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活体体内光学成像技术在针灸研究中的初步应用
目的:活体动物成像技术是一项崭新的生物医学成像技术,被用于基因表达模式分析、药物的靶向作用等的检测评估中.本研究首次应用该技术对针灸效应进行初步摸索,探讨其在针灸经络研究中的实用价值.方法:取7只SPF级裸鼠随机分为针刺组(4只)、对照组(3只).使用Cy7修饰的转铁蛋白(Tf-Cy7)和阿霉素(Dox)于裸鼠的尾静脉注射,待其分布稳定后针刺组针刺"腰阳关"穴(GV 3),对照组动物不针刺.小动物活体成像系统显示针刺组和对照组Tf-Cy7和Dox分布变化过程,观察针刺对Tf-Cy7和Dox分布的影响.结果:(1)针刺后,血脑屏障及心脏部位的信号开始减弱,Tf-Cy7开始趋向于脾脏和肝脏,针刺50 min时达到大变化,与对照组相比,产生明显的差异.(2)针刺20 min,Dox开始趋向于脑和肺等脏器,针刺30 min时达到大变化.结论:针刺可以改变药物靶点的聚集,活体动物成像技术对针刺过程中Tf-Cy7和Dox体内重新分布的过程显像清晰,此项新技术将在针灸经络研究中具有确切的应用价值.
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红色荧光蛋白在酿酒酵母中的表达特性研究
目的 研究红色荧光蛋白编码基因 Dsred 在酿酒酵母菌中的快速克隆与表达.方法 根据已发表基因序列设计引物,采用连续重叠 PCR方法 快速克隆获得全长 Dsred 基因,将其与 pMD-18T 载体连接后进行测序鉴定.通过 In-fusion 方法 将鉴定正确的pMD-Dsred 重组载体与酿酒酵母表达载体 pYeDP60 进行连接,测序后利用 LiAc 方法 将鉴定正确的 pYeDP60-Dsred重组表达载体转化至酿酒酵母菌 W303-1B 中,PCR 扩增筛选阳性克隆,获得的 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌经诱导培养后进行 SDS-PAGE 电泳分析和绿光激发荧光成像检测.将工程菌分别接种至 YPD、YPG、SCG 和 SCD 培养基,培养 48、72、96、120 和 144 h 后分别测定吸光度(A600)值.取诱导表达后的工程菌(菌液组)进行离心(菌体组)、离心后加甘油(高渗组)处理,分别置于 -70、-20、4、28 和 37 ℃条件培养,荧光显微镜观察其表达特性.结果 连续重叠 PCR 扩增和测序鉴定结果 表明,扩增获得的 Dsred 基因长为 678 bp,其序列与已发表的基因序列完全一致;Dsred 基因已成功插入 pYeDP60-Dsred 重组表达载体,且受酵母诱导型启动子 GAL10-CYC1 调控表达.PCR扩增筛选和 SDS-PAGE 分析显示,pYeDP60-Dsred 重组表达载体已成功导入酿酒酵母菌中,诱导表达产物相对分子质量与预期相符,且诱导后工程菌可在绿光激发下发出红色荧光.4 种培养基内工程菌的菌体生长情况无明显差别,重组Dsred 红色荧光蛋白表达不会抑制酿酒酵母菌体生长.荧光显微镜观察显示,工程菌经不同处理后,高渗组红色荧光蛋白成熟时间短,菌液组时间长;红色荧光蛋白在 37 ℃条件下培养时成熟早,但降解速度较快.结论 成功构建了 pYeDP60-Dsred 重组酿酒酵母表达载体,实现了Dsred 基因在酿酒酵母菌体内的异源表达.红色荧光蛋白表达对酿酒酵母菌体生长无明显影响,且离心保留菌体和加入甘油等缺水高渗处理都有利于红色荧光蛋白的成熟.
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携带绿色荧光蛋白的外源性胶质纤维酸性蛋白基因稳定转染对胶质瘤细胞分化及增殖的影响
目的观察增强胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)基因表达对恶性胶质瘤细胞生物学特性的影响,为胶质瘤诱导分化及基因治疗研究提供理论基础.方法构建携带1.1 kb的GFAP cDNA和绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体,采用脂质体转染法将其导入人恶性胶质瘤细胞系SHG-44,G418结合荧光动态监测筛选阳性克隆;采用原位杂交、免疫细胞化学及Western蛋白印迹等方法检测GFAP基因及其蛋白表达;并通过形态学、细胞生长曲线、软琼脂克隆形成及流式细胞分析等观察GFAP基因对胶质瘤细胞形态、增殖和细胞周期的影响. 结果转染阳性的SHG-44细胞GFAP mRNA及其蛋白表达增强,瘤细胞形态趋向成熟,突起增多变细,细胞增殖速度减缓,G0/G1期、G2/M期细胞比例降低.结论增强GFAP基因表达可显著抑制胶质瘤细胞增殖并诱导其分化成熟,提示通过基因治疗策略或诱导分化方法上调GFAP基因表达是恶性胶质瘤治疗的新途径.
关键词： 神经胶质瘤 神经胶质原纤维酸性蛋白质 基因表达 发光蛋白质类 -
稳定生物发光金葡菌临床株假体周围关节感染动物模型的构建
目的：建立稳定型生物发光临床株金黄色葡萄球菌假体周围关节感染（ PJI ）动物模型并探讨其可行性及应用价值。方法应用噬菌体Phi11侵染带Lux发光基因的标准菌株BD1652，并通过噬菌体转导将Lux基因导入PJI临床菌株金葡菌ST1792基因组DNA，进而构建成稳定型生物发光临床菌株ST1792-Lux。通过抽纸牌，将10只健康BALB／c小鼠随机均分为实验组和对照组，使用克氏针作为两组模型动物的左膝关节假体。术中实验组左膝关节内注入10μl（105 CFU） ST1792-Lux菌液，对照组注入等量0.9％氯化钠溶液，术后1、3、7、14 d，采用活体成像系统（ IVIS）检测生物发光强度随时间变化；并于术后2周观察小鼠左膝关节病理学变化。以非配对t检验对ST1792-Lux和ST1792的生物膜形成能力和同一时间点实验组与对照组小鼠左膝平均生物发光强度进行比较分析。结果经临床株筛选，噬菌体Phi11转导获得生物发光菌株“ST1792-Lux”，无抗生素筛选条件下连续传代培养48 h，ST1792-Lux稳定发光；Lux基因重组于ST1792基因组DNA内，较之野生株ST1792， ST1792-Lux在生长能力和不同培养条件下成膜能力（ tTSB ＝1.16，1.29；t TSBG＝0.38，0.31；P均＞0.05）方面差异无统计学意义。 IVIS检测示，术后每个时间点（1、3、7和14 d），实验组较对照组的左膝平均生物发光强度均明显增高（t＝9.13，10.72，14.48，7.46；P均＜0.05）。结论本研究成功建立了稳定生物发光临床株S．aureus PJI动物模型，其稳定性高、重复性好，可用于临床株S．aureus PJI的致病分子机制和各种干预措施有效性的体内研究。
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转座子piggyBac介导的HSV-tk基因在妇科恶性肿瘤细胞中长期稳定表达的研究
目的 研究piggyBac(PB)转座子介导转移外源基因HSV-tk在多种妇科恶性肿瘤细胞中的表达情况,探讨其作为一种可整合的非病毒载体在肿瘤基因治疗中的应用价值.方法 通过PCR技术扩增HSV-tk基因的编码区,定向克隆至PB表达载体PB[Act-RFP]DS,经酶切、测序鉴定为重组载体PB[Act-RFP,HSV-tk]DS(pPB/TK).联合3种小同的转染试剂FuGENE HD、jetPEI及lipofectamine 2000,分别将pPB/TK转染入4种常见的妇科恶性肿瘤细胞株HeLa、JEG-3、SKOV3和HEC-1B.转染后以mRFP1为报告基因,经荧光显微镜观察和流式细胞仪分析转染效率;逆转录(RT)-PCR技术检测HSV-tk和mRFP1基因的表达;四甲基偶氮唑蓝实验测定不同浓度的更昔洛韦(GCV)对转染后细胞的杀伤作用.转染后细胞经流式细胞仪分选,极限稀释单克隆培养建立稳定转染株,并以反向PCR技术确定转座子插入基因组的位点.结果 (1)成功构建重组载体pPB/TK.(2)在3种转染试剂的辅助下,pPB/TK均可有效转染入HeLa、HEC-1B、SKOV3和JEG-3细胞;不同转染试剂辅助下pPB/TK在同种细胞中的转染效率各不相同,在HeLa细胞中,FuGENE HD的转染效率[(78.7±9.2)%]高于lipofectamine 2000[(54.1±11.4)%]和jetPEI][(46.5±7.4)%],分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05);同一转染试剂辅助下pPB/TK在不同细胞中的转染效率也不相同,以FuGENE HD为转染试剂,pPB/TK在HeLa、JEG-3和SKOV3细胞中的转染效率分别为(78.7 ±9.2)%、(74.4±8.9)%和(83.2±9.7)%,高于HEC-1B细胞的(39.5±8.7)%,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).(3)RT-PCR结果显示,4种细胞均有HSV-tk和mRFP1基因mRNA的表达.(4)GCV对转染有pPB/TK的HeLa、JEG-3、SKOV3和HEC-1B细胞的半数抑制浓度分别为1.29、3.35、0.09和13.28 μg/ml.10μg/ml GCV对转染有pPB/TK的SKOV3细胞抑制率高于单独转染pORF-HSVtk者,细胞抑制率分别为(86±9)%和(52±12)%,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05).(5)稳定转染株在转染后3个月仍可观察到mRFP1表达,并可榆测纠基因组中有TTAA位点的插入整合.结论 PB转座子可介导外源基因在多种妇科恶性肿瘤细胞中的长期稳定表达,有望为肿瘤基因治疗提供更为安全有效的转基因技术平台.
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转突变型淀粉样蛋白前体双荧光融合基因阿尔茨海默病小鼠模型的建立及初步鉴定
目的 探索建立转突变型淀粉样蛋白前体(APP)双荧光融合基因(CFP-54 bp-YFP-C99)转基因小鼠模型的可行性和基因整合效率.方法 采用显微注射法,将构建的突变型APP双荧光融合基因注入昆明小白鼠的受精卵,获取子代鼠,通过聚合酶链反应(PCR)方法初步鉴定基因的整合情况,以获得阳性鼠.结果 注射昆明小白鼠受精卵共2202枚,移植1806枚.受体鼠56只,怀孕鼠13只,共生产52只子代鼠,其中存活32只.PCR初步检查整合有突变型APP双荧光融合基因的阳性鼠2只,均为活鼠.移植鼠的总怀孕率为23.2%(13/56),突变型APP双荧光融合基因的整合效率为3.9%(2/52).结论 显微注射法建立转突变型APP双荧光融合基因的阿尔茨海默病小鼠模型是可行的,但转基因效率较低.
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绿色荧光蛋白和胸苷激酶基因共表达的慢病毒载体的构建及表达
目的 构建人巨细胞病毒广谱启动子(CMV)调控的增强绿色荧光蛋白(EGFP)和自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)共表达的慢病毒载体,获得高效的慢病毒转基因平台.方法 采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接等方法,将HSV-tk基因插入慢病毒载体Lenti-ires-EGFP中,构建广谱启动子CMV调控的HSV-tk和EGFP共表达的慢病毒载体(Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP).构建成功后的慢病毒三质粒系统通过磷酸钙沉淀法转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞-293T,28 h后收集病毒颗粒,测定病毒滴度,并感染人晶状体上皮细胞株、视网膜母细胞瘤细胞株、神经母细胞株、Hela细胞等,荧光显微镜下观察EGFP的表达.RT-PCR检测HSV-tk与EGFP的表达.结果 构建的慢病毒载体Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP能高效转染各类细胞并持续稳定的表达.RT-PCR的结果表明Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP感染细胞能共表达HSV-tk和EGFP,利用该慢病毒载体系统转染人晶状体上皮细胞株时,在复合感染度(MOI)为100时,转染效率接近100%,且传代培养6个月后仍能维持高转染效率.结论 成功构建了能转染多种细胞的TK自杀基因和EGFP共表达的慢病毒载体,为眼科自杀基因治疗的实验研究提供高效稳定的转基因技术平台.
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慢病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷体系抑制人晶状体上皮细胞的研究
目的 探讨慢病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷体系(HSV-tk/GCV)对人晶状体上皮细胞(LECs)系的杀伤效应的机制.方法 HSV-tk基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因共表达的慢病毒感染细胞为试验组,仅表达EGFP的慢病毒感染细胞和正常细胞为对照组.流式细胞仪检测病毒的转染效率,荧光显微镜观察及基因组PCR和RT-PCR检测基因在LECs内表达,DNA ladder和电镜观察该系统对LECs的杀伤作用,检测HSV-tk/GCV系统的浓度时间依赖性和旁观者效应.结果 HSV-tk整合入LECs并高效表达.10～25μg/ml的GCV能明显诱导转染HSV-tk的细胞凋亡或坏死,且随GCV浓度升高和作用时间延长效应增强,且存在明显的旁观者效应,而对照组细胞无显著改变.当GCV浓度＞25μg/ml,对照组细胞的增殖也被显著抑制.结论 GCV可高效杀伤表达HSV-tk的LECs,且旁观者效应显著增强了HSV-tk/GCV系统的杀伤效果.HSV-tk和EGFP共表达的慢病毒载体能高效稳定转染LECs.(中华眼科杂志,2007,43:810-816)
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绿色荧光蛋白标记的视网膜母细胞瘤原位移植瘤模型
目的应用绿色荧光蛋白(GFP)基因标记人类视网膜母细胞瘤(RB)细胞,建立新型裸鼠原位移植瘤模型,探讨RB的生长和转移特征.方法利用脂质体将GFP真核表达质粒pEGFP-N1转入人类RB细胞(HXO-RB44),新霉素、荧光显微镜及流式细胞仪筛选稳定表达GFP的细胞克隆.30(60只眼)裸鼠每只眼视网膜下腔均注入2 μl细胞密度为(4.5～5.5)×108个细胞/ml的RB细胞悬液.术后利用带荧光的体视镜连续观察肿瘤生长情况,于不同时间点处死动物,荧光显微镜观察视神经、颅底、肺、肝、肾的肿瘤转移情况.结果术后34～37 d可观察到肿瘤生长至眼外,并可观察到肿瘤沿视神经向颅内转移,肿瘤细胞沿视神经鞘、睫状后长动脉浸润生长;移植瘤病理组织学表现类似于人类RB肿瘤;免疫组化染色肿瘤细胞GFP呈阳性表达.结论经GFP基因标记的人类RB细胞裸鼠视网膜下腔移植建立的RB移植瘤模型,为研究自然状态下RB肿瘤的生长和转移提供了新的工具.(中华眼科杂志,2004,40:225-228)
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脂质体介导色素上皮衍生因子-绿色荧光蛋白质粒转染大鼠视网膜细胞及其转染途径的实验研究
目的 观察表达质粒色素上皮衍生因子(PEDF)-绿色荧光蛋白(GFP)以脂质体介导转染入BN大鼠视网膜组织的表达及定位,探索合适的基因治疗给药方法.方法 将脂质体包裹的重组表达质粒PEDF-GFP分别经玻璃体注射和视网膜下注射的途径转染至BN大鼠眼内,于一定时间内分别用荧光显微镜观察GFP表达情况,用RT-PCR方法检测PEDF表达情况.结果 (1)BN大鼠视网膜下注射脂质体包裹的重组表达质粒PEDF-GFP后1 d即可见在荧光显微镜下观察到在注射点周围明显的绿色荧光蛋白分布于视网膜全层包括RPE细胞层,第2、3周荧光强度比第1周增强,荧光范围也有所扩大,可以持续表达4周.RT-PCR结果证实PEDF mRNA表达明显较对照组增强.(2)经玻璃体腔注射脂质体包裹的重组表达质粒PEDF-GFP后第1天BN大鼠的视网膜和RPE细胞亦可见绿色荧光蛋白表达,且分布更均匀,范围更广.第1、2周表达明显增强,到第4周仍有表达.RT-PCR结果也证实PEDF mRNA表达明显较对照组增强.结论 阳离子脂质体可以成功介导PEDF-GFP基因转染至BN大鼠的视网膜组织、RPE细胞中,并能够持续表达.视网膜下注射和玻璃体腔注射均为有效的转染途径.本研究为视网膜,脉络膜新生血管性疾病的基因治疗奠定了基础.
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荧光素酶光成像实时监测诱导凋亡配体基因治疗裸鼠肺癌A549细胞移植瘤的实验研究
目的 应用人肿瘤坏死因子相关的诱导凋亡配体( hTRAIL)基因和萤火虫荧光素酶(luc)基因的腺病毒双表达载体(ad-hTRAIL-luc),以luc为报告基因,活体内监测hTRAIL基因的表达及作用.方法 皮下接种法建立肺癌A549细胞裸鼠移植瘤模型,瘤内多点注射腺病毒载体ad-luc-hTRAIL、ad-hTRAIL、ad-luc.对照组注射磷酸盐缓冲液(PBS).于注射后4、7、10、14、21、28 d动态测量各组肿瘤大小,并利用高敏感、超低温(CCD)照相机进行活体生物发光成像检测luc活性,然后处死动物,免疫组织化学(简称免疫组化)法检测各组hTRAIL蛋白表达情况,并进行免疫组化评分(IHS)；TUNEL法检测各组肿瘤细胞凋亡情况,并计算凋亡率.统计分析组间比较采用方差分析,两样本比较采用配对t检验.对ad-luc-hTRAIL组的发光光子数、免疫组化评分、凋亡率3种结果进行线性相关分析.结果 ad-luc-hTRAIL与ad-hTRAIL组肿瘤生长速度明显较PBS组缓慢(t=2.71、2.72,P＜0.05),28 d后各组肿瘤体积分别为(208.4 ±42.3)、(181.5 ±23.9)、(427.0±59.3)mm3,ad-luc组与PBS组肿瘤生长差异无统计学意义(t=2.07,P＞0.05).ad-luc-hTRAIL组luc活性于治疗后第7天达高峰(1.37±1.04)后快速下降.ad-luc-hTRAIL与ad-hTRAIL 2组在注射载体后第7天hTRAIL表达及肿瘤细胞凋亡率达高峰,IHS峰值分别为6.25 ±2.06和6.5 ±2.89,肿瘤细胞凋亡率峰值分别为(60.75±8.06)％和(61.50±8.47)％.ad-luc-hTRAIL组luc表达量(绝对光子数)与IHS、肿瘤细胞凋亡率三者间均呈线性正相关(r光子数/IHs=0.942,r光子数/凋亡率=0.842,rIHs/凋亡率=0.887,P值均＜0.05).结论 目的基因可以有效地通过ad-luc-hTRAIL转导入裸鼠肺癌A549细胞移植瘤内并高水平表达,发挥生长抑制和促凋亡作用,体外CCD照相机观察luc的表达可实时监测hTRAIL基因的表达,反映hTRAIL基因治疗肿瘤的疗效.
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起搏通道HCN2基因和增强型绿色荧光蛋白双基因载体在人胚胎肾细胞的共转染表达
背景:获得高效、安全的基因转移载体是目前研究的目标.目的:构建携带起搏通道(HCN2)基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双基因真核表达载体,并观察在人胚胎肾细胞(HEK293)表达情况.设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2006-0712007-08在全军重点实验室解放军总医院老年心血管病研究所完成.材料:质粒pIRES-EGFP为Clontech公司产品,PCI-HCN2质粒,含有人全长HCN2基因为解放军总医院老年心血管病研究所惠赠.方法:利用脑炎心肌炎病毒的内部核糖进入位点(IRES),构建HCN2与增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体pIRES-EGFP-HCN2.将脂质体和plRES-EGFP-HCN2基因混合后转染人胚胎肾细胞,用反转录-聚合酶链反应检测HCN2 mRNA表达.主要观察指标:①重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2的构建.②起捧通道基因HCN2cDNA的克隆.③增强型绿色荧光蛋白表达的荧光检测.结果:构建的pIRES-EGFP-HCN2在转染8 h后开始表达,48 h达到高.经酶切鉴定含有增强型绿色荧光蛋白和HCN2基因.结论:实验成功地构建了pIRES-EGFP-HCN2真核共表达载体,具有HCN2、增强型绿色荧光蛋白的双重活性,IRES能够介导外源基因HCN2在人胚胎肾细胞表达.
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鼠尾静脉流体力学转染技术对绿色荧光蛋白表达质粒器官靶向分布的影响
目的:观察流体力学尾静脉注射对绿色荧光蛋白基因器官靶向性的影响,为今后质粒载体的基因治疗和功能研究寻找潜在的靶器官.方法:实验于2005-12/2006-04在江西省分子医学重点实验室完成.选用健康雄性昆明鼠40只,将32只小鼠按随机数字表法分为流体力学注射和常规注射两大组,每大组再分为转染组和对照组两个小组(n=8),并设正常对照组(n=8).①流体力学转染组将100 μg/只绿色荧光蛋白表达质粒溶液2 mL在5 s内快速注入尾静脉;对照组仅在5 s内注入林格氏液2 mL.②常规注射组则将2 mL林格氏液或绿色荧光蛋白表达质粒溶液在30 s左右注入尾静脉.注射结束后24 h采集各组小鼠血清检测转氨酶,并采集肝、脾、心、肾、肺和脑组织进行冰冻切片,部分肝组织采用多聚甲醛固定后切片,荧光显微镜下观察.结果:40只小鼠全部进入结果分析,无脱失.①流体力学注射组和常规注射组小鼠血清转氨酶与正常对照组比较差异均无显著性意义(P＞0.05).②常规尾静脉注射引起少数肾小球细胞表达绿色荧光蛋白,而肝、脾、心、肺及脑等组织未见明显绿色荧光蛋白表达.③流体力学注射引起肝内绿色荧光蛋白高水平表达,肝细胞表达率接近45%,其他组织则无绿色荧光蛋白表达.结论:流体力学方法是肝靶向性的活体基因转染方法,绿色荧光蛋白可作为该方法进行目的基因研究的一个可靠和方便的示踪剂.
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外源性软骨细胞在组织工程化软骨组织形成中的作用
目的:观察腺病毒介导的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记软骨组织工程种子细胞的可行性,探讨外源性软骨细胞在组织工程化软骨组织形成中的作用.方法:实验于2002-01/08在解放军第一军医大学实验室完成.腺病毒GFP表达载体以巨细胞病毒(CMV)为启动子转染体外培养软骨细胞作为种子细胞与poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)(PHBHH)复合后植入兔体内,术后一定时间取材,确定组织工程化组织的表型,观察GFP的表达.结果:以CMV为启动子的腺病毒GFP载体能有效转染体外培养软骨细胞,转染效率达53.66%.携带GFP的软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞,6周和12周形成的组织工程化组织中检测到GFP表达,经苏木精-伊红染色、免疫组织化学检查和特殊染色确定获取的组织为软骨组织,且与未转染软骨细胞形成的组织工程化软骨组织形态学一致.结论:腺病毒介导的GFP能有效转染体外培养软骨细胞,外源性软骨细胞是体内组织工程化软骨组织形成的源细胞.
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绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞定向分化的能力
目的:研究绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)体外扩增及其向内皮细胞定向分化能力,为血管组织工程在体研究提供实验依据.方法:实验于2003-10/2004-10在第三军医大学基础部解剖学教研室完成.无菌条件下采集绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓,用直接贴壁法获得小鼠MSCs,然后以血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)进行诱导分化,后对扩增的细胞特征进行八因子(Willbrandfactor,vWF)免疫荧光鉴定观察.结果:MSCs每扩增一代,细胞数量增加4～8倍,7.0×103个原代MSCs体外扩增3代即获得1.4×108个细胞.在70%～80%融合时呈现"铺路石"样形态,说明绿色荧光蛋白转基因小鼠MSCs在体外的培养扩增条件与一般小鼠相同.添加VEGF诱导2周后,以免疫荧光法检测细胞的vWF的表达发现,诱导组的vWF呈阳性表达,对照组vWF表达呈阴性.结论:绿色荧光蛋白转基因小鼠MSCs在体外的培养扩增能力强,在VEGF作用下可以向内皮细胞转化.
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以红色及绿色荧光蛋白为标记基因的血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2真核表达载体的构建及其在293-T细胞中的共表达
背景:血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白具有协同促进血管生成的作用.目的:构建在真核细胞中表达人血管内皮生长因子165的红色荧光蛋白表达载体和携带人骨形态发生蛋白2的绿色荧光蛋白表达载体,共转染真核细胞以研究血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在293-T细胞内的表达和定位.设计:随机对照实验.单位:解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所国家重点实验室.材料:实验于2002-09/2004-03在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所国家重点实验室完成.pCDNA3.1(+)/骨形态发生蛋白2由美国UCLA大学Dr.Bostrom惠赠;pDsRed1-N1由Professor Roger Y.Tsien,University of California,San Diego,USA惠赠.pUC18/血管内皮细胞生长因子165,293-T cells由本实验室保存.方法:根据已知的人血管内皮生长因子165序列,设计在目的片段两端分别携带酶切位点的两条引物,用聚合酶链反应从质粒pUC18/血管内皮生长因子165中扩增出去除终止密码子的人血管内皮生长因子165片段,定向克隆至含报告基因的质粒pDsRed1-N1中,构建重组质粒pDsVEGF165Red1-N1;同时,构建pIRES2-骨形态发生蛋白2-加强型绿色荧光蛋白表达载体.以DOTAP为介导,将重组质粒共转染293-T细胞,48 h后用激光共聚焦显微镜检测报告基因红色荧光蛋白和加强型绿色荧光蛋白的表达,使用反转录聚合酶链反应及免疫印迹方法检测血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在细胞内表达.主要观察指标:质粒的酶切鉴定及重组质粒在293-T细胞中mRNA及蛋白水平的表达.结果:重组质粒经酶切、聚合酶链反应和DNA序列测定证明构建正确,目的基因在293-T细胞中在mRNA及蛋白水平获得表达.激光共聚焦显微镜观察到红色荧光蛋白和加强型绿色荧光蛋白在细胞内共定位的情况.结论:成功构建pDsVEGF165Red1-N1和pIRES2-骨形态发生蛋白2-加强型绿色荧光蛋白2种含报告基因的真核表达载体,两者共转染后能在真核细胞中表达,为研究血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在细胞内的相互作用提供了一个重要而方便的工具.
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重组人质粒pEGFP-人内皮一氧化氮合酶的构建
目的:构建含有增强绿色荧光蛋白报道基因的人内皮一氧化氮合酶重组质粒,为细胞转染提供实验依据.方法:实验于2005-05/10在首都医科大学宣武医院完成.用EcoRⅠ酶切pBluescriptⅡSK-人内皮一氧化氮合酶质粒,获得人内皮一氧化氮合酶基因,设计引物进行聚合酶链反应扩增.将人内皮一氧化氮合酶与pMD 18-T simple平滑载体连接后,行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,回收人内皮一氧化氮合酶,然后将其与经过酶切处理的含有增强绿色荧光蛋白报道基因的载体pEGFP-C1进行连接,形成8.4 kb的质粒,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切进行电泳筛选、鉴定和测序.结果:①目的基因片段人内皮一氧化氮合酶cDNA的获得:pBluescriptⅡSK-人内皮一氧化氮合酶质粒经EcoRⅠ酶切后,电泳可见3 kb及3.7 kb处各出现一条条带,与质粒图谱所示相符,证明质粒正确.加人上下游引物行聚合酶链反应扩增后,电泳可见3.7 kb处出现一条条带,证明人内皮一氧化氮合酶cDNA的获取成功.②人内皮一氧化氮合酶cDNA的酶切处理:人内皮一氧化氮合酶与pMD 18-T simple平滑载体连接后,EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,电泳分析可见3.7 kb和2.7 kb处各出现一条条带,证明两者连接成功.③pEGFP-人内皮一氧化氮合酶质粒的筛选:载体pEGFP-C1与人内皮一氧化氮合酶cDNA的连接后,EcoRⅠ单酶切电泳可见8.4 kb处出现一条条带,再用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,电泳可见4.7 kb和3.7 kb处各出现一条条带,证明连接正确.④pEGFP-人内皮一氧化氮合酶质粒的序列测定:序列测定结果与pEGFP-C1插入点序列及目的基因片段人内皮一氧化氮合酶cDNA两端序列对比相同,证明重组质粒构建成功.结论:pEGFP-人内皮一氧化氮合酶重组质粒的成功构建,可用于细胞转染,为人内皮一氧化氮合酶基因转移治疗在心血管疾病中的应用提供实验基础.
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构建永生化人肝细胞系人端粒酶反转录酶真核表达质粒
目的:构建人端粒酶反转录酶真核表达质粒,为人端粒酶反转录酶稳定转染细胞提供简单、快速的检测方法.方法:实验于2005-06/2006-03在解放军第三○二医院病毒研究室完成.①聚合酶链反应扩增人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白基因.②利用基因重组技术构建真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT,筛选阳性克隆进行双酶切、聚合酶链反应和序列测定.③转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白的表达情况.结果:①聚合酶链反应扩增目的基因:电泳显示人端粒酶反转录酶基因的聚合酶链反应产物在3.5kb处有特异性目的条带,绿色荧光蛋白基因的聚合酶链反应产物在750 bp处显示特异性目的条带.②质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的构建和鉴定结果:双酶切、聚合酶链反应鉴定和测序结果与预期完全相符.③转染HepG2细胞结果:荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白主要分布在细胞核内.结论:①初步验证所构建的真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的正确性.两种质粒可使转染细胞同时表达人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白,通过观察绿色荧光蛋白的表达对转染效率和结果进行及时、快捷的观察.②重组真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的构建成功,为人端粒酶反转录酶转染细胞提供简洁、快速、实时的检测方法,并为建立永生化人肝细胞系奠定基础.
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共表达红光荧光蛋白及发夹RNA载体的构建及鉴定
目的:构建共表达红光荧光蛋白及短发夹状RNA的重组真核载体.方法:利用亚克隆、T-A克隆和PCR技术构建pcDNA3.0/DsRed-U6-shGFR及pcDNA3.0/DsRed-U6重组载体.结果:成功构建上述两种真核重组表达载体.结论:这种共表达载体的构建为进一步利用RNAi技术研究真核细胞基因功能奠定了基础.
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体内生物发光成像在肿瘤转移研究中的应用
体内生物发光成像(in vivo bioluminescence imaging)在生物医学研究中是一个强有力的工具,能够非侵入性、定量及实时动态监测活体动物体内的生物学过程.一个完整的生物发光成像过程,包括构建荧光素酶(luciferase)报告基因,建立稳定表达荧光素酶的细胞,再将此细胞移植到动物体内,进而可以在体外通过敏感的光学检测系统检测到动物体内特定部位所发出的光.生物发光成像能够示踪特定细胞(肿瘤细胞、免疫细胞、干细胞和细菌等)在体内的迁移,反映特定基因的时空特异性表达以及蛋白质间相互作用等.本文主要就生物发光成像的原理、特点及其在肿瘤转移相关研究中的应用作一概述.
