POAG组和对照组均有I288M和Y353I位点改变，但两组突变率比较差异无统计学意义(x2=0.07，P=0.791和x2=0.56，P=0.453)。POAG患者基因突变率4.23％。结论 MYOC基因突变可能与POAG发病有关，MYOC基因突变可能是POAG发病的分子机制之一。
